Başlamak için, biyogüvenlik kabininin çalışma platformunda yeni hazırlanmış genleşme ortamını düzenleyin, sterilize proteinaz ve antibiyotik solüsyonlarını filtreleyin ve sterilize edilmiş cerrahi aletleri yerleştirin. 100 milimetrelik kültür kaplarına ve 24 milimetrelik trans kuyularına sıçan kuyruğu kollajeni ekleyin. Sterilizasyon için bulaşıkları ultraviyole ışık altında gece boyunca açık bırakın.
Ötenazi fareyi sterilizasyon için% 75 etanole batırın. Burnu ve ağzı batırmayın. Cerrahi makas ve forseps kullanarak, epidermisi alt çeneden farenin karın boşluğuna kadar kesin ve açın.
Başka bir cerrahi makas ve forseps seti kullanarak, her iki taraftaki tiroid bezlerini ayırın ve trakea, çevredeki kas dokusu ve yemek borusu arasındaki bağlantıları çıkarın. Daha sonra, göğsü dikkatlice kesin ve göğüs boşluğuna daha derine inmek için forseps kullanın. Tüm akciğeri çıkarın ve trakeanın sonunu bulun.
Trakeayı tiroid kıkırdağından trakeal bronş dalına kadar kesin ve dört antibiyotik içeren soğuk genleşme öncesi bir ortama koyun. Buza yerleştirmeden önce trakea yüzeyinden mümkün olduğunca fazla kanı durulamak için tüpü sallayın. Şimdi trakeayı dört antibiyotik içeren soğuk PBS'ye aktarın.
Cerrahi makas ve forseps kullanarak, trakea yüzeyindeki pıhtıları ve diğer dokuları çıkarın ve bunları bir santimetre kare boyutunda kesin. Trakeal dokuyu proteinaz çözeltisi içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. 40 dakika sonra, tüpü birkaç kez sallayın ve kalan dokuları çıkarmak için 40 mikronluk bir hücre süzgeci kullanın.
Kıyılmış trakeayı beş mililitre genleşme ortamı olan bir süzgeç üzerinde durulayın. Trakeal süspansiyonu 400 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve peleti sekiz mililitre genleşme ortamında yeniden süspanse edin. Tripan mavisi ve hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.
100 milimetrelik bir tabak üzerinde plaka P0 hücre süspansiyonu, sıçan kuyruğu kollajeni ile önceden kaplanmıştır. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile kültürleyin.
