Birincil murin hava yolu epitel hücreleri %80'e ulaştığında, hücreleri sıçan kuyruğu kollajeni ile kaplanmış bir cam slayt üzerine oturtun. Ardından, hücreleri 12 saat boyunca sabitlemek için paraformaldehit ekleyin. Slaytı PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve bir saat boyunca PBS'de% 3 sığır serum albümini ve% 0.1 Triton X-100 ile inkübe edin.
Slaytın üzerine bir ila 500 oranında bir seyreltmede anti-pan sitokeratin antikoru ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, karanlıkta iki saat boyunca bir ila 1.000 seyreltmede ikincil antikor ile inkübe etmeden önce, slaytı her biri beş dakika boyunca PBS çözeltisi ile üç kez yıkayın. Slaytı PBS ile yıkadıktan sonra, bir ila 1.000 oranında seyreltilerek DAPI ekleyin ve 15 dakika inkübe edin.
Slaytı PBS ile beş dakika boyunca bir kez yıkayın. İfade modellerini pozitif bir kontrol ve negatif bir kontrolle karşılaştırmak için slaydı bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin Ayırma ve santrifüjlemeden sonra, P2 faz hücrelerini uygun bir hacimde genleşme ortamında yeniden askıya alın. Transwell polikarbonat membran ekinin apikal haznesine bir mililitre hücre süspansiyonu pipetleyin.
Transwell'in bazal bölmesine 1,5 mililitre proliferasyon ortamı ekleyin. Birleşme noktasına ulaşılana kadar hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Aşağıdaki bileşenleri kullanarak 50 mililitre tam farklılaşma ortamı hazırlayın.
Bir sigarayı 12,5 mililitre farklılaştırma ortamından geçirin ve ardından sigara dumanı ekstraktı veya CSE hazırlamak için 0,22 mikronluk bir dökme filtreden süzün. Deneyler ve CSE partileri arasında standardizasyonu sağlamak için, bir spektrofotometrede 320 nanometrede absorbansı ölçün. Ardından, genleşme ortamını Transwells'in apikal ve bazal odasından çıkarın.
Primer murin hava yolu epitel hücrelerini 28 gün boyunca uyarmak için uygun bir CSE konsantrasyonu içeren bir farklılaşma ortamı ekleyin. İnkübasyon sırasında, apikal odayı haftada iki kez PBS ile yıkayın ve bazal odadaki ortamı CSE içeren taze hazırlanmış farklılaşma ortamı ile değiştirin. Murin hava yolu epitel hücreleri, 28 gün içinde bir hava sıvısı arayüzünde başarılı bir şekilde farklılaştı.
Kirpikli ve goblet hücrelerin varlığı, sırasıyla silia markörü, asetillenmiş alfa tübülin ve goblet hücre markörü müsin 5AC'nin immünofloresan testi ile gösterildi. Değişen CSE konsantrasyonları ile 24 saatlik hücre canlılığı, konsantrasyon %6'dan yüksek olduğunda epitel hücrelerinin azaldığını gösterdi Uzun süreli stimülasyon altında hücre aktivitesi, %2, %4 ve %6 CSE konsantrasyonları ile önemli bir hücre ölümü göstermedi. Ancak transmembran direncinde ve pul pul dökülmüş hücrelerde değişiklikler kaydedildi.
Ek olarak, murin hava yolu epitel hücre kültürleri kronik olarak CSE'ye maruz kaldığında farklılaşmış hücrelerde ve siliyer hücrelerde genel bir azalma kaydedilmiştir.
