Başlamak için, bir hücre kültürü davlumbazında, hasat edilen lipoaspiratı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne ekleyin. Lipoaspiratı steril 20 mililitrelik Luer kilitli şırıngaya aktarın. Ardından şırıngaya 1,4 milimetrelik bir konektör takın.
Şimdi konektörün karşı tarafına ikinci bir 20 mililitrelik Luer kilit şırıngası takın. Yağ dokusunu bir şırıngadan diğerine yaklaşık 30 kez itin. Daha sonra emülsifiye edilmiş yağı 50 mililitrelik taze bir santrifüj tüpüne aktarın.
Yağı 500 G'de 10 dakika santrifüj edin. Ardından yağlı üst tabakayı atın. Ayrılmış stromal vasküler tabakayı içeren merkezi saflaştırılmış tabakayı toplayın ve 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
Şimdi santrifüj tüpünü 40 mililitre işaretine kadar takviye edilmiş DMEM ile doldurun. Tüpü tekrar 500 G'de beş dakika santrifüjleyin. Elde edilen mSVF katmanını toplayın ve 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
Steril 1.5 mililitrelik bir tüpe, izole edilmiş stromal vasküler fraksiyonun 100 mikrolitresini pipetleyin. Buna 10 mikrolitre trombin ekleyin, ardından 10 mikrolitre kalsiyum klorür pipetleyin. Son olarak, karışıma 70 mikrolitre traneksamik asit ekleyin.
Yeni bir pipet ucuyla, uygulamadan kısa bir süre önce tüpe 10 mikrolitre fibrinojen ekleyin. mSVF hidrojel karışımının polimerizasyonundan sonra, analitik amaçlar için 200 mikrolitre hidrojeli 12 oyuklu bir plakaya pipetleyin. Şimdi 100 mikrolitre fibrin hidrojeli bir kuyuya ve negatif bir kontrole ekleyin.
12 oyuklu plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra her bir oyuğa bir mililitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin. 12 oyuklu plakayı dört saat boyunca tekrar inkübatöre yerleştirin.
24 saat boyunca tekrar inkübe etmeden önce her oyuğa bir mililitre resazurin ekleyin. Resazorin örneklerini 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin. Ertesi gün, ilk floresan yoğunluğunu ölçmek için bir hücre görüntüleme çok modlu mikroplaka okuyucu kullanın.
Bir, üçüncü ve yedinci günlerde histolojik analiz için, fibrin hidrojeli 0.5 mililitre% 4 paraformaldehit içinde inkübe edin. Şimdi plakaya% 1 PBS ekleyin ve dört santigrat derecede saklayın. Resazorin testi, vasküler fraksiyonun ve hidrojelin in vitro hücre canlılıklarını ölçmek için yapıldı.
Vasküler fraksiyon, üçüncü günde canlılıkta azalma gösterirken, mSVF-fibrin hidrojel kombinasyonu taban çizgisine yakın kaldı. Yedinci günde, mSVF'nin canlılığı düşerken, mSVF-fibrin hidrojel kombinasyonu arttı. Histolojik analiz, üçüncü ve yedinci günlerde hücre çekirdeği sayısında bir azalma göstermedi.
Fibrin hidrojel, eşit olarak dağılmış görünür hücre kümeleri ile minimum bozulma gösterdi.
