Başlamak için, doku ekstrakte edilen DNA'nın istenen bölgesini amplifiye etmek için polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR gerçekleştirin. Sıralama amplifikasyon enzimi ana karışımını, tamponu ve çift damıtılmış suyu oda sıcaklığına getirin ve anında döndürün. Tüpleri dizileme için hazırladıktan sonra, PCR tüpünü amplifikasyon için önceden ayarlanmış PCR cihazına yerleştirin.
Daha sonra ürünü PCR cihazından çıkarın ve reaksiyon ürünlerini ışıktan koruyarak buzdolabında saklayın. Manyetik boncukları iyice girdaplayın. 96 oyuklu plakaya 10 mikrolitre manyetik boncuk ve 40 mikrolitre% 80 etanol ekleyin ve plakayı bir filmle kapatın.
Boncukları tamamen askıya almak ve karıştırmak için 96 oyuklu plakayı 10 saniye boyunca bir girdap çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Ardından plakayı yatay bir osilatör üzerinde bir lastik bantla sabitleyin ve maksimum ayarda üç ila beş dakika titreştirin. Ardından, PCR plakasını manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve sıkıca bastırıldığından emin olun.
Statik adsorpsiyon için standı üç dakika boyunca dört santigrat derecede tutun. Boncuklar adsorbe edildikten sonra tavan filmini çıkarın ve atık sıvıyı boşaltın. Boncukları 40 mikrolitre% 80 etanol ile iki kez durulayın.
Atık sıvıyı döktükten sonra, plakayı emici kağıda yerleştirin ve nazikçe kurulayın. Emici kağıdı manyetik plakalı bir santrifüje yerleştirin ve kısa bir süre 120 g'da döndürün. Alkolü çıkardıktan sonra, boncukları tamamen kurutmak için plakayı 60 santigrat derecede üç ila beş dakika fırına koyun.
Daha sonra, plakaya 40 mikrolitre saf su ekleyin ve bir filmle kapatın. Bir girdap çalkalayıcı üzerinde üç ila beş saniye çalkalayın ve plakayı yatay bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Sabitleyin ve saflaştırılmış sıralama ürününü çözmek için plakanın üç ila beş dakika sallanmasına izin verin.
Son olarak, çözünmüş dizileme ürününü 180 g'da döndürün ve ürünü kılcal elektroforez kullanarak genomik analiz için kullanın. Bu yöntem, bilinen RHOA G17V mutasyonunu ve yukarı ve aşağı akış primerlerinin amplifikasyon aralığındaki diğer düşük frekanslı mutasyonları tespit edebilir. IDH2 ve JAK1 olmak üzere iki ek gendeki mutasyonlar da bu yöntem kullanılarak doğru bir şekilde analiz edildi.
