Endometriyal Dokularda Uterin NK Hücre Alt Tip Analizi için Multipleks İmmünohistokimya

Başlamak için, multipleks immünohistokimya için bir cam slayt üzerinde insan endometriyal doku kesitini alın ve doku kesitlerini iki saat boyunca 60 santigrat derecede pişirin. Ardından, slaytı mum alma, hidrasyon ve fiksasyon için uygun solüsyonlara sırayla daldırın. Her antikor için 200 mililitre ilgili AR6 veya AR9 tamponunu ısıya dayanıklı bir antijen alma kasetine ekleyin.

Bölümleri antijen alma tamponuna yerleştirdikten sonra, kaynayana kadar yüksek güçte bir mikrodalgada ısıtın. Kaseti gevşek bir şekilde kapatın ve 15 dakika boyunca düşük güçte ısıtın. Slayt soğuduktan sonra, çift damıtılmış su ve ardından PBST ile durulayın.

Daha sonra fazla çözeltiyi emici kağıtla çıkarın ve hidrofobik bir bariyer kalemle dokunun etrafına tam bir daire çizin. Daha sonra bölümleri oda sıcaklığında% 3 hidrojen peroksit ile sekiz dakika inkübe edin. Daha sonra, bir engelleme çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Bloke edici çözeltiyi çıkardıktan sonra, 1x antikor seyrelticisinde 1 ila 1000 seyreltmede her slayta 150 mikrolitre birinci birincil antikor olan CD49a'yı uygulayın. İkincil antikoru uygulamadan önce, emici kağıt kullanarak fazla nemi alın. Her slayta 1x anti-fare ve tavşan yaban turpu peroksidaz ikincil antikorundan dört ila beş damla ekleyin.

Daha sonra tiramid sinyal amplifikasyonunu veya TSA boyasını amplifikasyon seyrelticisinde 1 ila 100 kez seyreltin. Ve her slayta bu seyreltilmiş çözeltiden 150 mikrolitre ekleyin ve inkübe edin. Bağlanmamış floroforları ortadan kaldırmak için, bölümleri 200 mililitre AR6 tamponunda ısıya dayanıklı bir kaset içinde bir mikrodalgada iki dakika kaynatın.

Ardından mikrodalgayı 15 dakika boyunca yüksek güçten düşük güce çevirin. PBST içinde damla damla seyreltilmiş 150 mikrolitre DAPI çalışma solüsyonu ekleyin. Bölümleri yaklaşık 30 dakika boyunca karanlık bir alanda tamamen kurutun.

Söndürme önleyici floresan tutucudan tek bir damla uygulayın ve dikkatlice bir lamel yerleştirin.