Başlamak için, RapR-Shp2 eksprese eden HEK293T hücrelerini elde edin ve Protein G-Sepfaroz ile immünopresipitasyon gerçekleştirin. İmmünopresipitasyondan sonra, sefarozu her biri 0.5 mililitre lizis tamponu ile iki kez yıkayın, ardından 0.5 mililitre yıkama tamponu uygulayın. Son dönüşten sonra mümkün olduğunca fazla tamponu çıkarın.
Daha sonra, bir mikromolar rapamisin olan veya olmayan her numuneye imidazol tampon karışımında 40 mikrolitre fosfo-paxillin ekleyin. Tüpü hafifçe vurun ve hemen 32 santigrat derecede 40 dakika boyunca ısıtma çalkalayıcıya yerleştirin. Numunenin tam olarak çalkalanmasını sağlamak için ısıtma çalkalayıcıyı dakikada 1000 devire ayarlayın.
Reaksiyonu durdurmak için, her numuneye 40 mikrolitre 2X Laemmli tamponu ekleyin ve bunları 95 ila 100 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Numuneler soğuduktan sonra, her numuneden 15 mikrolitre %dört ila %15 gradyanlı bir SDS poliakrilamid jel üzerine yükleyin. PVDF membranları kullanarak standart bir Western blot protokolü çalıştırın.
Son olarak, numunelerde fosforile paxillini tespit etmek için RapR-Shp2 yapısını tespit etmek için anti-FLAG antikoru ve anti-fosfo-paxillin kullanarak kurulayın. Aktif RapR-Shp2, yapısal olarak aktif Shp2'ye benzer şekilde fosfo-paxillin göstermedi, bu da tam aktivitenin korunduğunu gösteriyor. Aktif olmayan RapR-Shp2 ve baskın negatif Shp2, benzer fosfo-paksilin seviyeleri gösterdi, bu da aktif olmadığında aktivite olmadığını gösterdi.
