Rejenerasyon ve İlaç Etkilerini İncelemek için İnsan Yumurtalık Epitel Tek Tabakası ve Organoidlerinin Geliştirilmesi

Başlamak için, dondurularak saklanmış insan yumurtalık yüzeyi epitel hücrelerini çözün. Hücreleri 10 mililitre yıkama ortamı ile karıştırın. Hücreleri santrifüjledikten sonra, peleti iki mililitre yumurtalık yüzey epiteli veya OSE 2D ortamında yeniden süspanse edin ve 12 oyuklu bir plakanın iki oyuğuna aktarın.

Kuyucuğa bir mililitre ekstra OSE 2D ortamı ekleyin ve ilk ortam yenilemesinden önce 72 saat boyunca %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede kültürleyin. Otomatik bir hücre sayacı ile yeni izole edilmiş veya dondurularak saklanmış, çözülmüş canlı insan yumurtalık yüzeyi epitel hücrelerini saymak için Tripan Mavisi boyama kullanın. İstenilen sayıda hücreyi bir mililitre buz gibi soğuk OSE organoid bazik ortamda karıştırın ve tüpü beş dakika boyunca 240 G'de santrifüjleyin.

Bir pipet kullanarak, 10 mikrolitre başına 10.000 hücre elde etmek için hücre peletini buz gibi seyreltilmemiş bazal membran özü çözeltisinde yeniden süspanse edin. Önceden ısıtılmış çok kuyulu odacıklı bir slaytta oyuk başına 10 mikrolitrelik OSE bazal membran özü çözeltisi damlatın ve plakayı 15 dakika boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede baş aşağı yerleştirin. Jel katılaştıktan sonra, 100 mikrolitre OSE 3D ortamı ekleyin ve% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede kültürleyin.

Harcanan ortamı çıkardıktan sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitre buz gibi gelişmiş DMEM F12 ekleyin. Jel damlacıklarını ayırmak için kuyucukların dibini bir P1000 pipet ucuyla kazıyın ve her yüzen jel damlacığını 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü beş dakika boyunca 240 G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı attıktan sonra, peleti 300 mikrolitre hücre ayrışma tamponunda yeniden süspanse edin ve tüpleri 5 ila 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir boncuk banyosuna yerleştirin. Daha sonra, 300 mikrolitre insan OSE organoid bazik ortamı ekleyin ve beş dakika boyunca 240 G'de santrifüjleyin. Son olarak, peleti, kültür için uygun bir oranda yeniden tohumlamak için istenen hacimde seyreltilmemiş bazal membran özü çözeltisinde yeniden süspanse edin.

Birincil insan OSE hücreleri, üçüncü pasaja kadar parke taşı benzeri morfoloji sergiledi, ancak daha sonra yaşlanma belirtileri gösterdi. Yeni izole edilmiş OSE hücrelerinden elde edilen insan OSE organoidleri, kültürde 14 gün sonra 2D genişletilmiş OSE hücrelerinden daha büyük büyüdü. 3D OSE organoidlerinde kistik, tek katmanlı, çok katmanlı ve lümenize olmayan hücre kümeleri dahil olmak üzere çeşitli morfolojiler gözlendi.