Başlamak için, daha büyük kalıntıları temizlemek için sertifikalı Pinus pinaster tohumlarını akan musluk suyunda yıkayın. Ardından, daha ince kalıntıları kuvvetli çalkalama ile ortak bir deterjan çözeltisi kullanarak yıkayın. Bir akış davlumbazında, tohumlar kaplanana kadar ticari bir ağartma solüsyonu ekleyin ve 15 dakika kuvvetlice karıştırın.
Çamaşır suyu çözeltisini attıktan sonra, tohumları sterilize edilmiş musluk suyuyla üç kez durulayın. Şimdi tohumları kuvvetli çalkalama ile 15 dakika boyunca% 80 etanole batırın. Etanolü attıktan sonra, tohumları üç kez sterilize edilmiş ultra saf suyla yıkayın.
Çam çimlenmesi için sterilize edilmiş tohum kabuklarını steril bir mekanik torna tezgahı ile kırın. Çam fıstığını izole edin ve gece boyunca nemlendirmek için sterilize edilmiş ıslak filtre kağıdı ile kapalı bir kaba koyun. Ertesi gün, uyku halini kırmak ve çimlenmeyi senkronize etmek için hidratlı çam fıstığını yedi gün boyunca dört santigrat derecede tabakalandırın.
Daha sonra çam fıstığını karanlıkta çimlenene kadar 25 santigrat derecede tutun. Aseptik çimlenmiş çamları iki hafta boyunca veya ana gövde gelişmeye başlayana kadar kontrollü çevre koşullarına aktarın. İki hafta sonra, fidanın kök üzerindeki hava kısmını bir neşter ile kesin ve sterilize edilmiş bir Schenk Hildebrandt kültür ortamına aktarın.
Kültürü, daha önce açıklandığı gibi kontrollü çevre koşullarında koruyun. Steril bir neşter ile sürgünün tabanındaki nasır dokusunu keserek periyodik olarak alt kültür. Steril cımbız kullanarak sürgün kümesini yeni bir çarpma kültürü ortamına aktarın.
Daha sonra, mikro sürgünleri, mikro gövde uzaması için litre başına üç gram aktif kömür içeren Schenk Hildebrandt kültür ortamına aşılayın. Şimdi uzun sürgünleri, fitohormonlar veya aktif kömür içermeyen Schenk Hildebrandt kültür ortamına yerleştirin. Mikro çekimin altına 100 ila 150 karma yaşam aşaması sterilize edilmiş çam ağacı nematodu ekleyin.
Kültürü, daha önce açıklandığı gibi kontrollü çevre koşullarında koruyun. İn vitro çam sürgünlerinin oluşumu ve enfeksiyonu, çam ağacı nematodları ile ko-kültürden sonraki bir ay içinde klorotik iğnelerin görünümünü göstermiştir.
