JoVE Journal

Bioengineering

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir.

Elektrot Dizisi Kullanılarak A431 Hücrelerinde Transepitelyal Elektrik Empedans (TEEI) İzleme

Transkript

Başlamak için, elektrot dizisindeki her bir oyuğa mililitre propidyum iyodür çözeltisinden 1,5 mililitre propidyum iyodür çözeltisi pipetleyin. Elektrot dizisindeki her bir oyuka bir kesici uç yerleştirin ve ek parçanın ayaklarını hizalama oluklarına yerleştirin, böylece ek parça kuyunun üst yüzeyi ile aynı hizada olur. Üst elektrot baskılı devre kartını elektrot dizisi kuyularının üstüne vidalayın ve elektrot dizisini gözenekli alt tabaka elektroporasyonuna veya PSEP cihazına bağlayın.

Sıcaklık dengelemesi için elektrot dizisini 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. GUI'nin sol üst köşesindeki zarın yanındaki açılır menüye tıklayın ve 400 nanometre GBO'ya tıklayın. GUI'nin sağ tarafında, darbe sonrası zaman süresi dakika düzenleme alanına bir tane yazın.

Şimdi, çalıştır düğmesine tıklayın ve istendiğinde bir ila üç ve dört ila altı kuyuları için uygun adları girin. Ardından, denemeyi başlatmak için Tamam'a tıklayın. Bir saat sonra, elektrot dizisini inkübatörden çıkarın ve ekleri deney plakasındaki orijinal konumlarına geri aktarın.

200 mikrolitrelik bir tüpte iki mikrolitre Hoechst 33342 ve beş mikrolitre kalsein'yi 123 mikrolitre hücre kültürü ortamı ile karıştırın. Her bir darbe sonrası eke 10 mikrolitre leke solüsyonunu nazikçe pipetleyin ve ekleri beş dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Kuyu plakasını 5x büyütme objektifine sahip bir floresan mikroskobun plaka tutucusuna aktarın.

Parlak alan ve her lekenin floresansını kullanan görüntü. Elektrot dizisindeki her bir oyuğa 1.5 mililitre hücre kültürü ortamı pipetleyin. Hücre numunesi eklerini bir ila üç kuyucuklara yerleştirin ve kontrol eklerini dört ila altı kuyucuklara yerleştirin, ekin ayaklarını hizalama oluklarına oturtun.

Üst elektrot baskılı devre kartını elektrot dizisi yuvalarının üstüne vidalayın ve elektrot dizisini PSEP cihazına bağlayın. Sıcaklık dengelemesi için elektrot dizisini 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. GUI'nin sol üst köşesindeki membranın yanındaki açılır menüye tıklayın ve 400 nanometre GBO'ya tıklayın.

Şimdi, çalıştır düğmesine tıklayın ve istendiğinde bir ila üç ve dört ila altı kuyuları için uygun adları girin. Ardından, denemeyi başlatmak için Tamam'a tıklayın. Bir saat sonra, elektrot dizisini inkübatörden çıkarın ve ekleri deney kuyusu plakasındaki orijinal konumlarına geri aktarın.

Hücre kültürü ortamında Hoechst 33342, kalsein ve propidyum iyodürü hazırladıktan sonra, her bir darbe sonrası eke 10 mikrolitre leke solüsyonunu karıştırın ve nazikçe pipetleyin ve ekleri beş dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Floresan mikroskobunda, parlak alan ve her lekenin floresansını kullanarak hücre numunesi eklerini görüntüleyin. Optimize edilmiş sağlıklı eğri, taban çizgisinin altında bir düşüş göstermedi ve TEEI'deki en büyük artışı gösterdi.

PSEP sonrası hücre tek tabakasının görüntülenmesi, ihmal edilebilir hücre ölümü ve sağlıklı, tamamen birleşen bir hücre tek tabakası ortaya çıkardı. Optimize edilmiş sağlıksız veriler, TEEI yanıtının azalmasına neden oldu. PSEP sonrası görüntüleme, sıfıra yakın hücre ölümü ve tek tabakada daha az hücre olması nedeniyle iletim verimliliğinin azaldığını ortaya çıkardı.

Optimize edilmemiş dalga formlarının uygulanması, TEEI yanıtında önemli düşüşlere neden oldu, bu da önemli hücre ölümüne ve azalan dağıtım verimliliğine işaret etti.

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.