Rejenere ve Sağlam Ekstremite Dokularında Atomik Kuvvet Mikroskobu Ölçümleri için Aksolotl Doku Montajı ve İşleme

Bir santimetre çapında bir santimetre uzunluğunda silindirler hazırlamak için, bir karton kesiciyi Bunsen brülör alevi altında ısıtın ve ısıtılmış bıçakla 15 mililitrelik bir tüp kesin. Silindirlerin bir tarafını Parafilm parçaları ile kaplayın. Aksolotl'u uyuşturduktan ve dokunsal uyaranlara yanıt vermediğinden emin olduktan sonra, uzvu vücut eksenine dik olarak yönlendirin.

Uzuvları, zeugopodial bölgenin kalsifiye bölgesine hemen distal olarak ampute edin. Aksolotl'u analjezikli taze tutma suyu içeren bir tanka geri koyun. 24 saat sonra, aksolotl'u tekrar taze tutma suyuna aktarın ve istenen ilgi aşamasına kadar uzvun yenilenmesine izin verin.

Anestezi uygulanmış aksolotl'u stereo mikroskop altına yerleştirdikten sonra, histoliz ve yoğunlaştırıcı kıkırdak aşamaları için istenen rejenerasyon aşamasında uzuvun uzunluğunu ölçün. Uzuvları topladıktan sonra, diseksiyon için bir Petri kabına yerleştirin. Stereo mikroskop altında, uzuvları dirsek hizasında bir neşter ile inceleyin ve bunları APBS çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin.

Pasteur pipetlerini ve termoblok setini 37 santigrat dereceye agaroz alikotları ile çalışma platformuna yerleştirin. Soğuk bloğu eksi 20 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve silindiri Parafilm kaplı ucu aşağı bakacak şekilde üzerine yerleştirin. Uzuvları temiz bir tabağa yerleştirin ve disseke edilen uzuvdaki fazla sıvıyı kağıt mendil ile nazikçe çıkarın.

Erimiş düşük erime noktalı agarozu üstüne ekleyin ve kalan APBS'yi cilt yüzeyinden uzaklaştırmak için uzvu agaroz içinde kısa bir süre hareket ettirin. Uzvu hızlı bir şekilde silindirin içine yerleştirin ve ilgi alanı yukarı bakacak şekilde dikey olarak yönlendirildiğinden emin olun. Doku tamamen kaplanana kadar silindirin içine düşük erime noktalı agaroz ekleyin.

Ardından, silindiri soğuk bloktan çıkarın ve agarozun 30 saniye katılaşmasına izin verin. Katılaşmadan sonra, Parafilmi silindirin altından çıkarın ve agaroz içeren dokuyu siyanoakrilat yapıştırıcı ile vibratom aşamasına tutturun. Ardından, çevredeki fazla agarozu bir neşterle çıkarın.

Bölümlendirme için sahneyi APBS çözümüne daldırın. Doku ucuna ulaşılana kadar agarozu 100 mikrometrelik adımlarla bölümlere ayırmaya başlayın. Ardından, dokunun distal kısmı çıkarılana kadar bölüm.

Bir tıraş bıçağı kullanarak, doku içeren agaroz bloğunu vibratom aşamasından dikkatlice çıkarın. Hemen, bloğu cerrahi doku yapıştırıcı yapıştırıcısı ile 35 milimetrelik plastik bir Petri kabına yapıştırın. Dokuyu kaplamak için yaklaşık iki mililitre kültür ortamı ekleyin.