Başlamak için, akış hücresinin 3. kanalına 500 mikrolitre protein içermeyen görüntü tamponu ekleyin. İki nanomolar Saccharomyces cerevisiae NAP1 ve iki ila beş nanomolar LD655 etiketli H4 histon oktamerini 500 mikrolitre 1X HR tamponu ile karıştırın. Bu karışımı akış hücresinin 4. kanalına ekleyin.
Tüm kanalları numunelerle yıkamak için 1,0 bar'da 30 saniye boyunca akıtın. Akışı 0,2 bar'a ayarlayın ve uygun bir çift streptavidin kaplı boncuk yakalamak için optik tuzakları kanal 1'e getirin. Ardından, optik tuzakları kanal 3'e taşıyın.
Akışı kapatın ve boncuk çifti için zorunlu bir kalibrasyon yapın. Kırmızı konfokal lazeri açın ve görüntüleme alanını kalibre edin. Akışı 0,2 bar'a ayarladıktan sonra, biyotinile DNA'yı yakalamak için optik tuzakları kanal 2'ye getirin.
Ardından optik tuzakları kanal 3'e getirin ve akışı durdurun. DNA'yı germek için optik tuzaklar arasındaki mesafeyi artırın ve tek bir DNA bağının varlığını doğrulamak için ilişkili zorlanmış mesafe eğrisini izleyin. Optik tuzaklar arasındaki mesafeyi, DNA gerilimi yaklaşık bir pikonewton okuyacak şekilde ayarlayın.
Kırmızı lazer açıkken bir kimografi toplamaya başlamak için çizgi taramasını açın. Ardından, DNA bağı boyunca nükleozomlar oluşturmak için optik tuzakları akış kapalı olarak kanal 4'e hareket ettirin. Nükleozomları açmak için optik tuzakları kanal 3'e taşıyın.
Kuvvet okumasını 0'a ve hızı saniyede 0.1 mikrometreye ayarlayarak, optik tuzağı 1 optik tuzağdan 2 uzaklaştırın. 10 nanomolar Cy3 etiketli bağlayıcı histon H1.4'ü 500 mikrolitre görüntü arabelleğine karıştırın ve kanal 5'e ekleyin. Nükleozom içeren bir DNA bağı oluşturduktan sonra, kırmızı lazere ek olarak yeşil lazeri açın ve H1'in kromatine bağlanmasının gerçek zamanlı görüntülenmesi için optik tuzakları kanal 5'e taşıyın.
DNA bağı boyunca nükleozom oluşumu, 2D tarama ve kimografi üzerinde sabit kırmızı floresan odaklar olarak görselleştirildi. Foto ağartma analizi, mononükleozomların varlığını gösteren tek aşamalı veya iki aşamalı foto ağartma olaylarını gösterdi. NAP1'in yokluğunda, histon oktamerleri DNA'ya bağlandı, ancak sabit gerilim ile gösterilen çoğunlukla sargısız kaldı.
Cy3 etiketli H2A kullanılarak, LD655 etiketli H4'te olduğu gibi benzer nükleozom montaj sonuçları elde edildi. Nükleozomun açılması zamanla artan bağ mesafesi, kimografide görülebilir ve tek tek nükleozomların açılmasını gösteren karakteristik yırtıklarla zorlanmış mesafe eğrileri oluşturdu. Bağlayıcı histon H1'in kromatine bağlanması, H1'in nükleozomlara bağlanmasını temsil eden çift renkli sabit yörüngelere sahip yeşil floresan odaklar ve yayılan H1 yörüngelerini temsil eden yeşil pürüzlü yörüngeler ile gösterildi.
