Başlamak için, 24 oyuklu plakayı kaplama çözeltisi ile kaplayın ve 37 santigrat derecede iki saat veya gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Plakaları iki kez steril suyla yıkayın ve hücreler kaplamaya hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın. Şimdi at jejunumunun bir bölümünü alın ve buz üzerinde soğuk zil çözeltisine yerleştirin.
Jejunumdan 10 santimetrelik bir kısmı çıkarın ve lenfoid olmayan bölgeleri merkeze yerleştirerek anti-mezenterik sınırda açın. Daha sonra kısmı yaklaşık yedi ila yedi santimetrelik bir bölüme kesin ve diseksiyondan önce dokuyu taze zil solüsyonunda iyice durulayın. Şimdi dokuyu silikon elastomer kaplı bir Petri kabına soğuk zil çözeltisinde veya PBS'de, mukozal tarafı yukarı bakacak şekilde mümkün olduğunca gererek sabitleyin.
Kavisli forseps kullanarak, bağırsak villusunu çıkarın ve ardından lamina propria tabakasını yaklaşık beş ila beş santimetre lenfoid olmayan bölgeden çıkarın. Daha sonra, mikrodiseksiyon makasıyla, submukozayı bir köşeden serbest bırakarak bir tabaka halinde çıkarın. Submukozayı iç dairesel kas tabakasından soyarken doğal ayrılmayı gözlemleyin.
Daha sonra toplanan submukozal tabakayı iki ila beş milimetrelik parçalar halinde kıyın. Bunları FBS, kollajenaz, proteaz ve BSA içermeyen beş mililitre orgono içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Enzimatik sindirim için dokuyu 37 santigrat derecede iki ila üç saat inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, enzim etkisini durdurmak için FBS ile 10 mililitre oda sıcaklığında orgono ekleyin. Hücreleri dokudan ayırmak için 10 mililitrelik serolojik bir pipet kullanarak doku karışımını 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra karışımı oda sıcaklığında üç dakika boyunca 3000 G'de santrifüjleyin.
Daha sonra, süpernatanı atın ve çözeltiyi 10 mililitrelik bir serolojik pipetle 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti 10 mililitre oda sıcaklığında PBS'de yeniden süspanse edin. Konik tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca 3000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti FBS ile 10 mililitre oda sıcaklığındaki orgono'da 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
Ardından, hücreleri 100 mikrometre, 70 mikrometre ve 40 mikrometre gözenek boyutunda hücre süzgecinden sırayla süzün. Hücreleri santrifüjledikten ve süpernatanı attıktan sonra, peleti FBS ile bir mililitre orgono'da yeniden süspanse edin. Daha sonra canlı hücreleri tanımlamak için hücreleri tripan mavisi ile boyayın ve bunları bir hemositometre kullanarak sayın.
Şimdi 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda FBS ile 300 mikrolitre orgono'da yaklaşık 400.000 hücre tohumlayın. Her kuyucuğa beş mikrolitre N2, beş mikrolitre G5 ve 10 mikrolitre B27 ekleyin. Hücrenin yapışmasını sağlamak için plakayı %5 karbondioksit içeren 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin.
İlk geçitten gelen hücreler% 70 ila 80 birleşmeye ulaştığında, kuyucukları 24 saat boyunca sıfır, 10 ve 25 nanogram interlökin-1 betaya maruz bırakın. Kültürlerde enterik glial morfoloji ile uyumlu iğ şeklindeki hücreler, pleomorfizm ve diğer hücre tiplerinden minimum kontaminasyon ile gözlendi.
