Başlamak için, Transwell eklerini 42 mikrolitre% 0.05 Matrigel ile kaplayın. Matrigel'in sertleşmesine izin vermek için 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Ekstra ortamı aspire edin ve Transwells'i üstü açık olarak 30 dakika kurutun.
Daha sonra her bir parçaya 200 mikrolitre DMEM F12 ortamı ekleyin ve kullanılana kadar 37 santigrat derecede saklayın. Organoidleri içeren Matrigel köftelerini PBS ile yıkayın. Buz üzerindeyken 500 mikrolitre hücre geri kazanımına maruz bırakın ve 15 mililitrelik bir tüpte hücrelerin tam olarak toplanmasını sağlamak için karışımı tekrar tekrar pipetleyin.
Daha sonra tüpü 300 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve bağırsak epitel kök hücresinin veya IESC ortamının hedef hacmindeki hücre peletini yeniden süspanse edin. Şimdi, bir mililitrelik bir şırıngayı IESC ortamında önceden kaplayın, hücre süspansiyonunu 16 gauge bir iğne ile aspire edin.
Ardından 16 gauge iğneyi 28 gauge iğne ile değiştirin ve organoidlerin ayrılmasını sağlamak için süspansiyonu çıkarın. Daha sonra, elde edilen hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini kaplanmış Transwell'lerin apikal tarafına yerleştirin. Bazal tarafa 500 mikrolitre IESC ortamı ve büyüme faktörleri ekleyin.
Tek katmanlar boyunca TEER'i ölçmek için çift elektrotlu bir TEER ölçüm odası kullanın. Kültür kabını 1,5 mililitre IESC ortamı ile doldurun ve Transwell ekinde tam olarak 200 mikrolitre ortam bulunduğundan emin olun, böylece ölçüm sırasında sıvı seviyeleri eşleşir. Transwell eklerinin bazolateral yönünü, interlökin-1 beta'nın inflamatuar sitokinlerine veya interlökin-1 beta'ya maruz kalan kültürlerden glial ürünlere maruz bırakın.
TEER'i her 10 ila 15 dakikada bir 45 dakika boyunca her Transwell'i kültür kabına yerleştirerek ölçün. 10 ve 25 nanogram interlökin-1 beta ile muamele edilen glial kültürlerden ortama bazolateral maruziyet, epitel bariyeri geçirgenliğini önemli ölçüde arttırdı. Çeşitli konsantrasyonlarda at interlökin-6'ya maruz kaldıktan sonra epitel geçirgenliğinde önemli bir artış gözlenmemiştir.
