1. Indükleyici koşullar altında keten Büyüme. <ol><li> 5 &quot;tencere toprakla doldurulur ve onaylanır. </li><li> Pot başına üç tohum ekildi ve ¼ inç derin toprak, tohum üzerinde onaylanır. </li><li> Tencere sonra uygun besin çözümler 100ml ile sulanan <ol><li> Olmayan inducing kontrolü (C) koşulları her hafta 1 / 10 th gücü Miracle-Gro kullanın. Yüksek besin durumu (NPK tedavi) tam gücü Mucize haftalık uygulanan yetiştirin. Düşük besin - bitkiler sadece kendi büyüme boyunca uygulanan musluk suyu vardı. (Durrant 1971, Cullis 1980). </li></ol></li><li> Bitkiler, yaz aylarında doğal ışık altında yetiştirilir. Kış aylarında 16 / 8 saat aydınlık / karanlık döngüsü ile sodyum ışıkları altında yetiştirilir. </li><li> Haftalık aralıklarla toplanan yaprakları ve meristemlerde. </li><li> Bitki materyali hızlı bir sıvı nitrojen içinde dondurulur. </li></ol> Sonuçlar Üç genotipleri (Şekil 1) koşullara bağlı olarak farklı nispi oranları büyür. Bu nedenle kontrol koşulları altında Pl hattı L, S (Şekil 1a) daha kuvvetli olan en iyi yetişir. Düşük besinleri altında (su), S L veya Pl (Şekil 1b) ya da daha iyi yetişir. Yüksek besin altında (NPK) L sadece S (Şekil 1c) biraz daha iyi yetişir Pl daha iyi yetişir. Her üç farklı tedaviler altında yetiştirilen satırlar arasında bir karşılaştırma Şekil 1 d gösterilir f. Pl, kontrol koşulları (Şekil 1d), altında iyi yetişir, yüksek besin (Şekil 1e) ve S altında L iyi benzer yüksek besin ve kontrol koşulları altında (Şekil 1f). Bu veriler, üç satır üç ortamlarda büyüme göre ayırt edilebilir olduğunu göstermektedir. Not L (indüklenen altında) NPK koşulları altında en iyi yetişir Pl kontrol koşulları altında iyi yetişir. S geliştirilmiş besin koşulları yararlanmak mümkün değildir, ancak çok düşük bir besin koşullar altında büyümek için daha iyi yapabiliyor, her üç koşulları, aynı yetişir. Bitkilerin farklılaşma ile ilgili büyüme parametreleri (ve her yaprak arasındaki mesafe bu boğum uzunluğu, ile ilişkili), bitki boyu, yaprak boyutu ve dallanma derecesi içerir. Pl kontrol koşulları altında bitki dalları ile uzun boylu ve yaprakları büyük ve koyu yeşil renktedir. Düşük besinleri altında bitki çok kısa, her yaprağı arasındaki mesafe çok kısa ve yaprakları, küçük ve hafif yeşil. Ucunda yaprak, kök aşağı düşürmek daha koyu yeşil. Yüksek besin altında bitki kontrol koşulları altında, ana kök ve yan sürgünler hem kontrol bitkilerin daha kısa olması dışında çok benzer görünüyor. Büyük genotroph için bitkiler yüksek besin altında en güçlü büyüme dışında Pl bu çok benzer. Yine düşük besinleri altındaki bitki çok kısa ve açık yeşil yaprakları vardır. Yaprakları, düşük besin altında hafif yeşil olmasına rağmen S genotroph üç ortamlarda benzer yetişir. Ancak, S genotroph Pl veya L hatları ya da daha düşük besin koşullarında çok daha güçlü. 2. RNA ve DNA ekstraksiyonu, keten meristemlerde ve yaprakları ayrı ayrı yapılır. RNA ekstraksiyonu ve Qiagen DNeasy Bitki DNA hazırlık kiti DNA ekstraksiyon için kullanılan Roche toplam RNA hazırlık kiti kullanıldı. RNA Ekstraksiyon <ol><li> 3 meristemlerde artı bazı çevreleyen yaprak Eppendorf tüp depolama cryovial taşınmış ve zemin olmak için hazır olana kadar sıvı azot içine yerleştirilir. </li><li> Steril kum tüpüne eklenir ve doku ince kadar micropestle kullanılarak öğütülür. </li><li> Roche toplam RNA hazırlık kiti 400 ul lizis / bağlayıcı tamponu eklenir ve doku daha fazla zemin kümeleri görünür olana kadar. </li><li> Örnek için 15 saniye, 1 dakika 13.000 rpm&#39;de kum ve herhangi bir enkaz toplamak için spun sonra lizis yardım ve vortekslenmiş. </li><li> Süpernatant sütun spin eklenir ve yönetmen olarak RNA hazırlık seti talimatlarını geri kalanı takip edilmektedir. </li></ol> DNAz tedavi <ol><li> 10X DNAz tampon 1 / 10 RNA numune hacmi eklenir. </li><li> DNAz, 30 adet ilave edilir ve reaksiyon 37 inkübe ° C de 30 dakika ve 70 ° C 5 dk. </li></ol> Ters Transkripsiyon <ol><li> Her yöne 37 inkübe tepki ° C 1 saat ve 95 ° C&#39;de 5 dakika. Applied Biosystems RNA cDNA kiti olarak kullanılır </li></ol> CDNA sonra PCR veya qPCR için kullanılır. qPCR qPCR ABI Adım Bir sistemi kullanılarak yapıldı. Tüm testlerin her çalışma, üç nüsha olarak yapılmıştır. Aktin gen kopya sayısı kontrolü olarak kullanılmıştırmevcut en iyi temizlik gen. <ol><li> Uygun primer çifti 1μl her tüpe eklendi. </li><li> CDNA, uygun konsantrasyonda ve 9μl seyreltilmiş her tüpe eklendi </li><li> 10μl 2x Güç SYBR Green PCR Mastermix (ABI) ve her tüp eklendi </li><li> Program amplifikasyon programı: <ul><li> 10 dakika 95 ° C </li><li> 95 15sn 40 döngü ° C, 60 ° C&#39;de 1 dakika </li></ul> Amplifikasyon özgüllüğü doğrulamak için termal denatürasyon adım </li><li> 2 değeri (- CTactin CTunknown) göreceli ifade düzeyleri tespit edildi. </li></ol> DNA hazırlığı <ol><li> Tampon AP1 Qiagen DNeasy Bitki DNA hazırlık kiti bir mikrofuge&#39;de tüp içinde steril kum ile 6 yaprakları eklenir. Kümeleri görülebilir kadar doku micropestle zemin. </li><li> Kit talimatlarını olarak takip edilmektedir. </li></ol> Sonuçlar Kök boyunca çeşitli pozisyonlarda yapraklarından izole edilen DNA PCR bitkiler indükleyici koşullar altında (4) büyürken, LIS-1 görünüm oluşur göstermektedir. QPCR sonuçları LIS-1 (veya indüksiyon ile ilişkili diğer genomik değişiklikler) varlığını hemen yakınında LIS-1 (Şekil 2) gen ifadesi etkilediğini göstermektedir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi altı genler farklı dört yüksek PL ifade (LIS-1 olmadan) ve S daha yüksek ifadesi (LIS-1 var) olan iki sahip Pl ve S olarak ifade edilir. Panel 1 ve 2 LIS-1 ekleme noktasına yakın iki gen vardır. Bu gen ifadesi, farklı büyüme koşulları altında büyük genotroph (indüklenen değişiklikler oldu ama LIS-1 bulunmamış) ve ifade LIS-1 ve ifade değişiklikleri arasında herhangi bir nedensel ilişkiyi belirlemek için gerekli olacaktır. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Pl, L, S, üç değişik besin rejimler altında büyüdü . Paneller bir kontrolü, b - düşük besin ve c - NPK. d - Pl, e - f - L. Panelleri d - f, soldan sağa: düşük besinler, kontrolü ve NPK. D - Pl, e-L, F - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2 başparmak" /> Şekil 2 LIS-1 yerleştirme noktası etrafında. Gen ekspresyonu. Gene 1 (büyüme Inhibitor) LIs1 hemen 5 &#39;ve LIS-1 gen 2 (Kip-siklin-bağımlı kinaz inhibitörü id 3 &quot;diğer genlerin inşa aynı iskele (~ 500kb) boyunca keten genom dizisi. Lütfen <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">daha büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 Stormont Cirrus düşük besin koşullar altında yetiştirilen bitkilerin yaprakları ayıklanır DNA&#39;lar PCR. PCR ürünleri% 2&#39;lik agaroz-TBE jel ayrıldı. Uninserted site Paneli gösterilir, eklenen sitenin iki ucu b ve c Panelleri gösterilmiştir Yaprak örnekleri 1 - 6 haftalık aralıklarla örnek 1 ekim sonrası erken izole edildi.

<ol>
	<li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum.">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax.">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li><li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmentally+induced+adaptive+(?)+insertion+event+in+flax.">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li></ol>

Keten doğası gereği istikrarsız bir genom gibi görünüyor. Birkaç nesiller için büyüdüğü zaman ticari lif keten çeşitlerinin sayısı hızla olmayan tekdüze haline. Aynı gözlemler yağ keten çeşitleri için geçerli görünmüyor. Bu nedenle, lif kalitesi ve genom istikrarsızlık seçim arasında bir ilişki varmış gibi görünür. Çevre başlangıçta fiber bitki büyüme agronomik gözlemlerin soruşturma aracılığıyla tespit edilmiştir keten değişiklikler kalıtsal indüklenen. Bu, spesifik fenotipik ve genomik varyasyon tekrarlanabilir gözlemler çevresel stres oluşabilir genomik düzenlenmeleri takımı nasıl etkileyecek sorusunu gündeme getirmektedir. Belirli ortamlara yanıt LIS-1 tekrarlanan bir görünüm, bu mutasyon doğrudan ya da dolaylı olarak seçilen ile tutarlı. Çeşitli tedaviler ile indüklenen hatlarının büyüme de ilgili indükleyici koşullar altında gelişmiş bir performans gösterir. Ifadesi de yine LIS-1 varlığı ile ilişkili değişiklikler bu ekleme bitki performansını etkilediğini göstermektedir. Video sunumu geleneksel basılı malzeme ile iletmek için imkansız bir şekilde bitki fenotipik değişiklikleri gözlemlemek için bir forum sağlar.

<ul><li> Orijinal Stormont Cirrus çeşitli Keten tohumu Pl ve genotrophs L ve S. gösterilir </li><li> 5 &quot;tencere </li><li> toprak saksı </li><li> Miracle-Gro </li><li> sera </li><li> Yüksek basınçlı sodyum lambaları </li><li> Sıvı nitrojen </li><li> Harç ve havan </li><li> Micropestles ve mikrofuge&#39;de tüpler </li><li> PCR </li><li> Agaroz jel elektroforez ekipmanları </li><li> Dijital görüntüleme kurulumu </li><li> StepOne qPCR modülü </li><li> Qiagen DNeasy Bitki DNA hazırlık kiti </li><li> Uygulamalı Biyosistem RNA, cDNA kiti </li><li> Roche toplam RNA hazırlık kiti </li></ul>

environmentally induced heritable changes in flax

Bazı keten çeşitleri genom değiştirme ve birçok nesiller boyunca bu değişiklikler kalıtsal olabilir besin strese cevap verir. Ayrıca bu genomik değişiklikler ile ilişkili fenotipik varyasyon kalıtsal 1,2. Üç farklı besin koşullar altında yetiştirilen keten çeşitli Stormont Cirrus (Pl) ya da (kontrol koşullar altında) indüklenebilir kalır, ya da stabil bir şekilde, sırasıyla, yüksek ya da düşük besin koşullar altında büyüme ile büyük veya küçük genotroph ya da değiştirilmiş haline. Bu koşulların her birinin altında ilk büyüme kaynaklanan çizgiler daha sonraki nesillere de aynı şartlar altında yetiştirilen büyümeye Pl hattı, özellikle yüksek ve düşük besin hem de altında büyüyen bitkilerin altında olduğunu belirten kontrol tedavi altında en iyi yetişir stres. Bitkilerin besin stres altında büyürken kalıtsal değişikliklerin indüksiyonu ile ilişkili genomik değişikliklerin biri bir ekleme elemanının görünümünü (LIS-1) 3, 4. Bu ekleme olayı ile ilgili olarak, keten çeşitli Stormont Cirrus (Pl) üç farklı besin koşullar altında yetiştirilen ya (kontrol koşullar altında) değişmeden kalır, ekleme, tüm bitkilerin (düşük besinleri altında) ve bu yolla bulaşan yeni nesil, veya ekleme (veya parçaları) görünür ancak nesiller (yüksek besin altında) 4 üzerinden aktarılabilir. Bu ekleme görünümünü frekans, aynı zamanda sonraki nesillere büyüme yanıtı ile tutarlı pozitif seçimi, altında olduğunu gösterir. Büyümenin çeşitli aşamalarında hasat edilen yapraklar veya meristemlerde DNA ve RNA izolasyonu için kullanılır. RNA çeşitli büyüme ortamları ve / veya t LIS-1 varlığı / yokluğu ile ilgili ifadesinde varyasyonu tanımlamak için kullanılır. Izole edilmiş DNA ekleme oluştu bu bitkilerin tanımlamak için kullanılır.

Watch this Scientific Journal Video about Environmentally Induced Heritable Changes in Flax at JoVE.com

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Genom ve fenotipik varyasyon bir alt kümesi içinde genomik değişimi besin stres altında bazı keten çeşitleri Büyüyen. Belirli bir yerinde karmaşık bir ekleme çeşitli besin rejimler altında büyüme ile bu sitede çevresinde gen ekspresyonu değişiklikleri ile ilişkilidir.

Keten içinde değişiklikler Kalıtsal Çevre İndüklenmiş

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

environmentally-induced-heritable-changes-in-flax

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Görüntüleme.  Case Western Reserve University. Genom ve fenotipik varyasyon bir alt kümesi içinde genomik değişimi besin stres altında bazı keten çeşitleri Büyüyen. Belirli bir yerinde karmaşık bir ekleme çeşitli besin rejimler altında büyüme ile bu sitede çevresinde gen ekspresyonu değişiklikleri ile ilişkilidir.

Video: Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biyoloji

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Sıçanlarda Meme Bezi Morfolojisi ve Meme Kanseri Riski değişiklikler

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

RNA Yapısı &#39;peroksidatif&#39; ve &#39;Oksidatif&#39; Hidroksil Radikal footprinting İzleme Denge Değişiklikler

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Hydra Glutatyon kaynaklı Besleme Tepki Ölçüm

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Keten Çiçekli-Dip Dönüşüm (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Yüksek Dönüşüm Oranı ile Transgenik progeny&#39;lerinde oluşturmak için

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...