Bu çalışma, Ulusal Sağlık Hibeler EY0081 ve 5T32UY07145 Enstitüsü tarafından ve Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı tarafından desteklenmiştir. Jason Rihel Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı Bristol-Squibb üyesidir.

Bu protokol, kendi laboratuvarı hafif artışlarla ve azaltır Zebra balığı larvalarının Görsel-Motor Yanıt gerçekleştirmek için gereken adımları özetliyor. Zebra balığı davranışsal çalışmalar için harika bir model sistem. Bakımı kolay, onlar büyük bir kavrama boyutları var ve bunlar hızla gelişir. Örneğin, gözleri Zebra balığı larvalarının gelişim 3 gün ve bir irkilme tepkisi gösterir ve bu süre ışığa duyarlı. Bölüm 1: 96 plaka bireysel balık Kaplama <ol><li> 28 yaşında bir aydınlık / karanlık döngüsü altında WT larvaları büyütün ° C kadar en az 4 gün fertilizasyon (dpf). Tipik ışık: karanlık döngüsü, 9:00 AM başlayan ve 10 saat ışıkları KAPALI, 11:00 başlayarak 14 saat ışıkları ON. Davranışsal en iyi sonuçlar için, aşırı kalabalık önlemek, genellikle tek bir petri en fazla 50 larva tutmak. </li><li> 4 dpf&#39;e sonra, 96 plaka zebrafish aktarılacak hazırız. Larvaları daha yüzme oda vermek için, biz genellikle 96-plaka 650 ul büyük bir iyi boyutu ile kullanmak; Ancak, standart 96-kuyucuğu sadece iyi çalışır. Plastik bir transfer pipetlemeyin kullanarak, hafifçe ortalama bir larva transferi. </li><li> Kuyulara balık aktardıktan sonra her bir kuyu, kuyu üstüne su yüzeyinde neredeyse aynı hizada olduğu gibi yeterli balık su doldurun. Ya aşırı doldurmaktan ya da iyi underfilling kayıt kamera için optik sorunlara neden olabilir. Ayrıca, kuyuların içine kabarcıklar tanıtmak için özen gösterin. </li></ol> Bölüm 2: kayıt cihazları Anketi Protokolün bu kısmı için, lütfen filmi bileşenleri tanımlamak için başvurun ve kayıt cihazları kurmak daha yakından tanımak için. <ol><li> Kayıt odanın içinde 96-plaka konumlandırmak için iyi tanımlanmış bir yerdir. </li><li> Kamera arkasına yerleştirilmiş ve kutu kapalı aynalar kullanarak plaka üzerine odaklanmıştır. Yerde aynalar tutan vidaları çevirerek bu aynalar açısı ayarlanabilir. </li><li> Kayıt odasına kızılötesi LED alttan aydınlatılır. Bu kamera karanlıkta bile balık görmenizi sağlar. Larvaları kızılötesi ışık tespit edemez, bu sabit IR aydınlatma deney etkilemez. Beyaz LED&#39;ler ayrıca aşağıdaki kayıt odasına aydınlatır. Kızılötesi ışıklar ayrı ayrı kontrol edilir. Yukarıda ya da yanlarda beyaz ışık ile donatıldı Aydınlatıcı kesinlikle mümkündür, ancak, bu durumda, bakım kamera ile etkileyebilir su yüzeyinden güçlü glares önlemek için alınması gerekir. </li><li> Birkaç saat daha uzun ömürlü, deneme süresi boyunca sabit bir sıcaklıkta korumaya yardımcı olmak için hafifçe akan su haznesi doldurmanız deneyler için. Sabit bir su akışı gerçekleştirmenin bir yolu, tipik bir sualtı akvaryumu ısıtıcı ile 28 ° &#39;ye kadar ısıtılan küçük bir akvaryum pompası bir rezervuar su pompası. </li><li> Oda sokak titreşimi en aza indirmek için, tüm kayıt ünitesi ağır bir denge tablo tepesine oturmak gerekir. </li></ol> Bölüm 3: 96-plaka, video izleme, bilgisayar ızgara ile uyumu Yazılım <ol><li> Kayıt odasına balık içeren 96-plaka koyun. </li><li> Bir su banyosu kullanırken, yavaş yavaş su seviyesi plaka üzerine dökülüp olmadan ayarlamak için bir şans vermek, su, tabak yerleştirin. Alternatif olarak, su akışı kapatmak plaka ekleyin ve sonra akışı devam. Ayrıca, 96 plaka yerinde tutmak için bir bahar ya da bir lastik bant kullandığınızdan emin olun. </li><li> Viewpoint Videotrack yazılımı denemenizi tüm larvaları bilgisayar ekranında görünür olup olmadığını kontrol edin. Yazılım kontrollerini kullanarak video izleme yazılımı, her balık ızgara bir kare içinde böyle plaka kuyuları ile ızgara hizalayın. Izleme bilgisayar, bilgisayar ızgara hizalarını bazı balık hareketleri kaybolmuş olabilir, bu kutuları her biri için ayrı ayrı hareket hesaplanırken olacaktır. Veya daha da kötüsü: bitişik iki balık aynı alanda yer alacak ve bir balık olarak sayılabilir. Bu adım, tüm kayıtlar için çok önemlidir. </li><li> Hizalama sonra, program, ışıklar açık ve kapalı gitmeli zamanlama. Genellikle 3 saat kutuya ışık veya karanlık adaptasyonu hem bazal aktivite düzeyi elde etmek için izin verir, ama aynı zamanda larvaları pipetleme ve taşıma sakinleştirmek için bir fırsat vermek. Temel sonra, biz o zaman 30 dakika 30 dakika KAPALI ışıkları takip ON ışıkları ile alternatif ve birkaç kez tekrarlayın. </li><li> Daha sonra, kayıt odasının kapısını kapatın ve kaydetmeye başlayın. </li><li> Uygulamada (film bakın, biz, saniyede her bir balık aktivite kayıt, ancak aslında Açısından yazılım çerçeve çerçeve verileri kaydederveri toplama bir gösteri için). Kare başına en az piksel değiştirmek için eşik değeri ayarlama özel kamera ve ışık ayarları biraz bağlı olacaktır. Kurulum için, biz genellikle bir eşik 4 piksel kullanmak; az 4 piksel değişiyor, arka plan olarak kabul edilir,. Eğer 4&#39;ten fazla piksel hareket ediyor, balık hareketli olduğunu gösterir. Biz ampirik bu kesim hemen hemen tüm larva yüzmek ve dönüş hareketleri algılar belirlenir. </li><li> Kayıt kutularını oldukça iyi olsa da, larvaları izole odada ışığı kapatın ve oda kapıları açma ve kapama, bir dans partisi olan, ya da egzersiz rutinleri gibi mekanik gürültü ile kesintileri en aza indirmek için dikkat. </li></ol> Bölüm 4: Veri Analiz <ol><li> Deney tamamlandıktan sonra, bir excel sayfasına veya favori analiz adasının içine toplanan veri aktarımı. </li><li> Ekli excel dosyasına veri ne gibi görünebilir bir örnektir: saniye içinde, tüm deney boyunca tüm balıklar için her saniyede larva deney ve faaliyetin başlangıç ​​zamanı (ek dosya Örnek Veri içerir Bu sayfanın Dosyalar bölümü). </li><li> Şekil 1. Tek bir larva faaliyet gösteren bir örnek gösterir. Şekil 2, 40 WT Zebra balığı larvalarının ortalama temsil eden bir eser. ON ve OFF yanıtları ortalama belirgin ve tutarlı. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="Şekil 1" width="569" height="398" /> Şekil 1: tek bir balık Aktivitesi faaliyet dönemlerinde değişen 30 dakika ışık ON ve OFF yanıt olarak, tek bir dpf&#39;e 5 WT balık . ON yanıtlar, siyah oklar ve kırmızı oklarla OFF yanıtları ile gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="Şekil 2" width="577" height="387" /> Şekil 2: 40 balık ortalama faaliyet dönemlerinde değişen 30 dakika ışık ON ve OFF yanıt 5 dpf&#39;e az 40 WT balık ortalama aktivite. ON ortalama (siyah ok) ve OFF (kırmızı oklar) yanıtları belirgin ve tutarlı. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 3, tüm deneylerin kullanılan deneysel anahat şematik bir anahat. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="Şekil 3" width="530" height="479" /> Şekil 3. Görsel Motor Tepkisi (VMR) testi Deneysel tasarım A) Bireysel balık bir kayıt odasına 96-plaka yerleştirilir. Her balık faaliyet saniyede ölçülür. B) Balık, bunları halletmek için de bir temel aktivite düzeyi elde etmek için koyu veya açık uyum bir süre verilir. 3 saat olmak üzere toplam 30 dakika İLİŞKİN ışıkları ve ışıkların Sürelerinin OFF ardışık olarak tanıtılmaktadır. Bu şema Prober ark adapte oldu, 2006. Görsel-Motor Yanıt grafikleri neye benziyor? Biz ışık artırır ve azaltır WT balık ON ve OFF tepkiler ölçülür. Bu tepkiler göz fonksiyonu bağlı olduğunu onaylamak için, biz herhangi bir gözleri geliştirmek chk mutantlar aktivitesini ölçtük . Şekil 4 WT hayvanların yanı sıra chk mutantlar elde edilen ortalama faaliyet göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="Şekil 4" width="489" height="212" /> Şekil 4: WT balık lateral gözler aracılı yanıtları ON ve OFF açık var, 30 dakika ve 30 dakika hafif OFF ışığı yanıt 5 dpf&#39;e Zebra balığı larvalarının lokomotor davranış saniyede kaydedilir . Her eser, 120 bireysel WT (mavi trace) veya chk mutant larvaları (turuncu iz) 3 deney içinde kaydedilen 480 yanıtların ortalama temsil eder . Chk mutantlar ışık artırır veya azaltır ya da önemli ölçüde faaliyetlerini artırmak ve aktivitesi düşük bir temel seviyesine sahip değilsiniz . Bu rakam, Emran ve ark, 2007 uyarlanmıştır. NRC mutant balık Görsel-Motor Yanıtları. NRC mutant okr testi dayalı tamamen kör olduğu düşünülüyordu. NRC mutant, fotoreseptör terminalleri düzgün formu değil ve ciddi görme yolarının 1 tehlikeye. Bu mutant balık retina ganglion hücre kayıtları, bunlar ağırlıklı olarak OFF-tipi ganglion hücre tepkiler, bazı anormal ON-OFF, ancak 2-tipi yanıtları saf sergilediği saptandı. VMR testi kullanılarak NRC mutant normal bir OFF-yanıt ve geç ve cansız ON-yanıt olduğunu göstermiştir (see Şekil 5). Böylece, NRC mutant daha önce 2 düşündüğü gibi tamamen kör değildir. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="Şekil 5" width="591" height="244" /> Şekil 5: NRC mutats ışık şiddetlerinde değişikliklere yanıt olarak etkinliği artırmak Davranışsal tepkiler WT ve NRC mutant 5 dpf larvaları ışık ON ve OFF. Her bir eser, her genotip 120 bireysel balık 480 yanıtların ortalama temsil eder. NRC mutantlar ortalama lokomotor davranış (pembe izleri) biraz WT balık (mavi izlerini) ile karşılaştırıldığında azalır ama uyaran KAPALI ışığında aşağıdaki dinç kalır. ON ON WT balık tepki ışığa göre ışık NRC mutant yanıt yavaş yükselme zamanı unutmayın .

<ol>
	<li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant.">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish.">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li></ol>

Film gösteren deneysel prosedürleri WT balık bütün temsilcisi. Ancak, bu deneyler de mutant balık (temsili bir sonuç bölümüne bakınız) analog olarak yapılabilir. Biz optimal kontrol amaçlı bir denetimi kurulu anahat aynı plaka plaka WT balık ve mutant balık öneririz. WT balık aynı plaka üzerinde mutant balık, balık türü, her bir kuyunun kaplama ne yazmak emin olun. Burada her iyi kaplama balık (veri levha ile not defteri göster) takip etmek için nasıl bir öneri. Ayrıca, bu günün aynı zamand...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microplate devices</td>
<td>Tool</td>
<td>Whatman</td>
<td>7701-1651</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipetes</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>202205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish water</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>refer to reference #4</td>
</tr>
<tr>
<td>Recording chambers (Zebrabox)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Videotrack Software</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities 

Optokinetik refleks (okr) temel bir görme refleksi en omurgalılar tarafından sergilenen ve görsel sahne göreceli göz istikrara önemli bir rol oynar. Ancak okr, bir hayvan hareketli çizgiler tespit gerektirir ve bir okr sergi için başarısız balık tamamen kör olmayabilir mümkündür. Bir zebrafish mutant, hiçbir optokinetik yanıt c (NRC), herhangi bir ışık koşulları altında test edilmiş ve tamamen kör olduğu bildirildi hiçbir okr vardır. Daha önce, bu mutant OFF-ganglion hücre aktivitesi kaydedilebilir olduğunu göstermiştir. NRC mutant olarak hiçbir okr mutant balık, basit ışık artışlarla ve görsel motor davranış assay (VMR) geliştirdi azaltır tespit olup olmadığını belirlemek için. Bu testte, tek Zebra balığı larvaları otomatik bir video izleme sistemi kullanılarak larvaların eş zamanlı izleme sağlayan bir 96 plaka her kuyuda yerleştirilir. 30 dakika ve 30 dakika hafif OFF ışığı her larva lokomotor yanıtları kaydedildi ve ölçüldü. WT balık, irkilme tepkisi olarak bilinen, alt daha bazal aktivite dönüşü takip ON ışıklar, motor aktivite kısa bir başak üzerine bir dondurma olarak adlandırılan. WT balık (birkaç dakika içinde) başlangıç ​​lokomotor aktivite dönmek de keskin ışıklar kapalı aşağıdaki hemen lokomotor aktivite artışı ve ancak yavaş yavaş. NRC mutantlar WT balık gibi KAPALI ışığa benzer bir tepki, ama WT balık ile karşılaştırıldığında ortalama aktivite hafif bir azalma gösterebilir. NRC mutantlar ON ışığa tepki olarak motor aktivitede gecikmiş ve halsiz. NRC mutant yanıt yanıt ON WT ışık lambası yavaş bir yükselme zamanı vardır. NRC balık tamamen kör olduğunu işaret etmektedir. Teleosts olmayan retina dokuları ışık tespit Çünkü, biz ışık yoğunluğu değişiklikleri hemen davranışsal tepkilerin tamamen gelişiminin erken evrelerinde gözleri eksikliği chokh (chk) mutantlar kullanarak sağlam göz gerektirir doğruladı. Bizim VMR tayininde, chk mutantlar lateral gözler, bu davranışı aracılık gösteren ya ON ışık ya da KAPALI hiçbir irkilme tepkisi gösterir. VMR testi burada ışık şiddetlerinde değişikliklere yanıt Zebra balığı larvalarının yeteneğini test değildir köklü okr tahlil tamamlar nitelendirdi. Ayrıca, VMR testinin otomasyon ışık şiddeti tahrik görsel tepkiler kusurları için yüksek verimlilik tarama kendisini katıyor.

Watch this Scientific Journal Video about A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities at JoVE.com

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

Görsel-Motor Yanıt hafif artışlarla ve azaltır yanıt larva zebrafish motor çıkışını ölçmek için geliştirdi. Biz de dahil olmak üzere başka bir görme testi optokinetik refleks tarafından test edildiğinde tamamen kör olduğu düşünülüyordu optokinetik yanıt (NRC) mutantlar, hiçbir zebrafish vizyon mutant inceledi.

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

a-behavioral-assay-to-measure-responsiveness-zebrafish-to-changes

Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

16.2K Görüntüleme.  Harvard. Görsel-Motor Yanıt hafif artışlarla ve azaltır yanıt larva zebrafish motor çıkışını ölçmek için geliştirdi. Biz de dahil olmak üzere başka bir görme testi optokinetik refleks tarafından test edildiğinde tamamen kör olduğu düşünülüyordu optokinetik yanıt (NRC) mutantlar, hiçbir zebrafish vizyon mutant inceledi.

Video: A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biyoloji

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Dalga boyundaki ve Oksidatif Stres Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık Terapisi şiddetler bir Range Etkilerinin Değerlendirilmesi için Yöntemi<em&gt; İn Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

Ramsay Testi Kullanımı sıvı salgılanması ve İyon Flux fiyatlar Tedbir<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighi Tübül

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...