Biz proje için bir yorum ve öneriler sunmak için Visual Analytics (VIVA) Vancouver Enstitüsü üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Özellikle, biz, John Dereotu, Brian Fisher ve David Darvill teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, verdikleri destek ve yararlı tartışmalar için Kollmann laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Alerji Enstitüsü ve Bulaşıcı Hastalıklar, Ulusal Sağlık Hibe N01 AI50023 Enstitüsü tarafından desteklenen; allerjen NCE Hibeler 07-A1A ve 07-B2B ve Michael Smith Sağlık Araştırma Vakfı. TRK Hasta Çocuk Vakfı, Çocuk ve Aile Araştırma Enstitüsü ile işbirliği içinde, Sağlık Araştırma Eğitim Kanada Çocuk Sağlığı Klinisyen Scientist Programı Hibe için Kanadalı bir Enstitüleri tarafından Burroughs Wellcome Fonu reklam Biyomedikal Bilim Kariyer Ödülü, (kısmen desteklenir British Columbia), Kadın ve Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü (Alberta) ve Manitoba Çocuk Sağlığı Enstitüsü.

1. Keşif-tabanlı Tableau Analizi <ol><li> Bir veri kümesi varsa ve içinde veri sütunları arasında çeşitli ilişkiler keşfetmek istiyorsanız. <ol><li> (Şekil 1) &#39;verilere bağlanma&#39; tıklayarak veri kümesi alma. Veri kaynağı türünü seçin ve veri kümesi almak için yönergeleri izleyin. </li><li> (Şekil 1) önlemler raf dataset sayısal sütunları içerir boyutları raf kategorik sütun içerdiğini emin olun. Bazen teselsül ise konu tanımlayıcı olarak bir boyut sütun tedbir olarak listelenmiş olabilir. Üzerine sağ tıklayarak boyutları değiştirin ve &#39;Boyuta Dönüştür&#39; seçeneğini belirleyin. Şekil 1, uyaran konsantrasyon seviyesi ve konu tanımlayıcıları olarak dataset kategorik sütun boyutları raf doğru yerleştirilir ve sitokin gözlenen konsantrasyon doğru önlemler rafa yerleştirilir. </li><li> (Şekil 2) analiz işlemi sırasında, hesaplanmış bir alana ihtiyaç duyulması halinde, sadece boyutları ya da önlemler raf ya da sağ tıklatın ve &#39;Hesaplanmış Alan&#39;ı oluşturun&#39; seçeneğini seçin. Formül kutusunda, fonksiyonlar ya da matematiksel işlemleri ile birlikte alanları ile hesaplama Giriş. Şekil 2 PFD2, PFD3 ve PFD4 değerleri bir araya&gt; 2 PFD olarak adlandırılan yeni bir alan oluşturmak için nasıl gösterir. </li><li> (Şekil 3) bir boyut ve ilgi bir ölçüsüdür, tipik bir 2-B Tableau arsa oluşturun. Arayüzü basit bir sürükle-bırak etkileşim sunduğu için, ölçü ve ölçü seçimi kolayca değiştirilebilir. Boyutları genellikle satır sütun raf, ve tedbirler raf yerleştirilir. Şekil 3, boyutları raf uyaran konsantrasyon seviyesini içerir ve önlemler raf sitokinlerin gözlenen konsantrasyon seviyesi içerir. </li><li> (Şekil 3) belirli bir boyut, yer görselleştirme ayırt etmek için boyut doğasına bağlı olarak, metin, renk veya boyutunu raf boyut etiket,. Metin raf seçilen boyut tarafından sağlanan metin bilgi etiketleme veri görselleştirme ayırt etmek için çalışır. Renk ve boyut raf her raf alt kısmında bulunan kaydırma çubuğu ile ayarlanabilir renk ve boyut verileri otomatik olarak ayırt. Şekil 3, renk raf genotip yerleştirerek farklı renklerde üç genotipleri ayrılmasına yol açar. </li><li> Diğer boyut belirli sütun değişkenler tarafından görselleştirme Filtresi (Şekil 3). Bu boyut etiketi filtre raf içine sürükleyerek yapılabilir. Değerlerin listesini seçmek için bir pencere belirecektir. Seçilen değer görselleştirme kalan tek değerleri olacaktır. </li><li> (Şekil 4) diğer boyut görselleştirme birleştirmek veya görselleştirme bir matris üretmek için ölçmek olabilir. Bu sütun raf birden fazla boyutlar bırakarak ve birden fazla satır raf önlemler yapılabilir. Şekil 4, iki farklı boyutta sütunları raf koyarak, iki sütunlu bir görselleştirme matris bir örnek içerir. </li><li> Benzer bir görselleştirme üretmek için, sol alt köşedeki Geçerli sayfanın sağ tıklatın ve &#39;kopya sayfa seçilir. </li><li> Veriler hakkında yeni bir hipotez oluşturmaya yardımcı olabilir ilginç eğilimler ya da aykırı belirlemek için analiz süreci yineleme. </li></ol></li><li> Aynı kaynaktan birden fazla veri kümesi var ve bu veri setleri arasındaki olası bağlantıları keşfetmek istiyorsanız. <ol><li> Tableau aynı bağlantı üzerinden bu veri kümesi bağlanmak için izin vermek için, aynı çalışma kitabında bir aynı kaynaktan, yani yerde iki elektronik tablolar birden fazla veri setleri yerleştirin. </li><li> (Şekil 5) Birden fazla veri setleri için aynı boyutları seçili olduğundan emin olun, anahtar değerleri mantıksal birleştirme yoluyla veri setleri bağlayın. Şekil 5, katıldığınız için beş temel değerleri vardır: hücre tipi, uyaran konsantrasyon seviyesi, sahne ya da grup, uyarıcı, ve konu tanımlayıcısı. </li><li> Bölüm 1.1 &#39;e benzer bir analiz yapın. </li></ol></li></ol> 2. Sunum Gereksinimler <ol><li> Veriler arasındaki ilişkileri bilmek, ancak hızlı bir şekilde sunumu için görselleştirme bir listesini oluşturmak için mümkün olmak istiyorum. <ol><li> Bölüm 1.1 &#39;de belirtilen protokol izleyin, ve buna göre görselleştirme açıklama. </li><li> Görselleştirme görüntüleri üretmek için Tableau ihracat fonksiyonu kullanın. </li></ol></li><li> Güçlü görselleştirme Tableau çalışma kitabındaki bir dizi oluşturulur ve bu çalışma kitabı paylaşmak istiyorum. <ol><li> Tableau ambalajlı çalışma kitabı olarak çalışma kitabını kaydedin ve bu dosyayı paylaşmak. </li><li> Tableau Masaüstü olmadan Meslektaşlarım paketlenmiş bir çalışma kitabını açmak için Tableau Reader&#39;ı ücretsiz indirebilirsiniz. Tableau Okuyucu, meslektaşları yarattığı görselleştirme ile etkileşim sağlar. </li></ol></li></ol> 3. TEMSİLCİSİ SONUÇLAR <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 A ekranExcel dosyası demo.xls NFKBIA adlı tablo ithal sonra Tableau. Boyutları ve önlemler raflara doğru sırasıyla, kategorik ve sayısal veri ile doldurulur. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Hesaplanmış Alan pencere Tableau olarak kullanmak için özel bir hesaplanan alan oluşturmak için çağrılır. Sol alt kutusunda liste tanımlamak mümkün alanlarda yardımcı olur ve sağ taraftaki liste, formülde kullanılan işlevleri kısaltma içerir. Bu örnekte, PFD&gt; 2 olarak işaret ettiği nihai bir değer elde etmek için PFD4, PFD3 ve PFD2 değerler eklemek istedim <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 uyaran konsantrasyon seviyesi vs gözlenen sitokin konsantrasyon Görselleştirme. Görselleştirme uyaran 3M-002 farklı konsantrasyon seviyeleri sitokin TNF-α yoğunluklara karşı bir komplo gösterir. Çizgilerin renkleri NFKBIA gen, doğuştan gelen bağışıklık çalışmada bireylerin bir tek nükleotid polimorfizmi için farklı genotipleri bakın. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4, iki sütunlu bir görselleştirme matris bir ekran görüntüsü . Biz iki uyaranlara, 3M-003 ve LPS verilen yanıtlar bir yan-yana karşılaştırma kolaylaştırmak için bir iki sütunlu bir matris oluşturulur. X-eksenleri iki uyaranların farklı konsantrasyon düzeyleri, ve y-ekseni araziler hesaplanan alan değerleri, PFD&gt; 2. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 Bu Tableau pencerelerde farklı tablolarınızda kaydedilen veriler nasıl bağlanacağını göstermektedir. Farklı elektronik tablolar bağlanma veriler bu anahtar değerleri kullanarak, mantıksal katılmak hükümler birleştirerek yapılabilir. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="10"> Görselleştirme ve Analiz Aracı </td></tr><tr><td> Fonksiyon </td><td> Tablo </td><td> VIS-STAMP </td><td> xmdvtool </td><td> GGobi </td><td> Yıldız ışığı </td><td> Gapminder </td><td> Visulab </td><td> InfoVis Toolkit </td><td> Geotime </td><td> Ilham vermek </td></tr><tr><td> Paralel araziler koordine </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td></tr><tr><td> Scatter plot matrisler </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td></tr><tr><td> Boyutlu azalma </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td></tr><tr><td> Geçici boyutları </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td></tr><tr><td> Geospatial boyutları </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Yok </td></tr><tr><td> Metin madenciliği </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Evet </td></tr><tr><td> Doğrudan veri manipülasyonu </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Yok </td></tr><tr><td> Süzme </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td></tr><tr><td> Genişletilebilirlik diğer platformlar için (örneğin, R) </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td></tr><tr><td> CSV tablo biçimleri </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td></tr><tr><td> XML veri formatları </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok </td></tr><tr><td> 1 ile başa çıkabilirim0000 + satır </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Evet </td></tr><tr><td> Belgeleme </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td></tr><tr><td> Ticari ürün </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Yok </td><td> Evet </td><td> Evet </td></tr></tbody></table> Tablo 1. görsel analiz araçları ve bazı özellikler listesi.

<ol>
	<li>Thomas, J., Cook, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Path:+The+Research+and+Development+Agenda+for+Visual+Analytics.">Illuminating the Path: The Research and Development Agenda for Visual Analytics.</a> , (2005).</li><li>Steed, C., Swan, J., Jankun-Kelly, T., Fitzpatrick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+Analysis+of+Hurricane+Trends+Using+Statistical+Processes+Integrated+with+Interactive+Parallel+Coordinates.">Guided Analysis of Hurricane Trends Using Statistical Processes Integrated with Interactive Parallel Coordinates.</a> IEEE Symposium on Visual Analytics Science and Technology. , 19-26 (2009).</li><li>Saraiya, P., North, C., Lam, V., Duca, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Insight-Based+Longitudinal+Study+of+Visual+Analytics.">An Insight-Based Longitudinal Study of Visual Analytics.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 12, 1511-1522 (2006).</li><li>Kollmann, T. R., Crabtree, J., Rein-Weston, A., Blimkie, D., Thommai, F., Wang, X. Y., Lavoie, P. M., Furlong, J., Fortuno, E. S., Hajjar, A. M., Hawkins, N. R., Self, S. G., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+innate+TLR-mediated+responses+are+distinct+from+those+of+adults.">Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults.</a> J. Immunol. 183, 7150-7160 (2009).</li></ol>

Modern biyomedikal araştırma yüksek verimlilik teknolojisinin gelişiyle araştırma verileri daha verimli bir şekilde analiz gerektiren bir patlamaya yol açtı. Visual analitik (VA), analitik akıl interaktif görsel arayüzleri (1) kolaylaştırdı bilim dalıdır. VA yaklaşım bilgisayar tarafından kalıplarını tespit etmek için geleneksel yaklaşımın aksine, insan analisti elinde analitik güç, geri yükler. Visual analitik savunma araştırma (1) ve kasırga eğilimleri (2) gibi çeşitli alanları, ar...

facilitating the analysis of immunological data with visual analytic techniques

Visual analitik (VA), interaktif görsel ekran üzerinden büyük veri analiz etmek için yeni bir yol olarak ortaya çıkmıştır. Biz programı ve biyolojik veri setlerinin analizi VA yaklaşımın esnekliği göstermiştir. Immünoloji, bu veri setlerinin Örnekler flow sitometri, LUMINEX veri ve genotipleme (örneğin, tek nükleotid polimorfizmi) verileri içerir. Geleneksel bilgi görselleştirme yaklaşımının aksine, VA, analist, gerçek zamanlı veri arama sürecinde yapmaya izin vererek analistin elinde analiz gücünü tekrar geri kazandırır. Biz, çeşitli VA araçları değerlendirdikten sonra Tableau adlı VA yazılım seçti. İki tür veri setleri içinde ve arasında analiz analiz görevleri eşleştirilmiş analizi olarak adlandırılan bir yaklaşım kullanarak video sunumu gösterildi. VA olarak tanımlanan Eşleştirilmiş analizi, bir VA aracı uzmanı analizi sırasında bir etki alanı uzmanı ile yan yana çalıştığı bir analiz yaklaşımı. Etki alanı uzman verilerin önemini anlıyor ve toplanan verilerin ele sorular sorar. Aracı uzman daha sonra, bu sorulara cevap olabilecek veri desenleri bulmanıza yardımcı olmak için görselleştirme oluşturur. Hipotez üretme ve verilerin hızlı bir görsel ekran arasında kısa bir gecikme süresi VA yaklaşımın en önemli avantajlarından biridir.

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques at JoVE.com

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analitik (VA), etkileşimli veri analiz yeni bir yaklaşım. Bu video, yüksek verimli biyolojik deneyler tarafından getirilen veri aşırı sorunu tartışmak ve bu soruna bir çözüm olarak VA teklif. Içinde ve immünolojik veri setleri arasındaki Tableau denilen bir VA aracını kullanarak video analizi göstermektedir.

Visual Analitik Teknikleri ile İmmünolojik Veri Analizi kolaylaştırılması

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

facilitating-analysis-immunological-data-with-visual-analytic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K Görüntüleme.  University of British Columbia. Visual analitik (VA), etkileşimli veri analiz yeni bir yaklaşım. Bu video, yüksek verimli biyolojik deneyler tarafından getirilen veri aşırı sorunu tartışmak ve bu soruna bir çözüm olarak VA teklif. Içinde ve immünolojik veri setleri arasındaki Tableau denilen bir VA aracını kullanarak video analizi göstermektedir.

Video: Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Çift Renkli Zaman-kapılı Uyarılmış Emisyon tükenmesi (STED) Nanoscopy tarafından İmmünoloji Synapse görselleştirme

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically explore characteristics of their cellular samples. However, these technological advancements yield high-dimensional data sets that have become increasingly difficult to analyze objectively within traditional manual-based gating programs. In order to better analyze and present data, scientists partner with bioinformaticians with expertise in analyzing high-dimensional data to parse their flow cytometry data. While these methods have been shown to be highly valuable in studying flow cytometry, they have yet to be incorporated in a straightforward and easy-to-use package for scientists who lack computational or programming expertise. To address this need, we have developed ExCYT, a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that streamlines the analysis of high-dimensional flow cytometry data by implementing commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction by t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots. Additionally, ExCYT provides traditional gating options of select populations of interest for further t-SNE and clustering analysis as well as the ability to apply gates directly on t-SNE plots. The software provides the additional advantage of working with either compensated or uncompensated FCS files. In the event that post-acquisition compensation is required, the user can choose to provide the program a directory of single stains and an unstained sample. The program detects positive events in all channels and uses this select data to more objectively calculate the compensation matrix. In summary, ExCYT provides a comprehensive analysis pipeline to take flow cytometry data in the form of FCS files and allow any individual, regardless of computational training, to use the latest algorithmic approaches in understanding their data.

ExCYT is a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that allows users to analyze their flow cytometry data via commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction via t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots.

ExCYT: yüksek boyutlu sitometresi veri analizi düzene için bir grafik kullanıcı arabirimi

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Fare Buzağılarına Tutarlı Masaj Benzeri Pertürbasyonların Uygulanması ve Bunun Sonucu Kas içi Basınç Değişikliklerinin İzlenmesi

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...