Bu protokol, tek T hücreleri ve katı parçacıklar kullanarak AFM kantilevers işlevselleştirmek için en iyi nasıl açıklanır. Bu ipuçları daha sonra tek çift dendritik hücre-T hücre etkileşimlerini araştırmak ve sırasıyla değişken boyuttaki hücresel yanıtları izlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, tek T hücreli fonksiyonelleştirme için biyouyumlu bir tutkal kullanmasıdır.
Bu tutkal ökaryotik hücrelere inert, böylece onların temel aktivasyon aşamasında T hücreleri tutmak. Bu yöntemler, bağışıklık hücresi aktivasyonu ve immün sinaps oluşumu gibi karmaşık hücreler arası olaylar hakkında bilgi sağlar. Yöntemler, hücre hücresi veya hücre-yüzey etkileşimlerini içeren diğer sistemlere de genişletilebilir.
Bu teknik için yeni olan biri için, T hücrelerinin kullanmadan önce iyi durumda olduğundan ve bir gecede IL-2 ile ön işlem den önce olduğundan emin olmak önemlidir. Ayrıca, biyouyumlu tutkal kullanırken, gereksiz oksidasyon onu korumak için hızlı hareket. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolü ile birlikte izleyerek mikroskopi için tek T hücreleri hazırlayın.
Daha sonra DC2.4 hücreleri ile tohumlanmış cam kapaklar hazırlayın ve hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 CO2'de nemli bir odada kuluçkaya yatırın. Piranha tedavisi, plazma temizliği veya UV-ozon temizliği kullanarak düşük yay sabiti ile yumuşak, tüysüz kantilleri temizleyin. Ardından, temizlenmiş kantili AFM tarama kafasına monte edin.
Sonra, temiz bir örnek odası hazırlamak ve saf su ile doldurun. Kantilever hassasiyetini elde etmek için ilk cam substrat üzerinde bir kuvvet eğrisi çalıştırarak su çözeltisi içinde kantili kalibre. Daha sonra, bahar sabitini çıkarmak için termal gürültü spektrumu kaydedin.
Kantili düzgün kalibre edildiğinde, AFM tarama kafasını çözümden çıkarın. Monte edilmiş kantili birkaç damla saf etanolle yıkayın ve kantili tarama başlığında kuru tutun. Canlı bir hücre ortamını %5 CO2 ile 37 dereceye ısıtın.
Daha sonra, dc2.4 hücreleri ile tohumlu cam kapaklı monte örnek oda montaj, ve hemen hazne orta B 600 mikrolitre ekleyin. Tamamlanmış montajı AFM örnek aşamasına yerleştirin. Örnek haznesine insan IL-2-inkübül CD4-pozitif T hücreleri ekleyin.
Hedefleme eden T hücreleri kapağın altına tamamen yerleşene kadar bekleyin ve sonra hücreleri mikroskop altında görüş alanına getirin. Şimdi, bir pipet ile monte kantilever sonuna biyouyumlu tutkal iki mikrolitre damla ekleyin. Biyouyumlu tutkal kantilever uygulandıktan sonra, yapışmaen en üst düzeye çıkarmak için sonraki adımları mümkün olan en kısa sürede tamamlanması gerekir.
Tarama kafasını hızlı bir şekilde örnek aşamasına yerleştirin ve tutkal kaplı kantiliyi çözeltiye batırın. Bir sağlık T hücresi cantilever ucu altında bulunana kadar örnek aşamasını taşıyın. Daha sonra, tarama kafasını hareket ettirerek konumunu hassas bir şekilde ayarlayın.
Ardından, kantilever'i el ile indirin. 50 mikronluk bir adım boyutuyla başlayın ve ardından cantilever görüntüsünün keskinliğinde belirtildiği gibi kademeli olarak 10, beş ve iki ve son olarak 0,5 mikrona düşürün. Şimdi, step motorların konumunu tutun ve tarama kafasının konumunu daha iyi kantilever ucu ve hücre hizalamak için ayarlayın.
0,5 ila 1,5 nanonewton'luk tipik bir kuvvete karşılık gelen lazerin konumunun küçük bir yer değiştirmesi ile sağlam temas gösterilene kadar devam edin. 30 saniye lik temastan sonra, kantiligeri çekilin. Hücre cantilever ile hareket ederse, eki başarılı oldu.
Değilse, yeni bir kantilever geçmeden önce üç kez yapışma adım tekrarlayın. Ekli T hücresini, örnek aşamayı ve tarama kafasını hareket ettirerek DC2.4 hücresinin üzerine yerleştirin. Uygun parametreleri ayarladıktan sonra, numune üzerinde kuvvet spektroskopisi çalıştırın.
Yeni bir sonlama turu için, yeni, temiz bir kantilever monte edin. Saf suda kalibre edin ve sonra T hücre-dendritik hücre çiftine geri dön ve tkanı tekrarlayın. Temizlenmiş bir cam kapak slip'i numune odası montajına monte edin.
Kapağın sol tarafına, etanol le seyreltilmiş ve altı mikron çapında polistiren boncuklar içeren bir damla boncuk çözeltisi ekleyin. Çözücü buharlaştıktan sonra, 20 x hedefiyle donatılmış parlak alanlı bir mikroskop kullanarak boncukların aralıklarını kontrol edin. Tek tek boncukların iyi bir şekilde ayrıldığından emin olun.
Daha sonra, iyi karışık epoksi tutkal içine bir mikropipet ucu veya kürdan daldırma ve sağ tarafta ardışık nazik dokunuşlar ile üç ayrı noktalar tutkal küçük bir miktar aktarın ama kapak merkezine yakın, burada gösterildiği gibi. Daha sonra, Temizlenmiş, tüysüz bir kantiliyi AFM tarama kafasına monte edin ve yay sabitini elde etmek için temiz bir yüzeyle havada kalibre edin. Daha sonra, son epoksi tutkal noktanın sol sınırı üzerinde cantilever ucu konumlandırın ve yavaş yavaş step motorlarda küçük adım boyutları kullanarak tutkal yakın cantilever getirmek.
Tutkalla temas yapıldıktan sonra, AFM tarama kafasını geriye doğru hareket ettirerek kantili yanal olarak hızlıca çekin. Ucun sonunda tutkal sadece küçük bir miktar bırakarak, cama sürtünerek herhangi bir aşırı tutkal çıkarın. Şimdi, iyi izole edilmiş bir kabın üzerine kantilever ucunu hareket ettirin.
Tek boncuk yavaş yavaş yaklaşın ve yaklaşık 10 saniye boyunca iki ila beş nanonewton aralığında onunla sağlam bir temas kurun. Temas ederken, kabı ucun en ucunda konumlandırmak için ince uç ayarı kullanın. İlgili temasın sonundaki ucu geri çekin.
Boncuk orijinal odak düzleminden kaybolursa, başarılı bir yapışma olayı meydana gelmiştir. Son olarak, boncuk modifiye cantilever dikkatle demount ve epoksi tam tedavi için bir gecede bir cantilever kutusunda saklayın. Burada, tek bir T hücresi ile tek bir dendritik hücre arasındaki bağlama etkileşiminden tipik kuvvet-uzaklık eğrileri bir yaklaşım-geri çekme döngüsü boyunca dır.
Açık kırmızı eğri uzatma eğrisi, koyu kırmızı eğri ise geri çekme eğrisidir. Eğrideki minimum değer, T hücresi ile dendritik hücre arasındaki maksimum yapışma kuvvetinin ölçüsünü verir ve eğrinin altındaki alan onları ayırmak için gereken işi temsil eder. Keskin ve adım adım yırtMa olayları, hücre-hücre arabirimindeki güçlü bağlanma nedeniyle hücre yüzeyinden çıkarılan ve sürekli çekme nin altında ayrı ayrı kırılan membran teterrler olarak yorumlanabilir.
Burada, dendritik hücrelere bağlanan konvansiyonel T hücresi gri, dendritik hücrelere düzenleyici T hücresi bağlanması mavi renkte gösterilir. Geleneksel bir T hücresi ile düzenleyici bir T hücresi arasındaki yapışma kuvvetleri, antijen sunan hücreler tarafından sunulan peptid antijenlerini tanırken, düzenleyici T hücreleri bağışıklık reaksiyonunun sonuna doğru konvansiyonel T hücre aracılı bağışıklığı kapatan baskılayıcı T hücreleridir. Fagoessentetiketli fagositik RAW264.7 hücresinin bu şeması, hücreye tek bir çıplak, altı mikron çapında polistiren boncukla yaklaşıldığını gösterir.
Boncuk çekici üzerine, membran PIP2 temas yerinde sıralanır, b yakın, daha sonra moesin membran işe neden olur, fagositik bir olay ile sonuçlanan. Burada açıklanan prosedüre ek olarak, AFM tabanlı tek hücreli kuvvet spektroskopisi tek hücreli düzeyde gerçek zamanlı olarak immün hücre aktivasyonunu incelemek için floresan görüntüleme ile birlikte kullanılabilir. Kombine floresan teknikleri, Bu yöntem gerçek zamanlı olarak daha karmaşık hücresel süreçleri ele sağlar, dendritik hücre ve T hücre çifti arasında bir bağışıklık sinaps oluşumu gibi.
