Yazarlar Oynamadı-Cellobioside substrat sağlamak için Dr. Steve Withers ve Hong-Ming Chen teşekkür etmek istiyorum.

Bu protokol başlamadan önce, 384 plaka formatında saklanan metagenomic kütüphane gerekecektir. Bizim çalışmamızda, faj T1 dayanıklı TransforMax EPI300-T1 R E. ile birlikte pCC1 kopyasını fosmid vektör kontrolü kütüphane host ve -80 ° C 11 plakalar saklanır gibi coli hücrelerinde. 1. Metagenomic Kütüphane Tabaklar çoğaltılması <ol><li> Defrost 37 adresinde kütüphane içeren plakalar ° C&#39;de yaklaşık 20 dakika kadar veya tüm kuyuları çözülmüş. </li><li> QPix2 UV ışık sterilizasyon özelliği, 15 dakika süreyle robot sterilize etmek için kullanın. </li><li> 500ml reaktif şişesi 100ug/mL 12.5ug/mL ve arabinoz final konsantrasyonda kloramfenikol ile LB suyu hazırlayın. Her plaka yaklaşık 20ml, artı ölü hacim izin vermek için ek bir 50ml yapmak. </li><li> QFill3 medya şişe steril tüp yoluyla manifolduna bağlı başına üreticinin talimatlarına olarak ayarlayın. Için uygun ortam miktarı Programı, her kuyuda bir 45uL hacmi doldurmak için ayarlayın. </li><li> Medya manifoldu her pin gelen görünür kadar robot tasfiye özelliğini kullanarak tüp ve manifolddan hava temizleyin. </li><li> QFill3 kullanarak LB medya ile istenilen sayıda plaka doldurun. Her plaka doldurmak için yaklaşık 20 saniye sürer. </li><li> QPix2 robot uygun alanlara kütüphane plakaları ve taze plakaları yükleyin. % 2 Micro90 arka hamamı, orta banyosunda distile su otoklava,% 80 etanol ön banyo; uygun reaktifler ile temizleme banyoları doldurun. </li><li> QPix2 &quot;Klonlanması&quot; programını kullanın. Yazılım, kaynak plakaları ve hedef plakaları uygun kafa, sayı ve türlerini seçin. Ayrıca, her banyo, tekrarlamalı, genelde 6 kür arasında temiz başkanı ayarlamak yeterli olacaktır. Makine Kapasitesi, bir seferde 10 plaklık ve 384 iğne başı (ya da 96 iğne başı ile yaklaşık 50 dakika) ile tüm bunları çoğaltmak için yaklaşık 15 dakika sürer. Not: &quot;Hedef karıştırın&quot; &quot;Kaynak karıştırın&quot; ya da bir seçenek yoktur. Bu sorunları bizim robot onları kullanarak önceden meydana gelmiş gibi bu seçenekleri kullanmak için tavsiye edilir. </li><li> Plakalar çoğaltılır sonra 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca nem kutusu plakalar büyüyecek. Arabinoz ilavesi ile yüksek bir kopya sayısı fosmid inducing olduğundan, klonlar dışı kaynaklı klonlar daha yavaş büyürler. -80 ° C&#39;ye kadar kütüphane plakaları Not: nem kutusu Kuluçka medya buharlaşma tüm kuyuları için tek tip bir ortamda tutulması, plakaların kenarında kuyularda oluşmaz sağlar. </li><li> QFill3 robot ilk su (~ 50 ml) ve% 80 etanol (~ 50 ml) ile tasfiye ederek temizleyin. Bileşenleri sökün ve alüminyum folyo sarılı şişe, kapak ve tüp temiz ve otoklav. </li></ol> 2. E. Büyüme Ölçme coli Klonlar <ol><li> 37 ° C inkübatör plakaları çıkarın. Çıkarın ve maksimum 25 plakaların, RapidStak ile sağlanan dergisi yükleme platformu üzerine, kapaklar, ve yer plakaları bir kenara koyun. Not: yığının altındaki plaka okunacak ilk olacak. Plakalar sırasını takip yazılımı bu yazmaz olarak emin olun. </li><li> Rapid Stak bir dergi çıkarın, boş olduğundan emin olun ve plakaları okunacak yığınının üzerine itin. Kolundan tut ve plakalar dergi içine yüklenmiş olması gerekir. RapidStak dergisi yükleyin. Not: Derginin plakaların A1 kuyu gitmeli hangi köşede gösteren köşesinde küçük bir vida vardır. Dergi, sadece tek bir yönde RapidStak monte edecek. </li><li> Makinelere bağlı olan bilgisayarda SkanIt RE programını açın. &quot;Yeni Oturum&quot; seçin ve uygun şekilde isim. Plaka tipi olarak &quot;Corning Daire Alt 384-plaka&quot; seçin. </li><li> &quot;Plaka Düzen&quot; alanında, &quot;Sihirbaz&quot; butonunu seçin ve plaka 384 bilinmeyenli eklemek için seçin. </li><li> &quot;Protokol&quot; alanında, &quot;Well Loop&quot; seçeneğini seçin ve 384 kuyu için girin. &quot;Well Loop&quot; simgesi ekranın sol tarafındaki akış ağacında görünür. Simgesini seçin ve &quot;Fotometrik Ölçüm&quot; eklemek için tıklayın. 600Nm az okumak için ayarlayın. </li><li> Protokol benzersiz bir ad ile kaydedin ve SkanIt RE programı kapatın. </li><li> Bilgisayarda, PolaraRS programı açın. </li><li> Ana sayfada RapidStak cihaza bağlı araçların listelendiği tablo olacaktır. VarioSkan Bu tablonun sol tarafında olmalıdır. VarioSkan başlığı altında, iki bağlantılar olacak &quot;RunSession&quot; ve &quot;inkübe&quot;. &quot;RunSession&quot; seçeneğini tıklayın. </li><li> Ortada bir akış şeması ile yeni bir pencere, tahlil penceresi görünecektir. &quot;RunSession&quot; kalemi (tek öğe mevcut olmalıdır) seçin. Ekranın sağ tarafında açılan menüdengörünecektir. Bu menüyü çalıştırmak kaydedilen SkanIt RE adını bulun. Not: Bu menüde hiçbir rasyonel sipariş var. Alfabetik veya tarihe göre eklenebilir veya bilgisayarda protokol nerede kaydedilmiş olduğu ile ilgili. Bu bir ağrı kendi bulmadan tüm protokolleri üzerinden bakmak gerekir demektir. </li><li> Bir kez sağ üst köşesinde, protokolü seçili &quot;Bu testte Çalıştır&quot; a tıklayın. </li><li> , Kaynak olarak kullanmak için hangi dergisi göstermek için isteyen bir kutu açılır, ve hangi dergisi boştur. Ekranda alt kutusu ön dergisi için karşılık gelir. [Opsiyonel: Bu zaman alacak miktarı için bir tahmin belirlemek için yüklü plakaların sayısı girmenizi ister. Bu tahmin normal yolu kapalıdır.] </li><li> RapidStak ve VarioSkan açık olduğundan emin olun ve &quot;OK&quot; tuşuna basın. </li><li> RapidStak plakaların sürekli ölçümler için izin veren otomatik plaka okuyucu sizin plakaları yükleyecektir. 25 plakalar okumak için yaklaşık 50 dakika sürer. Not: Bu makinelerin uygun uyum sağlamak için VarioSkan ilk plaka yükleme gözlemlemek için tavsiye edilir. RapidStak plaka okuyucu düzgün yüklenmiyorsa, PolaraRS pencerenin sağ üst köşesindeki &quot;Duraklat Bu testte&quot; butonunu kullanın. </li><li> VarioSkan tüm plakalar okuma yapıldıktan sonra, tam bir dergi çıkarmak ve dergi yükleme platformu üzerine yerleştirin. Platformun dış dikdörtgen yukarı kaldırın ve dergi ortasında bir yığın halinde duran tabak bırakarak, kapalı slayt gerekir. Uygun tabak kapakları değiştirin. </li></ol> 3. Her Plate Test Mix eklenmesi <ol><li> 50mm potasyum asetat tamponu pH 5.5 lizis karışımı premade 10x stok (10% Triton X-100, 100 mM ris, 10mM EDTA) kullanarak tahlil karışımı hazırlayın. Yüzey tamamen çözülmüş olduğundan emin DMSO 75mg/mL DNP cellobioside substrat kadar bir stok hazırlayın. Oynamadı-cellobioside stok solüsyonu 0.1mg/mL bir final konsantrasyon tahlil karışımı ekleyin. Her plaka çözüm yaklaşık 20ml, artı ölü hacim izin vermek için ek bir 50ml yapmak. Not: DNP Cellobioside çözünürlük artar DMSO içinde eriterek, suda kolayca çözünür değildir. Son tahlil çözüm DMSO varlığı hiçbir gözlemlenebilir etkileri vardır. </li><li> QFill3 medya şişe steril tüp yoluyla manifolduna bağlı başına üreticinin talimatlarına olarak ayarlayın. Için uygun ortam miktarı Programı, her kuyuda bir 45uL hacmi doldurmak için ayarlayın. </li><li> Medya manifoldu her pin gelen görünür kadar robot tasfiye özelliğini kullanarak tüp ve manifolddan hava temizleyin. </li><li> QFill3 kullanarak her plaka tahlil karıştırın. Her plaka doldurmak için yaklaşık 20 saniye sürer. </li><li> Tahlil karışımı eklenir sonra, 37 plakalar inkübe ° C nem kutusu 12-16 saat. Not: tahlil karışımı bir kez plakalar üzerinde-inkübasyon eklenir plaka dış kuyu içinde kuyu daha yüksek absorbans okuma alındı ​​buharlaşma neden olacaktır. Bu bir nem odası plakalarının kuluçka tarafından telafi edilebilir. </li></ol> 4. Analiz Edilmiş Klonlar Okuma Absorbans <ol><li> 37 ° C inkübatör plakaları çıkarın. Çıkarın ve maksimum 25 plakaların, RapidStak ile sağlanan dergisi yükleme platformu üzerine, kapaklar, ve yer plakaları bir kenara koyun. Not: yığının altındaki plaka okunacak ilk olacak. Plakalar sırasını takip yazılımı bu yazmaz olarak emin olun. </li><li> Rapid Stak bir dergi çıkarın, boş olduğundan emin olun ve plakaları okunacak yığınının üzerine itin. Kolundan tut ve plakalar dergi içine yüklenmiş olması gerekir. RapidStak dergisi yükleyin. Not: Derginin plakaların A1 kuyu gitmeli hangi köşede gösteren köşesinde küçük bir vida vardır. Dergi, sadece tek bir yönde RapidStak monte edecek. </li><li> Makinelere bağlı olan bilgisayarda SkanIt RE programını açın. &quot;Yeni Oturum&quot; seçin ve uygun şekilde isim. Plaka tipi olarak &quot;Corning Daire Alt 384-plaka&quot; seçin. </li><li> &quot;Plaka Düzen&quot; alanında, &quot;Sihirbaz&quot; butonunu seçin ve plaka 384 bilinmeyenli eklemek için seçin. </li><li> &quot;Protokol&quot; alanında, &quot;Well Loop&quot; seçeneğini seçin ve 384 kuyu için girin. &quot;Well Loop&quot; simgesi ekranın sol tarafındaki akış ağacında görünür. Simgesini seçin ve &quot;Fotometrik Ölçüm&quot; eklemek için tıklayın. 400nm az okumak için ayarlayın. </li><li> Protokol benzersiz bir ad ile kaydedin ve SkanIt RE programı kapatın. </li><li> Bilgisayarda, PolaraRS programı açın. </li><li> Ana sayfada RapidStak cihaza bağlı araçların listelendiği tablo olacaktır. VarioSkan Bu tablonun sol tarafında olmalıdır. VarioSkan başlığı altında, iki bağlantılar olacak &quot;RunSession&quot; ve &quot;Incubate &quot;.&quot; RunSession &quot;seçeneğini tıklayın. </li><li> Ortada bir akış şeması ile yeni bir pencere, tahlil penceresi görünecektir. &quot;RunSession&quot; kalemi (tek öğe mevcut olmalıdır) seçin. Ekranın sağ tarafında bir açılır menü belirecektir. Bu menüyü çalıştırmak kaydedilen SkanIt RE adını bulun. </li><li> Bir kez sağ üst köşesinde, protokolü seçili &quot;Bu testte Çalıştır&quot; a tıklayın. </li><li> , Kaynak olarak kullanmak için hangi dergisi göstermek için isteyen bir kutu açılır, ve hangi dergisi boştur. Ekranda alt kutusu ön dergisi için karşılık gelir. [Opsiyonel: Bu zaman alacak miktarı için bir tahmin belirlemek için yüklü plakaların sayısı girmenizi ister. Bu tahmin normal yolu kapalıdır.] </li><li> RapidStak ve VarioSkan açık olduğundan emin olun ve &quot;OK&quot; tuşuna basın </li><li> RapidStak plakaların sürekli ölçümler için izin veren otomatik plaka okuyucu sizin plakaları yükleyecektir. Not: Bu makinelerin uygun uyum sağlamak için VarioSkan ilk plaka yükleme gözlemlemek için tavsiye edilir. RapidStak plaka okuyucu düzgün yüklenmiyorsa, PolaraRS pencerenin sağ üst köşesindeki &quot;Duraklat Bu testte&quot; butonunu kullanın. </li><li> VarioSkan tüm plakalar okuma yapıldıktan sonra, tam bir dergi çıkarmak ve dergi yükleme platformu üzerine yerleştirin. Platformun dış dikdörtgen yukarı kaldırın ve dergi ortasında bir yığın halinde duran tabak bırakarak, kapalı slayt gerekir. Plakaları laboratuvar prosedürlerine uygun olarak imha edilebilir. </li><li> Absorbans okumaları, açık SkanIt RE yazılımı, ihracat ve &quot;varolan bir dosya Aç&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Listeyi genişletmek için oturumu kaydettiğiniz dizini seçin ve plaka sayısına bağlı olarak &quot;Konteyner N&quot;, &quot;Konteyner 1&quot; etiketli seçenekleri başlığı adı altında olacak &quot;+&quot; simgesine vurdu. Analiz edilecek ilk plaka seçin. </li><li> Sayfanın üst kısmındaki menü çubuğunda, &quot;Veri İşleme&gt; Rapor / Export&quot; seçeneğini seçin </li><li> Ihracat için istediğiniz seçenekleri seçin. Not: Ben genellikle &quot;Plaka Düzen&quot; seçin ve &quot;ihracat için Fotometrik&quot; veri. </li><li> &quot;Görünüm Raporu&quot; ve sonra &quot;Dosya&gt; Kaydet&quot; tıklayınız. İstenilen dizin seçin. Çıkış biçimi, bir Microsoft Excel elektronik tablosu </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Olumlu bir klon içeren tek bir 384 plaka absorbans okumaları bir örnek Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Pozitif klonlar absorbans selülaz aktivitesi ifade edenler üzerinde belirgin bir artış göstermektedir. Tahlil zaman farklılıklar, plaka iyi konum veya DNP konsantrasyonu (un-çözünmüş DNP filtre tarafından tanıtıldı olabilir) mutlak absorbans okumaları etkileyebilir. Selülaz pozitif klonların belirlenmesi plaka ortalama veya sütun ortalaması yukarıda absorbans farkı gibi Bağıl absorbans okumaları, daha sağlam bir yöntem. Kütüphane plakalar pozitif klonların belirlenmesi ardından, ikincil tarama için yeni bir tabak içine tüm olumlu klonlar çoğaltmak için tavsiye edilir. Bu iyi bir konum ya da plaka değişimi kaynaklanan etkileri ortadan kaldırır ve olumlu klonlar arasında daha doğrudan bir karşılaştırma için izin verir. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 metagenomic bir kitaplık için yüksek verimlilik testinin Akış şeması E. klonlanmış coli ve ° C -80 saklanan . <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 adet 384-plaka olumlu bir klon içeren Absorbans okuma. Selülaz pozitif klonların negatif klonları üzerinde önemli ölçüde artmıştır absorbans tarafından tespit edilebilir.

<ol>
	<li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+cellulosic+biofuels.">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li><li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase.">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li><li>Duan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+novel+genes+encoding+acidic+cellulases+from+metagenomes+of+buffalo+rumens.">Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).</li><li>Zhang, Y. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outlook+for+cellulase+improvement:+Screening+and+selection+strategies.">Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.</a> Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+assay+methods:+a+review.">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li><li>Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+easy+method+for+detection+of+microbial+cellulases+on+agar+plates+using+Gram's+Iodine.">A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine.</a> Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).</li><li>Huang, J. S., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+assay+for+cellulase+and+dextranase.">Sensitive assay for cellulase and dextranase.</a> Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).</li><li>Tull, D., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases:+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1,4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi.">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li><li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host.">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production.">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses.">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li><li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+amplifiable+BACs:+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones.">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li><li>Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum.">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li><li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost.">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li></ol>

E. ifade selülolitik aktivitenin büyük bir ekleme genomik DNA metagenomic kütüphane hızlı tespiti için yüksek kapasiteli ekran Bu protokolde coli açıklanmıştır. Bu yöntem, literatürde sıkça kullanılan CMC / Kongo Red tahlil üzerinde bir gelişmedir. Çözüm odaklı ve kantitatif analiz için izin veren bir plaka okuyucu absorbans okumaları son çıkışı ile, 384-kuyucuğu bir pot kimya tarama sağlar. 25 veya daha fazla saat başına 384-kuyu plakaların denetimsiz bir tarama i?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>qPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-pin gridding head</td>
</tr>
<tr>
<td>qFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-well manifold</td>
</tr>
<tr>
<td>Varioskan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RapidStak</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Connected to Varioskan</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro90 Detergent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>18100-00</td>
<td>Diluted to 2% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Major Lab Supplier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluted to 80% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0378</td>
<td>12.5mg/mL in ethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>LB broth, Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1426-2</td>
<td>25g/L, autoclaved</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384-well flat bottom plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3680</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-(+)-Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3256</td>
<td>100mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P171</td>
<td>50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T3253</td>
<td>In TE buffer solution, 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA disodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>In TE buffer solution, 10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Provided by Dr. Steve Withers, UBC</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries

Selüloz, gezegen üzerinde organik karbon en bol kaynak, biyoyakıt üretimi 1 artan bir vurgu ile geniş çaplı endüstriyel uygulamalar vardır. Selüloz değiştirmek veya aşağılamak için kimyasal yöntemler genellikle güçlü asitler ve yüksek sıcaklıklar gerektirir. Bu nedenle, enzimatik yöntemlerle biyolojik dönüşümünün sürecinde önemli hale gelmiştir. Bakteriyel ve fungal izolatlar aktif sellülazlar belirlenmesi biraz etkili olsa da, doğada mikropların büyük çoğunluğunun laboratuar ekimi karşı. Çevre genomik, metagenomic, tarama yaklaşımlar olarak da bilinen yeni biyolojik dönüşümünün enzimleri için arama ekimi boşluğu dolduruyor büyük umutlar var. Metagenomic tarama yaklaşımları başarıyla topraklar 2, manda rumen 3 ve termit, Kongo kırmızı boya (tiyatrosunun ve Ahşap 5 yöntemi dayalı) ile boyanmış, arka-gut 4 kullanarak karboksimetilselüloz (CMC) agar plakları gibi çeşitli ortamlardan roman sellülazlar iyileşti . Ancak, CMC yöntemi hacmi sınırlı, kantitatif değildir ve düşük sinyal gürültü oranı 6 tezahür. Diğer yöntemler 7,8 bildirilen, ancak her kullanımdan büyük ekleme genomik kütüphaneler yüksek verimli tarama için istenmeyen bir agar plaka bazlı analiz,. Burada selüloz aktivite için bir kromojenik dinitrofenol (DNP) cellobioside substrat 9 kullanarak bir çözüm tabanlı ekran mevcut. Bizim kütüphane ile 10 kopya sayısı indüksiyon testinin duyarlılığı artırmak için fosmid pCC1 fotokopi denetim içine klonlandı. Bu yöntem, son okuma absorbans ölçümü olarak sağlanan 384-iyi mikropleytin bir pot kimya kullanır. Bu okuma kadar bir verim ile bağlı istifleme sistemi ile bir sıvı işleyici ve plaka okuyucu kullanarak günde 100X 384-iyi plakaları, kantitatif, hassas ve otomatik.

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries at JoVE.com

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Bu protokol, Escherichia coli olarak ifade metagenomic kütüphane selülolitik faaliyetleri için yüksek kapasiteli ekran açıklanmıştır. Ekran, çözüm odaklı ve yüksek otomasyonlu ve absorbans ölçümü gibi son okuma ile 384 iyi mikropleytin bir pot kimya kullanır.

Yüksek Verimli Ekran Metagenomic Kütüphaneler selülaz Aktivitesi Biomining

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

a-high-throughput-screen-for-biomining-cellulase-activity-from

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Görüntüleme.  University of British Columbia - UBC. Bu protokol, Escherichia coli olarak ifade metagenomic kütüphane selülolitik faaliyetleri için yüksek kapasiteli ekran açıklanmıştır. Ekran, çözüm odaklı ve yüksek otomasyonlu ve absorbans ölçümü gibi son okuma ile 384 iyi mikropleytin bir pot kimya kullanır.

Video: A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Biyoloji

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

Here we describe a method for preparation of both single read and paired end Illumina mRNA-Seq sequencing libraries for gene expression analysis based on T7 linear RNA amplification. This protocol requires only 10 nanograms of starting total RNA and generates highly consistent libraries representing whole transcripts.

10 nanogram Total RNA tek okuyun ve Eşleştirilmiş Sona mRNA-Seq Illumina Kütüphaneler

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;