We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.

NOT: Bu tür deney sistemlerinin verimi mevcut HTS laboratuar ekipmanları bağlıdır. Bu protokol, 96-kuyu formatında sıvı taşıma yapan bir Tecan Freedom EVO 200 robot ile kolaylaştırılır. 384-gözlü formata minyatürleştirme da mümkündür. Robotik sıvı taşıma sistemi tüm deneysel adımlar sırasında aseptik koşullarda korumak için bir laminer akış kaputun altında konumlandırılmış. Herhangi bir sıvı işleme otomasyon mevcut ise, protokol hali hazırda düşük verimli bir formata adapte edilebilir. Birincil Eleme 1. Gün 1: hazırlayın ve Tohum Hücreler Not: Tohum hücreleri, lusiferaz aktivitesi, tohumlama sonra, yani 48 saat tahlil zamanında% 80 izdiham elde edilir. <ol><li> Süspanse% 10 FBS ve% 1 L-glutamin ihtiva eden RPMI içinde 2 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar CHP134-mycn3UTR nöroblastoma hücreleri tripsinize. 27 plakaları için en az 250 ml hazırlamak<html> Hesap sıvı taşıma dikkate alarak hücre süspansiyonu, ölü hacimleri ve tekrarlanan pipetleme adımlarını oluklara. Steril rezervuar içine hücre süspansiyonu dökün ve robot masanın üzerine yerleştirin. </li><li> 9 barkodlu beyaz düz tabanlı 96-kuyu plakaları ve robot masasının üzerine 200 ul steril pipet uçları bir kutu yerleştirin. Yerçekimi altında yerleşen hücreleri önlemek için her muafiyet adımından önce pipetleme hücre süspansiyonu karıştırın. Oyuk başına 1.5 x 10 4 hücrelerinin nihai yoğunluk elde etmek için 9 levhaların her bir kuyunun içine hücreleri 75 ul koyun. </li><li> Kapaklı plakaları örtün ve hücreler, alt tortu olanak sağlamak için 30 dakika boyunca kuluçka dışında bırakın. Bu kenar etkilerini en aza indirmek olacaktır. </li><li> Tekrar 27 plakaları toplam sayısını hazırlamak için iki kez 1.2 ve 1.3 adımları. </li><li> 37 ° C&#39;de plakalar yerleştirin ve% 5 CO2 ve 24 saat daha inkübe edilir. </li></ol> 2. Gün 2: Kütüphane Bileşikler ile Hücreler davranın ntent &quot;&gt; Not: Spektrum Koleksiyonu küçük molekül kütüphane DMSO içinde 10 mM konsantrasyonda 25 96 oyuklu plakalar içinde 8 sıra ve 10 sütundaki düzenlenmiş 2000 bileşiklerden oluşur, ilk ve son sütun üzerine kuyu kontroller için boş bırakılır. . Bileşim tarama tahlilleri tipik olarak 1-10 uM bileşik konsantrasyonu 8 gerçekleştirilir. Burada açıklanan tarama protokolü çalışma konsantrasyonu 2 uM ve analiz edilmesi son nokta olarak 24 saat giderir. <ol><li> Oda sıcaklığında 9 bileşik kütüphane plakaları çözülme. </li><li> Steril PBS ve PBS-% 0.5 DMSO çözümleri ile iki olukları hazırlayın ve robot masanın üzerine koyun. Her bir kütüphane levha için hazırlanması ve buna uygun olarak tek bir seyreltme plakası etiket - en az 400 ul bir çalışma hacmine sahip bir polipropilen U-tabanlı 96-çukurlu plaka. Sıvı eylemci sabit ipuçlarını kullanarak steril PBS 398 ul seyreltme plakaları 11 sütun 2 Her çukurun doldurun. Dolgu sütun 1 ve steril PBS 12 50 ile ulKontrol kuyuları araç konsantrasyonu (% 0.02) yeniden üretilmesi için,% 0.5 DMSO ile. </li><li> İki kütüphane tabak, buna etiketli seyreltme plakaları, 50 ul steril pipet uçları iki kutu ve robot masasına altı hücreleri tabak yerleştirin. Hücreler plakaları ortaya çıkarın. </li><li> Pipet 2, ilgili seyreltme plakası iki kütüphane tabakalarından biri 10 mM stok çözeltisi ul ve iyice karıştırın. Bu 50 uM&#39;lik bir ara bileşikler konsantrasyonu ile sonuçlanır. Uçları aynı kümesini kullanarak hücreleri ile 3 Barkodlanan beyaz 96 gözlü plakalar içinde 50 uM seyreltme 3 ul dağıtmak. Her bir konsantrasyonunu çalışan 2 uM Bu seyreltme şeması sonuçlar bileşik olarak test edilmiştir. NOT: ipuçları ile gereksiz manipülasyonlar önlemek kütüphane plakaları sadece 80 bileşikleri içeren olsa bile, baştan 96 ipuçları tam bir set kullanın. İlk ve kütüphane plakalarının son sütunları boş olduğundan bu mümkün. </li><li> Pipet ipuçları değiştirin ve St tekrarİkinci kütüphane plaka için ep 2.4. </li><li> Hücreler plakaları örtün ve 24 saat için inkübatör onları geri. </li><li> Kalan kütüphane plakaları için 2,3-2,6 iki kez daha Adımları. </li></ol> 3. Gün 3: Lüsiferaz Testi gerçekleştirin Not: lusiferaz deneyi gerçekleştirmeden önce, her bir kuyuya 9 bir hücre canlılığı endeksi elde etmek için resazurin azalmaya dayalı olarak, bir hücre canlılığı deneyi ile multipleks mümkündür. Çoğullama lusiferaz ve canlılık testi hücreleri, lusiferaz aktivitesi yeterince yüksek düzeyde sağlamak, ancak, göz ardı edilebilir, lusiferaz sinyalinin bir azalma deneyleri sonuçları. Lusiferaz aktivitesi sabit lüminesan sinyal ticari ve ev yapımı 10,11 lusiferaz deney reaktif çeşitli saptanabilir. <ol><li> Oda sıcaklığına kadar seçim yeniden lusiferaz reaktif dengelenmesi. Hacmi, tüm tahlil plakalar için yeterli olduğundan emin olun. 27 plaka içinlusiferaz reaktifi s 170 ml hesap sıvı taşıma dikkate alınarak gerekli olacaktır, ölü hacim ve tekrarlanan pipetleme adımlarını oluklara. Bir rezervuar içine lusiferaz reaktif dökün ve robot masanın üzerine yerleştirin. </li><li> , Inkübatör hücreleri ile 9 plakaları çıkarın robot masanın üzerine koyun, ortaya çıkarmak ve oda sıcaklığına dengelendi kadar bekleyin. Plakası ile plaka başına lusiferaz reaktifi 50 ul ekle. Plakalar arasında bir plaka lüminesans okuma süresine eşit bir gecikme. Bu, tüm plakaları reaktif ek eşit zaman aralığında ölçülür güvence altına alacaktır. </li><li> 30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, luminometrede birinci plaka yerleştirmek ve kısa bir çalkalama adımından sonra lüminesans ölçümü. Tüm plakaları için tekrarlayın. Her plaka barkod kaydedin ve ele plakaların çok sayıda kaynaklanan hataları önlemek için ilgili veri dosyasına ilişkilendirmek. </li><li> Tekrar hücreleri ile kalan 18 plakaları için iki kez 3,2-3,3 adımları. </li&gt; <li> Kalan lusiferaz reaktif toplayın ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 4. Gün 4: Veri Analizi <ol><li> On plaka, araçla tedavi edilen kontrollere ortalamasına tüm örneklerin normalleştirme kullanarak işlem deneysel veriler. Her kütüphane bileşik için, üçlü üzerinden ortalama değer x ve SD hesaplamak. </li><li> Seçin regülatör-yukarı ve aşağı düzenleyen ortalama değer x ve SD tüm tahlil işlenmiş değerler üzerinden hesaplanır SD, ve k × ± k X bir eşiği ayarlayarak hit tanımlı sabittir. </li><li> Rasgele bir eşik cut-off &lt;lusiferaz sinyalinin bir azalma muhtemelen bileşik toksisite ile ilişkili olan, araç ile tedavi edilen kontrol grubu% 20 seçin. Bu eşiğin altında hit atarak önemli ölçüde karşı tarama yalancı-pozitif hit bir dizi azaltacaktır. NOT: yerine denetimi tabanlı normalleştirme, deneysel veriler Z skoru ya da sağlam analog B s uygulanarak işlenebilirÇekirdek 12. Buna ek olarak, isabet seçimi için alternatif istatistiksel yaklaşımlar 12 mevcuttur. </li></ol> 5. Karşı-tarama Not: Primer taramada tespit edilen bileşikler doğruladı ve bir karşı tarama ile özgüllüğü için değerlendirilmektedir (&#39;hit &quot;etiketli). <ol><li> Kiraz ilgili düzenini tasarrufu, tek 2D barkodlu tüplerde saklanan alikotları seçilen hit almak ve yeni &quot;plakaları vurmak&quot; yaratmak. Kontroller için ücretsiz pozisyonları bırakmak unutmayın. Not: etkin kiraz toplama sisteminin yokluğunda, tek bir kontrol ve Primer taramada paralel olarak 3 &#39;UTR taşıyan hücreleri hem de test edebilir. Bu durumda, sadece kişiye 3 &#39;UTR bağlı etkileri olan bileşikler söz konusu seçimi, karşı tarama ihtiyacını ortadan kaldırarak Primer taramada sonra mümkün olacaktır. Ancak, iki hücre hatlarında paralel tarama deneyi katına çıkacakmaliyetler. </li><li> Primer tarama protokolüne (Bölüm &quot;1. Gün: hazırlayın ve Tohum hücreler&quot;) sonra, her bir &quot;hit levha&quot; her CHP134-mycn3UTR ve CHP134-CTRL kararlı üç hücre 96 oyuklu plakalar hazırlamak. </li><li> Birincil tarama için protokol (Bölüm &quot;Gün 2: Kütüphane Bileşikler ile Hücreler davranın&quot;) ardından, konsantrasyon çalışan 2 uM üç CHP134-mycn3UTR ve üç CHP134-CTRL plakaları tedavi etmek için her hit plakasını kullanın. Not: Burada tarif edilen karşı ekran 2 uM tek bir dozda, üç kez yapılır iken, standart çoğaltır yerine 2 uM 20 nM arasında değişen 10 kat seyreltik olarak 3 konsantrasyonlarda hit test etmek için faydalı olabilir. Bu yaklaşımı uygulamak sadece yanlış-pozitif oranları en aza indirerek, birincil hit üzerinde ön doz-yanıt verileri elde etmek de birincil ekran verileri teyit, ama izin vermedi. Bu durumda, başka bir analiz hattı başvurunun olmalıdıred deneysel verileri işlemek ve hit onaylamak için. </li><li> Birincil tarama için protokol (Bölüm &quot;Gün 3: Lüsiferaz Testi gerçekleştirin&quot;) ardından, tüm CHP134-mycn3UTR ve CHP134-CTRL plakaları lusiferaz aktivitesini ölçmek. </li><li> Primer tarama protokolüne (Bölüm &quot;4. Gün: Veri Analizi&quot;) sonra, on plaka, araçla tedavi edilen kontrollere ortalamasına işlenmiş olan gözeneklerden elde deneysel verileri normalleştirmek ve tekrarın ortalama ve SD hesaplar. Test edilen her bir bileşik için, CHP134-CTRL hücreleri vs CHP134-mycn3UTR lusiferaz etkinliğinin kat değişimi hesaplamak. Keyfi kat değişikliği cut-off&gt; &lt;0.01 1.5 ve önemi p-değerleri seçin. NOT: hit özgüllüğü için belirleyici parametre CHP134-CTRL hücreleri vs CHP134-mycn3UTR içinde lusiferazm önemli bir kat değişiklik açıklanan tahlil ayarlarında. Gerekirse, bir de se olarak eş zamanlı olarak, bir hücre canlılığı deneyi gerçekleştirilerek bileşik toksisitesini değerlendirmek olabilirseçilir ve bileşikler. Birincil hit bir doz yanıt analizinde karşı taranır Bu özellikle faydalı olabilir. Tek bir doz için, deneyim 6 hücre canlılığı azalmış indirgenmiş lusiferaz aktivitesinin güçlü bir korrelasyonu göstermektedir. Bu nedenle, hedef hücreleri ve kontrol hücreleri, lusiferaz aktivitesi azalmış Test edilen konsantrasyonda bileşiğin toksisitesinin bir göstergesi olarak kabul edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells.">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).</li><li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs.">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3&#8217;+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3&#8217; untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cell-Based+High-Throughput+Screen+Addressing+3&#8217;+UTR-Dependent+Regulation+of+the+MYCN+Gene.">A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3&#8217; UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene.</a> Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).</li><li>Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma:+developmental+biology,+cancer+genomics+and+immunotherapy.">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Herbst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexing+a+high-throughput+liability+assay+to+leverage+efficiencies.">Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies.</a> Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).</li><li>van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+luciferase+reporter+assay+for+cell-based+high-throughput+screening.">Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li><li>Hitti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ribosomal+protein+promoter-based+reporter+system+for+selective+assessment+of+RNA+stability+and+post-transcriptional+control.">A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control.</a> RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).</li><li>Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+regulatory+elements+in+conserved+3&#8217;+UTRs+of+human+transcripts.">Systematic identification of regulatory elements in conserved 3&#8217; UTRs of human transcripts.</a> Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J. Vis. Exp. (87), (2014).</li><li>Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3&#8217;+untranslated+region+of+messenger+RNA:+A+molecular+&#8220;hotspot&#8221;+for+pathology.">The 3&#8217; untranslated region of messenger RNA: A molecular &#8220;hotspot&#8221; for pathology.</a> Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).</li><li>Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+methods+to+monitor+the+modulation+of+mRNA+stability:+a+novel+approach+to+drug+discovery+and+therapeutic+intervention.">A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention.</a> J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).</li><li>Pascale, A., Govoni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+world+of+post-transcriptional+mechanisms:+is+their+deregulation+a+common+link+for+diseases?+Focus+on+ELAV-like+RNA-binding+proteins.">The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).</li><li>Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+pre-mRNA+processing+and+altered+architecture+of+3&#8217;+untranslated+regions+contribute+to+the+development+of+human+disorders.">Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3&#8217; untranslated regions contribute to the development of human disorders.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).</li><li>Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+GEMS--a+novel+platform+technology+targeting+post-transcriptional+control+mechanisms.">Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms.</a> Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).</li><li>Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+post-transcriptional+control+for+drug+discovery.">Targeting post-transcriptional control for drug discovery.</a> RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3&#8217; UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based ...

Gen ifadesinin uzun bir süre transkripsiyonel düzenleme için protein üretimini kontrol açık olmayan rolü ise önemli bir oynadığı düşünülmektedir edildi. Giderek artan kanıtlar, bununla birlikte, transkripsiyon sonrası düzenleme hücresel protein bolluğu 1,2 belirlemek için olduğu kadar, eğer değilse, transkripsiyonel düzenleme daha fazla katkı göstermektedir. Gen ifadesinin transkripsiyon sonrası kontrol ilk düşünce oldu çok daha karmaşık ve ayrıntılı. Aslında, post-transkripsiyonel kontrol tüm çeşitli aşamalarında mRNA işleme, lokalizasyonu, ciro, çeviri 3 gibi yeni açıklanan geri dönüşümlü RNA metilasyon 4 olmak üzere, düzenlendiği ortaya çıktı. Transkripsiyon sonrası düzenleme olan bir dizi işlem potansiyel olarak etkilenen kaynaktan deney aşağıda tarif edilen mRNA&#39;nın 3 &#39;çevrilmemiş bölge (3&#39; UTR) yer aldığı, bu odaklanmaktadır. 3 &#39;UTR geniş RNA bağlayıcı pr belirli etkileşim yoluyla esas mRNA kaderi etkilerdüzenleyici dizileri ve / veya ikincil yapılar 5 oteins ve kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar. Bu nedenle, bu etkileşimleri değiştirebilir veya yukarı sinyal iletim yollarında engel küçük moleküller, protein bolluğu düzenleyen dengeyi kayacak. Bu tedavi yaklaşımı olan bir kanıt, hastalık-ilgili genler, bu şekilde farmakolojik müdahale için potansiyel bir hedef temsil etmektedir post transkripsiyonel düzenlenmesinde tabi olduğunu gösteren Varlığından insan patolojilerinin için özel bir önem taşımaktadır. Bu nedenle, yüksek verimli bir formatta transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmaları ile girişim ile mRNA düzeyleri &#39;modülatörlerinin taranması için izin sistemleri, potansiyel yeni tedavi tanımlanmasında değerli araçlar olabilir. tarif edilen hücre bazlı bir raportör gen deneyi ile 3 &#39;UTR bağlı mekanizmalar yoluyla mRNA&#39;nın kaderi modüle edebilirler bileşiklerin tanımlanmasına izin verir. Birçok ana c oluşmaktadıromponents (Şekil 1) ve birkaç ön adım gerektirir tahlil fizibilite doğrulamak için. Her şeyden önce, raportör yapı, söz konusu geninden 3 &#39;UTR içerecek şekilde tasarlanmıştır. 3 &#39;UTR, örneğin ateşböceği lusiferaz (Şekil 1) gibi bir raportör genin ucuna kaynaştırılır. Takılı 3 &#39;UTR ile uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarının herhangi bir değişiklik, çeşitli lusiferaz seviyelerinde elde edilen bu kimerik transkripti stabilitesini ve / veya translasyon etkinliğini değiştirir. Bu nedenle, lüsiferaz faaliyetindeki değişimler de ilgi konusu genin, etkilenen transkripsiyon sonrası düzenleme dolaylı ölçü vermektedir. sisteminin ikinci bileşeni, bir kontrol raportör yapı, aynı haberci genini tanımlayan fakat herhangi bir 3 &#39;UTR içermeyen benzer bir sentezleme plazmiddir. İki raportör plasmidleri, geleneksel moleküler biyoloji protokollerini kullanarak laboratuarda tasarlanmış ya da ticari kaynaklardan satın alınabilir. bir hücre sırasına seçimi deney yapımı için kritik önem taşır. Hangi hücre hattı optimum model kullanılabilirlik, transfectability ve büyüme özellikleri gibi sadece pratik konulara patolojiye maksimum benzerlik gibi klinik gereksinimlerine kadar pek çok faktöre bağlıdır. Önemlisi, önce bir raportör gen 3 &#39;UTR füzyon kimerik transkript düzeyinde beklenen etkiye sahip olduğundan emin olmalısınız devam etmek. 3 lusiferaz sinyali anlamlı fark olmaması alternatif olanlar arama için isteyen, UTR bu hücresel modelde işlevsel değil &#39;UTR taşıyan ve kontrol muhabiri geçici 3 belirtmek istiyorum seçilen hücrelerde transfekte yapılarını&#39;. Yüksek işleme kapasiteli bir düzende, 3 &#39;UTR taşıyan ve kontrol lusiferaz raportör yapılan ile kararlı bir şekilde seçilen bir hücre dizisindeki entegre edilmelidir. Kullanarak stabil bir şekilde geçici olarak üzerinde entegre transfekteHücre hattı, çeşitli nedenlerden dolayı tercih edilir. Bu maliyetleri azalır, transfeksiyon verimliliği hareketlerinden kaynaklanan veri değişkenliği azaltmak, zor transfect hücre hatları da dahil olmak üzere bir hücresel modelin seçimi genişletmek olacaktır. Ayrıca, geçici transfeksiyon hücreleri üzerine çok sık sistemin doygunluk giden bir DNA plazmid ile aşırı yük. Bu şartlarda raportör ekspresyonu daha fazla bir artışın potansiyel regülasyonunda bileşiklere karşı duyarlılık azalmasına neden zor olabilir. Tüm tahlil bileşenleri kurmak zaman lusiferaz aktivite gerçekten yukarı ve aşağı-regüle &#39;3 takılı yoluyla özellikle olabilir Son olarak, bu deneyde, yani fizibilitesini belirlemek için yüksek verimli formatına geçmeden önce kritik UTR. iyi kontrol ilgi 3 &#39;UTR ile mRNA stabilitesini veya çevrilebilirlik modüle etmek için rapor küçük moleküller olacaktır. Bu sahip isemümkün değil, istenen etkiyi taklit vekil kontroller kabul edilir. Bu miRNA&#39;ların veya ilgi 3 &#39;UTR bağlanma yoluyla etkilere neden olduğu bilinmektedir, RNA bağlanan proteinleri olabilir. Bu tür kontrollerin değerlendirilmesi primer tarama geliştirilen testin işlevselliğini gösterir, aynı zamanda yüksek verimli biçimde dinamik aralık, hassasiyet ve performans tahmini için izin verir sadece daha önce. Açıklanan protokol kullanarak biz 2.000 bileşik kütüphane 6 gösterildi. Nöroblastom, bebeklik en sık ekstrakraniyal solid tümör, bir biyolojik model olarak kullanıldı ve amplifikasyon MYCN onkogen, 3 &#39;UTR güçlü bir hedef genin 7 olarak nöroblastom olumsuz sonuç, tahmin. 2 deneysel düzen özetliyor Şekil. Tarama bir seferde elenmiş 27 plaka toplu boyutu ile üç aşamada bölündü. 27 plakaları toplu Spektrum Koleksiyonu kütüphane dahilPlakalar n.1-n.8 + n.25 (ilk çalıştırma), n.9-n.16 + n.25 (ikinci dönem) ve n.16-n.24 + n.25 (üçüncü dönem), her plaka üç nüsha olarak tarandı. Böylece, bir kütüphane plakası (n.25) mümkün arası çalışma karşılaştırma yapma üç çalışır içerisinde test edildi. protokol aşağıda üç kopya halinde test edilen 9 kütüphane tabakalarından tek bir çalışma açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:239px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Culture plate 96-well White</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6005688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6008190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">100 ml disposable trough for reagents</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td>10 613 048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">300 ml disposable robotic reservoir</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">PB12001301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 50&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 200&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">3711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">ONE-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">RPMI</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-918F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">PBS-1X, w/o Ca++, Mg++</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">The Spectrum collection (compound library)</td>
			<td style="width:239px;">MicroSource Discovery Systems</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan Freedom EVO200 robot&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan F200 multiplate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for chemical modulators of post-transcriptionally regulated genes

Transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası düzenleme Her iki genlerin ifadesi üzerinde derin bir etkiye sahip. Ancak, yaygın olarak kabul edilen hücre tabanlı tarama deneyleri esas promotör hedefleme moleküllerinin belirlenmesi amaçlı olan, transkripsiyonel regülasyonu odaklanmak. Sonuç olarak, transkripsiyon sonrası mekanizmalar büyük ölçüde gen ifadesi hedeflenen ilaç gelişimi ile ortaya edilmektedir. Burada ve değiştirmek mümkün bileşiklerin belirlenmesi onun mRNA kaderi modülasyonunda 3 &#39;çevrilmemiş bölge (3&#39; UTR) rolünü araştırmak amacıyla bir hücre bazlı deney tarif eder. Deney kararlı bir şekilde hastalığa, ilgili hücre hattına entegre ilgi konusu bir genin 3 &#39;UTR içeren bir lusiferaz raportör yapının kullanımına dayanmaktadır. Protokol tedavi 24 saat sonra lusiferaz aktivitesi etkileyen moleküllerin tanımlanması amaçlı birincil tarama başlangıç ​​odaklanarak, iki parçaya ayrılmıştır. protokolün ikinci bölümüaçıklar karşı tarama özellikle 3 &#39;UTR ile lusiferaz aktivitesini modüle bileşikleri ayırmak için gerekli. Ayrıntılı protokol ve temsil sonuçlarına ek olarak, biz tahlil geliştirme ve endojen hedefe isabet (ler) doğrulama konusunda önemli hususlar sağlamaktadır. tarif edilen hücre bazlı bir raportör gen deneyi bilim adamları 3 &#39;UTR bağımlı transkripsiyon sonrası mekanizmalar yoluyla protein seviyelerini modüle molekülleri tanımlamak için izin verecektir.

Tarif edilen yaklaşımı kullanarak, MYCN geninin 3 &#39;UTR ile uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarının potansiyel modülatörleri için bir 2000-bileşiği kütüphanesini taramıştır. 3, tek bir kütüphane plaka ile örneklenen primer tarama sonuçlarını tasvir etmektedir. Araç ile muamele edilen kontrol yüzdesi olarak gösterildi: Lusiferaz sinyali tek bir kütüphane plaka bileşikleri ile tedavi CHP134-mycn3UTR hücre plakaları üçer defa lu...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes at JoVE.com

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Görüntüleme.  University of Trento. Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

Video: High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biyoloji

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Yüksek verim Uygulamaları Yetişkin Zebra Hearts Kurtarma

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.