Bu çalışma NIH Hibe P20 RR021905-01, CF RPD hibe STANTO07R0, ve NASA hibe NNH09ZNE002C tarafından finanse edilmektedir.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 bakteriyel Uçucu Sesi-MS analizi için şematik. Bakteriyel kültür headspace Sesi reaksiyon odası (2), CO 2 (1) yerinden . Uçucu elektrosprey bulut geçmesi Sesi reaksiyon odası hareket ve iyonize olmak (3). Bir kez iyonlaşmış, uçucu, analiz için kütle spektrometresi (4) içine çekti. Aşırı taşıyıcı gaz ve bakteriyel Uçucu girmemiş 0.22 mikron filtre (5) ile ek bir koruma önlemi olarak, geçti, ve kimyasal bir kaput için havalandırmalı. Ankastre: Sesi elektrosprey iğne silika bilenmiş bir iğne ucu kapiller (40 mikron ID). Sesi-MS kullanımının bakteriyel Uçucu, E. karakterizasyonu için bir gösteri olarak coli K12 ve P. aeruginosa PAO1 37 LB-Lennox, 50 ml 24 saat aerobik kültür ° C ve headspace uçucu Sesi-MS spektrumları 2 dakika içinde toplanır. Karbon dioksit (% 99,99) 2 L / dk akış hızında tepki odasına uçucu teslimat için taşıyıcı gaz olarak kullanılır. Sesi reaksiyon odasında özel inşa edilmiş ve orijinal elektrosprey iyon kaynağı yerine bir API-3000 (SCIEX), monte. Spektrumları,% 0.1 formik asit,% 5.0 metanol, ve 94.9% su (v / v) elektrosprey çözüm olarak kullanarak pozitif iyon modu toplanan 5 teslim bilenmiş bir iğne ucu ile iletken olmayan bir silika kapiller yoluyla nL / s (40 mikron ID). Uygulanan gerilimi 2,5 kV. : 20 - 500 Da, MCA modu, 40 tarar, 3 s / tarama, ve 2 dk toplam analiz süresi Analisti 1.4.2 yazılım (Uygulamalı Biyosistem) veri toplama için aşağıdaki parametreleri ile kullanılır. 1. Kültürleme sistemi <ol><li> Deneme için (örneğin, havalandırma, ışık, sıcaklık, vb) yanı sıra, kütle spektrometresi uçucu verimli teslim türlerin büyüme ihtiyaçları göz önünde bulundurularak, kültürler büyüyen için uygun bir damar seçin. Kullanmayı tercih kültürü şişeleri, en az iki luer portları dişli kapaklar ile donatılmış standart 100 ml Pyrex medya şişe. Bir giriş hattı için bir taşıyıcı gaz numune şişesi ve bir çıkış hattı teslim cihaz VOC teslimat (Şekil 1) için başka bir bağlantı noktası üzerinden eklenir döner bağlantı noktası üzerinden eklenir. Herhangi bir ek port takılı. </li><li> Önce kültür örnekleri, sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için gemi ve su batığın zorlar. Gaz kaçağı, zayıf ya da hiç uçucu iyon sinyalleri şeklinde atipik bir birincil nedeni. </li></ol> 2. Biyolojik Deneme: set-up ve güvenliği ile ilgili hususlar <ol><li> Hipotezine uygun koşullarda kültürleri büyütün. Bu en az iki biyolojik, her iki teknik çoğaltır çoğaltır, her değişken için kullanıldığından emin tavsiye edilir. </li><li> Her kültürde durum için boş bir hazırlayın (orta, antibiyotikler, vb) ve örnekleri gibi aynı koşullar altında boş kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Türlerin biyogüvenlik seviyesi (ler) dikkate alarak, biyolojik ajanlar için kullanmakta olduğunuz uygun güvenlik önlemleri uygulayın. </li><li> Enstrüman ve gaz nakil hatları canlı biyolojik ajanlar ile kirlenmesini önlemek için, taşıyıcı gaz hattına uygun gözenek boyutu filtre yükleyin. Sesi tepki odasına uçucu transferi ile filtreler müdahale olmaz, ama biraz aerosol transfer verimliliği etkileyebilir 6 </li><li> Biyolojik ajanlar dökülüp durumunda uygun çevreleme sağlamak için kültür şişesine gaz transferi kapağını takarken ikincil çevreleme veya bir biyogüvenlik kabini kullanın. </li><li> Başlatmak ve örnek şişe şişe içindeki basınç inşa etmeyecek bir şekilde taşıyıcı gaz akışı sonlandırmak. </li></ol> 3. Enstrüman optimizasyonu NOT: Sesi-MS, özellikle örnek uçucu için tasarlanmıştır, bu yüzden cihaz kullanmadan önce kokulu kişisel bakım ürünleri (örneğin, kolonya, diş macunu, losyon, yumuşatıcı), sakız, sigara vb. Kullanımını sınırlamak. Sıkıca laboratuvarda tüm uçucu kimyasallar kap ve hava kontrol testi sırasında mümkün olduğunca taslakları. Tüm sinyal yoğunluğu ve istikrarını etkileyebilecek aşağıdaki enstrümantal parametreleri, alet ve deney için optimize edilmiş olması gerekir. <ol><li> Elektrosprey çözümü ve akış hızı: işletim enstrüman polarite (pozitif veya negatif iyon modu) ve hedef bileşiklerin moleküler karakteri dikkate alarak, hedeflemek istediğiniz moleküllerin sınıf için uygun elektrosprey çözümü seçin. Bu deneyde elektrosprey çözümü% 0.1 formik asit,% 5.0 metanol,% 94.9 daha az polar moleküller sinyal yoğunluğu artırır su (v / v), while iyi bir sinyal istikrarın sağlanması. Çözüm 5 nL / s akış hızında teslim edilir </li><li> Taşıyıcı gaz akış hızı: taşıyıcı gaz akış hızı elektrosprey istikrar ve sinyal yoğunluğunu etkileyebilir. CO 2 (≥% 99.99) 2 L / dk akış hızında burada kullanılır. </li><li> İğne şekil ve konum: iğne ucu şekil ve konum güçlü bir sinyal yoğunluğu ve istikrarı etkileyebilir. Yeni bir iğne takarken, iğne pozisyonu düşük arka plan, yüksek analit sinyal yoğunluğu ve sinyal istikrar arasında bir denge oluşturmak için optimize edilmesi gerekir. Sesi spektrumları bir iğne değişiklikten sonra yeniden üretilebilmesi için, periyodik kayıtlarına gözlenen spektrum maç kadar iğne konumunu ayarlamak spektrumları toplamak için gereklidir. Kitle spec orifis elektrosprey iğne ucu arasındaki mesafe 1 - 5 mm olacaktır. </li><li> Uygulanan voltaj: sistemi uygulanan voltaj sinyal iyon yoğunluğu ve elektrosprey Taş koni istikrarı etkiler. Ayrıca, optimum gerilim elektrosprey çözüm ve iğne ucu şeklini bağlıdır. Deney serisinin başında, sisteminiz için en uygun spektrum ve sinyal kararlılığı verimleri gerilim belirlemek ve ardından sonraki tüm deneyler için bu gerilim. Uygulanan gerilimleri 2.0 - 5.0 kV sistemi için en iyi sinyal yoğunluğu ve elektrosprey istikrar sağlar. Bu deneme için 2,5 kV kullanılır. </li></ol> 4. Sesi-MS analizi için açma ve ayarlama <ol><li> Gerilim kaynağının kapalı olduğundan ve sistem elektrik deşarj olmasını sağlayarak başlayın. Gerilim kaynağı üzerindeki gösterge ışıkları sıfır multimetre üzerindeki voltaj sağlanması), 2 kapalı, ve 3), elektrik açar topraklama sağlamak 1) bunu. </li><li> Denemeniz için uygun elektrosprey çözüm yükleyin. </li><li> Taşıyıcı gaz açma ve deney için uygun kur akışını ayarlamak. </li><li> Elektrosprey çözüm reaksiyon odasına teslim başlatmak için elektrosprey rezervuar basınç uygulayın. </li><li> Gerilim kaynağı açın ve gerilim deneyleri için uygun bir değer için ayarlayabilirsiniz. </li></ol> NOT: Bu noktada iyonizasyon kaynağı metal yüzeyler tehlikeli bir şok sunma yeteneğine sahiptir. Gerilim kaynağı açıldıktan sonra cihaz etrafında çalışırken çok dikkatli olun. <ol start="6"><li> Sesi-MS spektrum uygulanan gerilim ince ayar ayarlamalar yaparken izlenmesi için bir ayarlama yöntemi ayarlayın. Sistemini ve deney için optimize edilmiş olduğunu satın parametrelerini kullanın. Her tarama bağımsız bir spektrum üretir, böylece Çoklu Kanal Toplama (MCA) onay kutusu (eğer varsa) temizleyin, 10 edinimi süresi 15 dakika ve satın alma işlemini başlatmak. Taşıyıcı gaz arka plan Spectra dikkat edilmelidir. </li><li> Önceki deneyler için CO 2 taramaları maç istikrarlı bir toplam iyon kromatogram (TIC) ve tekrarlanabilir taramalar elde etmek için uygulanan gerilim ince ayar ayarlamaları yapın. Voltaj ayarlamaları yapıldıktan sonra, aracı stabilize olduğundan emin olmak için beş dakika spektrumları ve bir TIC toplamaya devam. </li><li> Enstrümantal istikrar satın zamanı ayarlayarak gerektiği gibi veri aralığı ve MCA seçimi örnekleri için uygun olarak satın alma yöntemi, sağlanır. Kayıtlarınız için bir taşıyıcı gaz arka plan spektrum toplayın. </li></ol> 5. Bakteri kültürü uçucu bir parmak izi alma <ol><li> Boş bir spektrum toplamak için, taşıyıcı gaz akış bypass hatları aracılığıyla doğrudan ve daha sonra cihazın gaz nakil hatları (vanalar kapalı) boş bir örnek eklemek. </li><li> Örnek şişesi vanaları açın ve bypass hatlarının vanalarını kapatınız. </li><li> 30 saniye reaksiyon odasında nem dengeleyici ve bu süre boyunca, sistemi denge sağlaması için izin verin. Bu süre, dengeleme tekrarlanabilir spektrumları elde etmek için esastır. Sistem dengelenmiş olduğundan emin olmak için, dengeleme döneminde değişecek TIC izlemek isteyen ve daha sonra stabilize olabilir. </li><li> Sistem dengelenmiş sonra, spektrum toplama başlatın. </li><li> Spektrum toplandıktan sonra, ilk örnek vanaları kapatarak, taşıyıcı gaz by-pass hattı açılması, ve son olarak da örnek şişesini çıkarırken, numune şişesi çıkarın. Nakil hatları, nem ve uçucu adsorbe kaldırarak örnek-örnek taşınmasını önlemek, sistem 4 dakika - 2 taşıyıcı gaz ile yıkayın. </li><li> Aralıklı kapsamlı boş çıkarma sağlamak için ek boş spektrumları toplama adımları 5.2 - 5.5, her bir bakteriyel örnek için tekrarlayın. Eksik boş çıkarma yol açacaktıratmosferik basınç iyonizasyon teknikleri yaygın işlenen spektrum kimyasal arka plan doruklarına görünümünü (örneğin, ftalatlar, silikon, vb.) 9 </li><li> Spektrumları toplarken, iyon sinyalleri TIC ve bireysel zirvelerinden maksimum yoğunluğu tarafından belirlenir Cihazınızın doğrusal algılama sınırları, geçmeyen olduğunu emin olun. Cihazınızın dedektör üst sınırlamaları aşmaktan İyonlar örnek temsilcisi değildir artifakı doruklarına üretebilirsiniz. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Sesi-MS spektrumları bir örnek olarak, bakteri uçucuların, E. için pozitif iyon modu uçucu parmak izi elde edilebilir coli ve P. 37 C&#39;de 24 saat aerobik LB-Lennox yetiştirilen aeruginosa ° C gösterilmiştir (Şekil 2). E. coli uçucu spektrum m / z = 118 indol hakim olduğu, E. verir coli kültürleri oysa P. spektrum karakteristik koku, aeruginosa protonatable zirveleri daha büyük bir çeşitlilik içerir. Bölüm 3 açıklanan enstrümantal parametreler üzerine uçucu spektrumunda piklerin bağıl şiddetleri bağlı olduğunu unutmayınız. Bu parametreler deneyinin deney tekrarlanabilir spektrumları elde etmek için sıkı kontrol edilmelidir. <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Boş çıkarılır pozitif iyon modu Sesi-MS spektrumları E. (20 - 150 m / z). coli K12 ve P. 37 LB-Lennox 24 saat aerobik büyüme sonra aeruginosa PAO1 uçucu ° C Sesi spektrumları gözlenen doruklarına hakkında daha fazla bilgi için, Zhu ve ark. 8 bakın lütfen.

<ol>
	<li>Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESI-MS+in+the+analysis+of+trace+species+in+gases.">ESI-MS in the analysis of trace species in gases.</a> , (1999).</li><li>Wu, C., Siems, W. F., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+ion+mobility+spectrometry/mass+spectrometry+of+illicit+drugs.">Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs.</a> Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).</li><li>Tam, M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization-ion+mobility+spectrometry+for+explosive+vapor+detection.">Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection.</a> Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).</li><li>Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+(SESI)+of+ambient+vapors+for+explosive+detection+at+concentrations+below+parts+per+trillion.">Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+detection+of+human+skin+vapors.">On-line detection of human skin vapors.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+of+volatiles+in+breath.">Electrospray ionization of volatiles in breath.</a> Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F., F, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+fatty+acid+vapors+in+breath+by+electrospray+ionization+and+atmospheric+pressure+ionization-mass+spectrometry.">Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008).</li><li>Guo, X. H., Bruins, A. P., Covey, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+typical+chemical+background+interferences+in+atmospheric+pressure+ionization+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).</li><li>Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A., Johnson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathogen detection using headspace analysis. , 16-16 (2004).</li><li>Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M., Rieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+bacteria+in+vitro+by+mass+spectrometric+fingerprinting:+A+pilot+study.">Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study.</a> Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).</li><li>Schulz, S., Dickschat, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+volatiles:+The+smell+of+small+organisms.">Bacterial volatiles: The smell of small organisms.</a> Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).</li><li>Ligor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+breath+investigation.">Analytical methods for breath investigation.</a> Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).</li><li>Cao, W. Q., Duan, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breath+analysis:+Potential+for+clinical+diagnosis+and+exposure+assessment.">Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment.</a> Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).</li><li>Law, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+complex+viscous+liquids+at+the+molecular+level.">Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+analytes+from+cheese+products+for+fast+detection+using+neutral+desorption+extractive+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).</li><li>Fleming-Jones, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+organic+compounds+in+foods:+A+five+year+study.">Volatile organic compounds in foods: A five year study.</a> J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).</li><li>Calkins, C. R., Hodgen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+meat+flavor.">A fresh look at meat flavor.</a> Meat Sci. 77, 63-80 (2007).</li></ol>

Bakteriler uçucuların farklı kombinasyonlar, üreten bakteri tanımlama 10-12 ve metabolik durumunun değerlendirilmesi için kullanılabilir. Sesi-MS yöntemi burada açıklanan bir bakteri türlerinin belirlenmesi için &quot;parmak izi&quot; hızla üreten, herhangi bir numune hazırlama olmadan bakteriyel Uçucu (iki dakika veya daha az) karakterize bir yol sağlar. Son birkaç on yıl içinde 8 diğer atmosferik basınç iyonizasyon MS teknikleri seçici iyon akışını tüp (SIFT) ve proton transferi reaksiyonu (PTR) kütle spektrometresi gibi uçucu, karakterizasyonu yapılmıştır. Sesi bu iyonizasyon yöntemlerine göre sağladığı belirgin avantajı bileşik tanımlanması için önemli bir araçtır parçası özel zirveleri (sesi için adapte edilmiştir kütle spektrometresi uygun tip), mümkün olmasıdır. Biz yukarıda sıralanan protokol tepe parçalanma adresi, ama parçalanma bilgi bakteriyel Uçucu karakterizasyonu nasıl kullanılabileceğini örnekler ve diğerleri, Zhu için lütfen vermedi. 8 Sesi-MS nefes analizi ile bakteriyel akciğer enfeksiyonları yerinde tespiti için doğrudan bir uygulaması vardır, ancak uçucu örnekleme mümkün olduğu herhangi bir ayar için de uygulanabilir . Örneğin, analiz, metabolik bozukluklar tanısı ile ilgili, idrar, kan, ve nefes uçucu,, GASTROENTERİK hastalığı, kanser ve çevresel maruziyet, Sesi-MS için de uygundur. 13,14 Sesi- MS de gıdaların hızlı analizi de dahil olmak üzere, olgunlaşma, yaşlanma ya da bozulmadan ile ilişkili karakteristik uçucu olmayan klinik VOC parmak izi uygulamaları, geniş bir yelpazede. 15-18

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> API-3000 Üçlü kuadropol </td><td> Alet </td><td> SCIEX </td><td></td><td> Analist 1.4.2 (Applied Biosystems) ile satın </td></tr><tr><td> Sesi İyon Kaynak </td><td> Alet </td><td></td><td></td><td> Ismarlama; referans 6 </td></tr><tr><td> Gaz debimetre </td><td> Ekipman </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-03.217-74 </td><td></td></tr><tr><td> Karbondioksit </td><td> Ekipman </td><td> Airgas </td><td> CD i300 </td><td> ≥% 99.99 saf </td></tr><tr><td> Azot </td><td> Ekipman </td><td> Airgas </td><td> NI UHP300 </td><td> Ultra yüksek saflıkta </td></tr><tr><td> Fazla 100 ml&#39;lik cam medya şişe </td><td> Ekipman </td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> GL45 vida evre </td></tr><tr><td> Luer portları ile Şişe kapakları </td><td> Ekipman </td><td> Bio Kimya Sıvıları </td><td> 00945T-3 </td><td> Cap montaj </td></tr><tr><td> Luer liman fişler </td><td> Ekipman </td><td> Bio Kimya Sıvıları </td><td> 009LP </td><td> Cap montaj </td></tr><tr><td> Boru 1 / 4 &quot;(OD) x 1 / 8&quot; (ID) </td><td> Ekipman </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-95.875-02 </td><td> Cap montaj ve gaz nakil hatları </td></tr><tr><td> Boru 1 / 8 &quot;(OD) x 1 / 16&quot; (ID) </td><td> Ekipman </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-06.605-27 </td><td> Cap montaj </td></tr><tr><td> İki yollu vanalar </td><td> Ekipman </td><td> Cole-Parmer </td><td> 07391-04 </td><td> Cap montaj </td></tr><tr><td> Filtre, Sınıf AAQ </td><td> Ekipman </td><td> Balston Filtreler </td><td> 9922-05 </td><td></td></tr><tr><td> Formik asit, LC / MS derece </td><td> Reaktif </td><td> Balıkçı </td><td> A117-05AMP </td><td> Elektrosprey çözüm </td></tr><tr><td> Metanol, LC / MS notu </td><td> Reaktif </td><td> Balıkçı </td><td> A456-500 </td><td> Elektrosprey çözüm </td></tr><tr><td> Su, LC / MS derece </td><td> Reaktif </td><td> Balıkçı </td><td> W6-500 </td><td> Elektrosprey çözüm </td></tr></tbody></table>

characterizing bacterial volatiles using secondary electrospray ionization mass spectrometry (sesi-ms)

İkincil elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (Sesi-MS), numune ön işlemesi için gerek kalmadan, hızlı algılama uçucu bileşiklerin için geliştirilmiş bir yöntem. Yöntemi ilk Fenn ve arkadaşları 1 tarafından tarif edilmiştir ve yasadışı uyuşturucu 2 ve patlayıcılar 3-4, 5 cilt uçucu karakterizasyonu ve 6-7 nefes analizi tespiti için tatbik edilmiştir. Sesi iyonizasyon elektrosprey çözüm ve uçucu analit arasında proton transfer reaksiyonları ile oluşur ve tıpkı geleneksel elektrosprey iyonizasyon (ESI), hetero-organik moleküllerin analizi için çok elverişlidir. Ancak, standart ESI aksine Sesi proton transfer süreci çözüm buhar faz yerine (Şekil 1) oluşur ve bu nedenle Sesi organik uçucu ve aerosollerin tespit etmek için en uygun olan. Biz bakteriyel belirlenmesi ve tanımlanması 8 için bir yöntem olarak bakteriyel Uçucu tespiti Sesi-MS kullanımı genişlemektedir. Sesi-MS uçucu bir istatistiksel analiz yöntemi ile birlikte parmak izi, büyüme ortamı çeşitli bakteriyel cins, tür, ve karışık kültürlerin ayırt etmek için kullanılabilir olduğunu göstermiştir. 8 Burada Sesi kullanarak bakteri uçucu parmak izi almak için adımlar sağlar sağlam bakteriyel belirlenmesi ve tanımlanması sağlamak için optimize edilmelidir enstrümantal parametreleri de dahil olmak üzere-MS.

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS at JoVE.com

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

İkincil elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (Sesi-MS), uçucu organik bileşikler (VOC) tespiti gerek kalmadan herhangi bir numune ön işlemesi için olanak sağlar. Bu protokol Sesi-MS kullanılarak bakteriyel VOC (dakikalar içinde) hızlı karakterizasyonu için yönergeler sağlar.

İkincil Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi (Sesi-MS) ile karakterize Bakteriyel uçucu

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

characterizing-bacterial-volatiles-using-secondary-electrospray

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

17.8K Görüntüleme.  University of Vermont. İkincil elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (Sesi-MS), uçucu organik bileşikler (VOC) tespiti gerek kalmadan herhangi bir numune ön işlemesi için olanak sağlar. Bu protokol Sesi-MS kullanılarak bakteriyel VOC (dakikalar içinde) hızlı karakterizasyonu için yönergeler sağlar.

Video: Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Biyomühendislik

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Biyolojik Dokuların Görüntüleme

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

3D Hücre Kültürü Modelleri Kütle Spektrometre Görüntüleme Hazırlık Stratejileri Numune

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Zaman-of-flight Kütle Spektrometre ile 2D Gaz Kromatografisi Kullanarak Alg Hidrotermal Sıvılaşma gelen Sulu Kesir Nitel Karakterizasyonu

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Kızılötesi Matriks destekli lazer desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon tarafından tüm vücut Kütle Spektrometre Görüntüleme (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Amip kullanarak bir yansıma tabanlı hızlı bakteriyel virülans tahlil

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...