Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (JCB K22NS050137) tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre kültürü <ol><li> Kortikal nöronların izole ve önceden açıklanan teknikler ve poli-D-lizin ve laminin 1 ile kaplanmış bir cam alt (Mattek Corporation, Ashland, MA) ile kültür kaplarına kaplama kullanılarak yetiştirilir. </li></ol> 2. Floresan probları TMRM ve H 2 DCF-DA için stok çözümler hazırlanması <ol><li> TMRM, 5.0 mg 1 ml susuz dimethylsülfoksit eriterek TMRM 10 mM stok solüsyonu hazırlayın. Vortex 1 dak. Sonra, alikotları yapmak ve -20 ° C&#39;de saklayın, ışıktan korumak, ve bir ay içinde kullanın. </li><li> Sonra, susuz DMSO 1 ml H 2 DCF-DA 4.87 mg eriterek H 2 DCF-DA 10 mM stok solüsyon hazırlanır. Benzer şekilde, vorteks 1 dak. Sonra, alikotları yapmak ve -20 ° C&#39;de saklayın, ışıktan korumak, ve bir hafta içinde kullanabilirsiniz. </li></ol> 3. TMRM ve H 2 DCF-DA ile yükleme sıçan kortikal nöronların TMRM mitokondri son derece negatif yüklü iç birikir potansiyometrik, hücre-geçirgen floresan gösterge. Mitokondriyal TMRM otomatik söndürme önlemek için TMRM düşük konsantrasyonlarda (10-50 nM aralık) kullanmak önemlidir. Sonra TMRM, floresan sinyal iç mitokondrial membran genelinde ΔΨm doğrudan işbirliği ile ilgili olabilir. ΔΨm kaybı floresan yoğunluğu kaybı ile sonuçlanan mitokondri sızması TMRM neden olur. H 2 DCF-DA hücre geçirgen prob, hücre içi esterazlar tarafından DCF-DA dönüştürülür ve floresan DCF oksidasyon sonuçları . Yüksek yükleme konsantrasyonları DCF floresan doygunluk H 2 O 2 yokluğunda bile neden olabilir DCF-DA, 2-10 mcM ve arasında değişmektedir H 2 farklı beyin bölgelerinden elde edilen nöronların nihai konsantrasyonu ampirik olarak test edilmelidir . Herhangi bir endojen veya eksojen oksidan varlığı (örneğin, nitrik oksit, hidrojen peroksit) DFC floresan yoğunluğu artacaktır. Aşağıda, TMRM ve H 2 DCF-DA ile sıçan kortikal nöronların yükleme için bir protokol sağlar. <ol><li> TB:: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukoz, 1.5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, ve 10 TMRM ile sıçan kortikal nöronların yüklemek için, ilk, Tyrode Kullanıcı tampon (Paylaşımlı Metin kültürlü nöronlar 3 kere yıkayın mM HEPES;) NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın. Ardından, TB 1 / 1000 kere 10 mM TMRM stok seyreltilmesiyle TMRM 20 nM hazırlamak ve daha sonra 2 TB başına 1 ml seyreltilmiş TMRM ul ekleyin. 45 dakika oda sıcaklığında karanlıkta TMRM nöronlar inkübe edin. 45 dakika sonra, mikroskop sahnede kültür çanak montaj ve görüntüleme başlayın. </li><li> H 2 DCF-DA ile sıçan kortikal nöronların yüklemek için, TB kültür nöronlar 3 kez yıkayın. Sonra, TB 10 mM H 2 DCF-DA stok 1 / 10 kez seyreltilmesi ile H 2 DCF-DA 2 mcM hazırlamak ve daha sonra 2 TB başına seyreltilmiş 1 ml H 2 DCF-DA ul ekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında 45 dakika karanlıkta H 2 DCF-DA nöronlar kuluçkaya yatmaktadır. 45 dakika sonra, görüntüleri almadan önce aşırı floresan gösterge kaldırmak için TB nöronlar 4 kere yıkar. </li></ol> 4. ΔΨm belirlemek için TMRM ile inkübe nöron görüntüleme Canlı <ol><li> TMRM, konfokal lazer tarama mikroskobu (Metin Yerleşimi: EKK 510, Carl Zeiss A.Ş.) ile inkübe nöronların canlı görüntüleme gerçekleştirmek için, canlı zaman serisi programı uygulaması ile kullanılır. Görüntüleri elde etmek ve photobleaching önlemek için gerekli zamanı en aza indirmek için; düşük çözünürlüklü ve zayıflatılmış lazer gücü (düşük çözünürlüklü lazer gücü:% 1: 256 x 256 Metin Dağılımı) uygulayın. </li><li> . Sonra, yansıyan ışık kullanılarak TMRM yüklü monte nöronların odağı ayarlayın. TMRM floresan aydınlatma ve 514 nm 570 nm dalga boyunda tespit inceleyin. Doygunluk seviyesinin altında sadece bir kamera tespit kazanç ayarlayın. </li><li> Görüntüleri elde etmek için çözünürlük, lazer gücü, bir kamera tespit kazanç ve zaman atlamalı aralığını içeren tüm parametreleri sonra; deneyler arasındaki bu ayarları değişmez. Ardından, alan değiştirmek. Görüntü toplamaya başlayın. </li><li> FCCP veya 2 mcg / oligomycin ml, 1 mcM gibi uyaranlara ΔΨm değişiklikleri sınamak için, önemli ölçüde sırasıyla, mitokondriyal membran potansiyeli depolarize veya hyperpolarize hangi uygulanan olabilir. Bu değişiklikler TMRM floresan FCCP durumunda bazal floresan veya oligomycin durumunda TMRM floresan yoğunluğunda bir artış ile karşılaştırıldığında bir düşüş yansıyacaktır. </li></ol> 5. ROS belirlemek için H 2 DCF-DA ile inkübe nöronlar Canlı görüntüleme <ol><li> Inkübe nöronlar H 2 DCF-DA, ilk canlı görüntüleme gerçekleştirmek için, bir mikroskop aşamasında kültür çanak monte edin. Hücrelerinin odağı ayarlayıning yansıyan ışık. 488 nm eksitasyon ve 515 nm dalga boyunda emisyon DCF floresan inceleyin. </li><li> Sonra% 5-7, dedektör kazanç ve 256 x 256 çözünürlükte, lazer gücü ayarlayın. Deneyler arasındaki bu ayarları değiştirebilirsiniz etmeyin. Sonra, zaman serisi programını kullanarak canlı görüntüler elde etmek için frekansını ayarlayın. </li><li> Yeni bir alan seçin ve görüntüleri almak başlayabilirsiniz. ROS düzeylerinde değişiklikler tespit için, 100-200 mcM H 2 O 2 hücre tedavisi. Bu başlangıç ​​seviyesi ile karşılaştırıldığında DCF floresan yoğunluğunda bir artış ile yansıtılacaktır. </li></ol> 6. Veri analizi <ol><li> LSM program aracı: ilgi bölgesi (ROI Metin Dağılımı) alanlarını seçmek için kullanın. Sonra, TMRM veya ROS floresan yoğunlukları ölçmek. Mitokondriyal bölgelerde veya TMRM veya ROS floresan yoğunlukları sırasıyla ölçmek için görüntülü hücrelerinde tüm hücre gövdesi ROI&#39;ler ROI&#39;ler seçin. </li><li> TMRM veya her zaman noktası için ROS için tüm görüntülü hücreleri için bütün hücre gövdeleri her hücrenin bütün ROI&#39;ler ortalama floresan yoğunlukları hesaplayın. Eşiğe yoğunluğunu hesaplamak için hücrelerin yanında bölgeleri seçin. Çeşitli ölçümler ve ortalama arka planda yoğunluğunu hesaplamak. </li><li> Microsoft Excel kullanarak her zaman noktası için her hücrede ROI&#39;ler ortalama floresan yoğunlukları, ortalama bir arka plan floresan çıkarın. Arka plan yoğunluğu çıkarılarak sonra, bu formülü (: mesafe kadar taşınmış = FF o / F o x 100, F = bazal floresan için herhangi bir zaman noktasında = floresan yoğunluğu, Paylaşımlı Metin) kullanarak temel floresan TMRM veya DCF floresan yoğunluğu normale Sonra, zaman içinde floresan yoğunluğunda değişiklik gösteren arsa üretmek için Sigma Arsa programı kullanın. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1A TMRM ile inkübe fare kortikal nöronların bir floresan görüntüyü gösterir. FCCP eklenmesi, mitokondriyal uncoupler, mitokondriyal depolarizasyon ve TMRM floresan yoğunluğu (Şekil 1B) kaybına yol açar. Bazal TMRM floresan seviyesi FCCP ek önce (Şekil 1C ilk 350 sn) sabit kalır. Kantitatif analiz, zaman içinde TMRM floresan değişiklikler TMRM floresan FCCP (Şekil 1C) eklenmesinden sonra önemli bir azalma gösterir. Şekil 1D DCF yüklü fare kortikal nöronların floresan görüntüyü gösterir. H 2 O 2 sonuç eklenmesi (Şekil 1E) hücre gövdeleri DCF floresan yoğunluğu arttı. Bazal DCF floresan seviyesi H 2 O 2 uygulama öncesi (ilk 120 sn) değişmez. Time-lapse DCF floresans ölçümleri istikrarlı düzeyleri gösterisi, H 2 O 2 tedavisi (Şekil 1F) sonra artış. <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 mitokondriyal membran potansiyeli ve canlı sıçan kortikal nöronların ROS düzeylerinin değerlendirilmesi. (A) kortikal nöronların Temsilcisi floresan görüntü TMRM yüklendi. Temel TMRM floresan taradıktan sonra, nöronlar protonophore FCCP (1 mcM) ile tedavi edildi. Sağda, parlak sarı ve siyah temsil maksimum ve minimum yoğunluğu, sırasıyla TMRM floresan Pseudocolor yoğunluğu bar. Mitokondriyal bölgelerden TMRM floresan kaybı FCCP tedavi (panel B) üzerine ΔΨm çöküşünü gösterir. Farklı zaman noktalarında TMRM floresan yoğunluğu değişim kantitatif gösterimidir FCCP tedavi öncesi ve sonrasında H2DCF-DA yüklü sıçan kortikal nöronların Floresan görüntü paneli C. (D). Temel DCF floresan belirlendikten sonra, hücrelerin 200 mcM H 2 O 2 ile tedavi edildi ve DCF floresan değişimi değerlendirildi. DCF floresan bir artış H 2 O 2 tedavisi (E) üzerine ROS düzeylerinde artış yansıtır. DCF floresan değişimi nicel analizi, H 2 O 2 tedavi öncesi ve sonrası paneli F. Ölçek çubuğu = 10 mm gösterilir Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi FCCP Ayrıca 40X objektif kullanarak öncesi ve sonrası kortikal nöronlarda TMRM hücre görüntüleme yaşayın. Pseudocolor yoğunluğu maksimum (FCCP toplamadan önce parlak sarı) ve (kırmızı renk, FCCP eklenmesinden sonra) FCCP eklenmesinden sonra TMRM floresan yoğunluğu azalmış <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">Videoyu izlemek için buraya tıklayın</a> Video. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi 40X objektif kullanılarak, H 2 O 2 ek öncesi ve sonrası kortikal nöronlarda DCF hücre görüntüleme yaşayın. DCF floresan bazal hücre gövdeleri, açık yeşil renkli ve H2O2 Ayrıca DC artırırF parlak yeşil renkli floresan <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">videoyu görmek için buraya tıklayın</a>

<ol>
	<li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures.">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+(AICD)+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics.">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li><li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species:+implication+for+cell+death.">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li></ol>

Biz ΔΨm ve ROS floresan göstergeler sırasıyla TMRM ve H 2 DCF-DA kullanarak fare kortikal nöronlarda nasıl belirleneceğini anlatan bir adım-adım prosedürü sundu. Diğer hücre türleri için, ampirik TMRM veya H 2 DCF-DA için nihai konsantrasyonu ve yüklenme zamanını belirlemek çok önemlidir. Genel olarak, 20-200 nM TMRM konsantrasyonlarının aralığı ve TMRM hücre inkübasyon süresi 20 ila 60 dakika arasında değişir. H 2 final konsantrasyon DCF-DA 2-10 mcM aralıkları ve Bu gösterge içeren bir yükleme çözüm hücreler inkübasyon 30-45 dakika arasında değişir. Herhangi bir uyaran yokluğunda hücreleri ve floresan yoğunluğu değişiklikleri (örneğin TMRM floresan titremeyi) hem fotoğraf toksisitesini önlemek için fotoğraf çekmek, lazer gücü ve yüksek tarama hızı optimize etmek için çok önemlidir. Optimize edilmiş optik ayarları uyaran yokluğunda (eşik) doymuş altında veya üstünde bir floresan sinyal sonuçlanması gerekiyor. 10-15 dakika canlı görüntüleme için herhangi bir uyarıcı olmaması halinde prob floresan yoğunluğu herhangi bir değişiklik olduğunda, belirli bir lazer güç ve tarama hızı Seçilen bir alandan görüntü toplamak için en uygun koşulları elde edilmektedir. Diğer ΔΨm belirlemek için floresans problar rodamin 123 ve tetra metil rodamin etil ester (TMRE) içerir. Ancak, izole mitokondri 2 solunum proseslerini inhibe etmek bulundu. Önemlisi, TMRM düşük konsantrasyonlarda 2 mitokondriyal solunum üzerine etkisi yoktur ve düşük fototoksisite ve diğer problar ile karşılaştırıldığında 3 photobleaching vardır. H 2 DCF-DA hücrelerde muhafaza edilir ROS için iyi bir göstergedir ve bu peroksitler gibi bazı oksidan türlerin, süper oksitler ve nitrik oksit 4 tanır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Cam alt kültür çanak </td><td> Mattek Corporation&#39;ın </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF-DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D-glikoz </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons

Mitokondrial membran potansiyeli (ΔΨm) ATP üretmek için solunum zinciri fizyolojik fonksiyonu korumak için kritik öneme sahiptir. ΔΨm önemli bir kaybı ölüme enerji tükenmiş hücreleri vermektedir. Reaktif oksijen türleri (ROS), önemli sinyal molekülleri, ancak patolojik durumların kendi birikimi oksidatif strese yol açar. Hücrelerde ROS iki önemli kaynakları, çevresel toksinler ve oksidatif fosforilasyon sürecinde. Mitokondriyal disfonksiyon ve oksidatif stres birçok hastalığın patofizyolojisinde suçlanmıştır, bu nedenle ΔΨm ve ROS belirleme yeteneği hücre ve mitokondri fonksiyonu fizyolojik durumu hakkında önemli ipuçları sağlayabilir. Birkaç floresan probları (rodamin 123, TMRM, TMRE, JC-1) hücre tiplerinin çeşitli Δψm belirlemek için kullanılır ve çok sayıda floresan göstergeleri (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) ROS belirlemek için kullanılabilir . Neredeyse tüm ΔΨm veya ROS değerlendirmek için kullanılan floresan probları ΔΨm veya ROS düzeylerini artırır veya azaltır bir uyarıcı ile orantılı olarak floresan yoğunluğu artırmak veya azaltmak tek dalga boyu göstergeleri. Bu nedenle, temel düzeyde ve belirli bir uyaran uygulamasından sonra bu problar floresan yoğunluğu ölçmek için zorunludur. Bu bir değişim, temel seviye ve bir uyarıcı arasında floresan yoğunluğu oranını belirlemek için izin verir. Bu değişiklik, floresan ΔΨm veya ROS göreli seviyeleri değişimi yansıtır. Bu video, biz, başlangıç ​​düzeyi arasında ve FCCP, mitokondriyal uncoupler uyguladıktan sonra TMRM floresan yoğunluğu yüzde değişimi belirlemek için fare kortikal nöronların floresan gösterge, TMRM, nasıl uygulanacağını göstermektedir. TMRM floresan FCCP tedavi kaynaklanan düşük seviyelerde mitokondriyal membran potansiyelinin depolarizasyon yansıtmaktadır. Ayrıca floresan prob H 2 DCF-DA sonra H 2 O 2 uygulaması başlangıçta ilk kortikal nöronlarda ROS düzeyi, değerlendirmek ve nasıl uygulanacağını gösteriyor. Bu protokol aynı zamanda (küçük değişiklikler ile) farklı hücre tipleri ve diğer beyin bölgeleri izole nöronların ΔΨm ve ROS değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons at JoVE.com

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Biz belirli bir uyaran uygulamasından önce ve sonra, TMRM floresan yoğunluğu göreceli değişiklikleri belirlemek için kortikal nöronlarda, floresan gösterge, TMRM uygulama göstermektedir. Ayrıca floresan prob H uygulanmasını göstermek<sub&gt; 2</sub&gt; DCF-DA kortikal nöronların reaktif oksijen türlerinin göreli seviyesini değerlendirmek için.

Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

determination-mitochondrial-membrane-potential-reactive-oxygen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

64.7K Görüntüleme.  Loyola University Chicago. Biz belirli bir uyaran uygulamasından önce ve sonra, TMRM floresan yoğunluğu göreceli değişiklikleri belirlemek için kortikal nöronlarda, floresan gösterge, TMRM uygulama göstermektedir. Ayrıca floresan prob H uygulanmasını göstermek 2 DCF-DA kortikal nöronların reaktif oksijen türlerinin göreli seviyesini değerlendirmek için.

Video: Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Nörobilim

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membran Yetişkin farelerin ventromedial Hipotalamus Nöronlar Potansiyel Boya Görüntüleme Glikoz Algılama Çalışması için

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

Stimulus-spesifik kortikal görsel uyarılmış potansiyel morfolojik desenler

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. In addition, photoreceptors also exhibit high aerobic glycolysis like cancer cells. Precise measurements of these metabolic activities can provide valuable insights into cellular homeostasis under physiological conditions and in disease states. High throughput microplate-based assays have been developed to measure mitochondrial respiration and various metabolic activities in live cells. However, a vast majority of these are developed for cultured cells and have not been optimized for intact tissue samples and for application ex vivo. Described here is a detailed step-by-step protocol, using microplate-based fluorescence technology, to directly measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration, as well as extracellular acidification rate (ECAR) as an indicator of glycolysis, in intact ex vivo retinal tissue. This method has been used to successfully assess metabolic activities in adult mouse retina and demonstrate its application in investigating cellular mechanisms of aging and disease.

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Described here is a detailed protocol for performing mitochondrial stress assay and glycolytic rate assay in ex vivo retinal tissue samples using a commercial bioanalyzer.

Ex Vivo Retinal Doku Örneklerinde Mitokondriyal Solunum ve Glikoliz Tayini

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...