Biz bu protokollerin geliştirme ve test verdikleri destek için SBI az personel ve bilim adamları kabul etmek istiyorum.

1. Ambalaj Plazmidler ile 293TN Hücreleri transfeksiyonu ve Expression Construct <ol><li> Tohum 7,0-8,0 x 10 4 mM L-glutamin, 4,5 g / l glukoz ve antibiyotikler olmadan fetal sığır serumu (% 10) ile desteklenmiş DMEM ortamı içeren kültür aracı maddesi 20 ml 15 cm 2 kültürü plakası başına 6 293TN hücreleri. Hücre yoğunluğu transfeksiyon sırasında konfluent% 60-80 ulaştığında, böylece 2 CO% 5 ile 37 ° C&#39;de 18-24 saat boyunca büyür. Bazı durumlarda, hedef hücrelerin transdüksiyonu için yeterince yüksek bir titresi elde etmek için hücre tohumu birkaç plakaları için gerekli olabilir. </li><li> Her bir hücre plakası, bir otoklav 2 ml Eppendorff tüpüne 1.6 ml serum içermeyen DMEM ekleyebilir. Lütfen lentivector 45 ul pPACKH1 veya pPACKF1 ve 4.5 mikrogram aşağı pipetleme tarafından DMEM ve karıştırın inşa ekleyin. </li><li> Aynı tüpe PureFection 55 ul ekleyin. 10 saniye vorteksleyin. Oda sıcaklığında f DMEM-Plazmid-PureFection karışımı inkübeya da 15 dak. </li><li> Doku kültürü plakası eşit plaka boyunca dağıtmak için hafifçe açılır bilge ve girdap DMEM-Plazmid-PureFection karışımı ekleyin. Inkübatöre çanak dönün ve% 5 CO 2 ile 37 ° C&#39;de büyür. </li><li> Transfeksiyondan sonra ortamı değiştirmek için gerek yoktur. Lütfen lentivector yapı GFP gibi bir floresan proteini kodlayan bir gen ifade varsa, 12-24 saat transfeksiyondan sonra mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Sen transfeksiyon başarılı olduğunu belirten,&gt;% 90 GFP pozitif hücreler görmek gerekir. </li><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne steril bir hücre kültürü 48 sonrası supernatant toplamak ve 72 saat. Bu, hücre kültür yüzey artık bulaşıcı pseudoviral parçacıklar içerir. Pelet oda sıcaklığında 15 dakika hücresel enkaz 1.500 xg&#39;de (BSL-2 emniyet sınıfı ile çalışmak için önerilen yönergeleri izleyin.) Santrifüj. Pelet bozmayacak sağlayacak yeni tüp için viral süpernatant aktarın. </li><li> Viral ambalaj için kullanılmış olan hücre, bir 293TN biohazard kap içinde elden ve viral ambalaj daha tur için kullanılmak üzere değildir edilmelidir. </li></ol> 2. Viral Süpernatant konsantrasyonu <ol><li> 1 soğuk hacmi (4 ° C) lentiviral parçacık içeren süpernatant her 4 cilt için PEG-it Virüs Yağış Çözüm. Ekle Büyük miktarlar lentiviral parçacıkların Çökelti Corning 250 ml polipropilen santrifüj tüpü ile elde edilebilir. Ters tüpler tarafından bir kaç kez çözeltisi karıştırın, fakat karışımı vorteks yoktur. </li><li> (4 güne kadar kabul edilebilir), en azından 12 saat boyunca 4 ° C sıcaklıkta çözelti soğutmak. Sallamayın veya soğutma adım sırasında tüpleri döndürmeyin. </li><li> 4 de 30 dakika boyunca 1500 x g&#39;de süpernatan / PEG-it karışımı santrifüje ° C. Santrifüjünden sonra lentiviral parçacıklar tüp alt kısmında bir bej veya beyaz bir pelet şeklinde görünür. Supernata dökmeknt. </li><li> Pelet içinde çöken lentiviral parçacıklar rahatsız özen, aspirasyon sıvısı tüm izlerini silmek. Izleri kalıntı PEG-it virüsü seyreltik edecek (böylece titresi azaltarak) fakat PEG-etkisiz ve toksik olmayan yana hedef hücrelerin bütünlüğü etkilemez. </li><li> Yeniden süspanse ve (4 ° C) kullanılarak soğuk orijinal hacminin 1/100 içinde lentiviral parçacıklar birleştirmek, steril fosfat tamponlu salin ya da DMEM 25 mM HEPES tampon içeren. </li><li> Kullanıma hazır olana kadar steril kriyojenik flakon ve -70 ° C mağaza içine tablet. </li></ol> 3. Hedef Hücre Viral Titering ve İletimi <ol><li> Biz hedef hücrelerin-of-ilgi transducing ve deneyler arasında tutarlılık için hedef hücreler için enfeksiyon uygun çokluğu (İçişleri Bakanlığı) hesaplamadan önce lentiviral parçacıklar titering öneririz. Viral titering için, bir kolay enfekte pozitif kontrol hattı olarak HT1080 hücreleri kullanmanızı öneririz. Pltitering protokolü paketledim lentiviral parçacıkların küçük bir kısım ile HT1080 hücreleri transducing içerdiğini unutmayın kolaylığı. Titresi bilinmektedir sonra, hedef hücreler-of-ilgi de üretilen lentiviral partikülleri ile transdük edilebilir. : Bir tavsiye titering protokol bulunabilir <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li> Hücre kültür ortamına bir 24-iyi plaka iyi başına Plaka 50.000 hedef hücrelerin-of-faiz. Hücreler normalde belirtilen kültür koşullarında in kültüre hücrelerin gecede büyümek olduğunu ortamları kullanın. Hücreler transdüksiyon gününde konfluent% 50 ile 70 arasında olmalıdır. </li><li> Transdüksiyon gününde, hücrelerden medya aspire. Bir 1 x nihai konsantrasyon (örneğin, 2.5 ul TransDux üzere 500 ul kültür ortamı) ile TransDux ile kültür ortamı birleştirir. Sonra TransDux-ce aktarmakher oyuğa ll kültür ortamı karışımı. </li><li> Her oyuğuna hedef hücreler için MOI optimum tekabül virüsünün uygun hacimde Pipeti. Optimum MOI bilinmiyorsa, farklı Mois bir dizi (örneğin, bir MOI 1, 2 ve 5 doku kültür hücre kolay-enfekte için, ve bir MOI daha zor-etmek için 1, 10 ve 20 olarak çalışan önermektedir ) birincil hücreleri enfekte. Lentiviral parçacıkların konsantrasyonu (gibi bir virüs titering protokolü ile belirlenir) bilinmiyorsa, virüsün farklı birimleri gibi virüs 1, 2 ve 5 ul olarak, denenebilir. Virüs 72 saate kadar için hedef hücreler ile temas halinde kalabilmektedir. </li><li> Ile daha da deneyler hedef hücreler-of-ilgi transdük viral yapı konak hücrenin genomu içine entegre sonra, transdüksiyon 72 saat sonra başlatılabilir. Kendi özel ihtiyaçlarına göre hücre-of-ilgi orta ve geçit hedef değiştirin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <p293TN hücrelerin class = &quot;jove_step&quot;&gt; Transfeksiyon 293TN hücrelerin başlangıç ​​yoğunluğu başarılı viral ambalaj için önemlidir. 293TN hücrelerinin transfeksiyonu gün (Şekil 2)% 60 -80 arasındaki konfluent olmalıdır. 293TN hücrelerin% 60 konfluent daha az varsa, onları transfeksiyon başlamadan önce bir kaç saat daha büyümeye olanak sağlar. 293TN hücreleri&gt;% 80 konfluent olduklarında, transfeksiyondan önce kaplandı edilmelidir. Bir lentivector ifade GFP kullanılıyorsa, 293TN hücrelerin en az% 90, başarılı bir transfeksiyon (Şekil 3) gösteren, transfeksiyondan 24 saat sonra, yeşil floresan gerekir. Hücrelerin% 90&#39;ından daha az GFP-olumlu ise, bu transfeksiyon olabilecek şekilde başarılı olmadığı gösterir, ve viral titreleri düşük olacaktır, çünkü, sonraki adıma değildir. Bunun yerine, plaka yeni 293TN hücreleri ve transfekte önce 293TN hücrelerin uygun hücre yoğunluğu az olduğundan emin olarak, baştan başlamak. 293TN hücreleri 48-72 saat transfeksiyondan sonra doku kültürü plakaları çekip olabilir. Bu olumsuz lentiviral partiküllerin üretimi etkilemez. HT1080 Hücreleri ile Titering Viral titreleri üreticinin talimatlarına göre SBI Küresel ultrahızlı bireylerde Titering kiti kullanılarak hesaplanabilir. Bu sistem, hücreleri içine HT1080 lentiviral vektöründen WPRE sekansının viral entegrasyonu ölçmek için qPCR kullanmaktadır ve doğru bir ml için enfeksiyöz birimi (Şekil 4) ölçmek için bir genomik dizisi referans dayanan, bir standart eğri ile kıyaslar. Hedef Hücre İletimi Bir yapısal olarak aktif GFP işaretleyici ifade lentiviral parçacıklar kullanıyorsanız transdüksiyon reaksiyon çalışıyorsa, GFP pozitif hücrelerin, iletimi 12-24 saat içinde görünmeye başlayacaktır. Lentiviral yapı stabil t entegre sonra GFP devam etmeliO hücre genomu ev sahipliği yapacak. Farklı Mois ile transducing ise, GFP floresans yaklaşık İçişleri Bakanlığı, düşük Mois GFP floresans (Şekil 5) artış gösterirler az GFP floresans ve yüksek Mois gösterin eşleşmesi gerekir. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Viral üretim protokol bakış. Lentivector ve pPACK ambalaj plazmidler karıştırılır ve 293TN hücrelerine birlikte transfekte edilir. 48 -72 saat sonra, süpernatan viral toplanır, ve viral partiküllerin PEG-it ile çökeltilir. Lentiviral parçacıklar titering sonra, hücre-of-faiz hedef transdüksiyonu için kullanılabilir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> 293TN hücrelerinin Şekil 2. Faz kontrastlı görüntü. Hücre Density% 60-80 konfluent transfeksiyon gününde arasında olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. 24 saat Purefection, pPACKH1, ve bir kodlama GFP lentivector yapı ile transfeksiyondan sonra GFP-pozitif hücrelerinin 293TN Fluorescent görüntüsü. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. WPRE qPCR sonuçlar ve İçişleri Bakanlığı ve ambalajlı viral parçacıkların ilgili titresi hesaplamak için SBI Küresel ultrahızlı bireylerde Titering kiti kullanılarak elde edilen standart eğri. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> HT1080 hücre Şekil 5. Floresan görüntüleri lentivirüs artan miktarlarda ile transdük. Görüntüler 72 saat sonrası transdüksiyon gelmektedir.

<ol>
	<li>Cann, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Viruses. A Practical Approach. , (2000).</li><li>Gould, D. J., Favorov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">Vectors for the treatment of autoimmune diseases.</a> Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfer,+integration,+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector.">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Dull, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Federico, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lentivirus Gene Engineering Protocols. , (2003).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).</li><li>Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells.">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).</li><li>Kim, A., Pyykko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+versatile+use+of+PiggyBac+transposons+as+a+genetic+manipulation+tool.">Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool.</a> Mol. Cell Biochem. , (2011).</li></ol>

Bu video makaleye Üretim ve Serbest Erişim Sistemi Biosciences tarafından desteklenmektedir.

Bu viral ambalaj ve hedef hücreleri protokol iletimi SBI viral ambalaj reaktifleri ile kullanım için optimize edilmiştir. Diğer ajanların ikamesi protokol sonucu etkileyebilir. Bu protokol, sadece lentiviral üretimi için optimize edilmiş ve virüsler veya pseudoviruses diğer tip üretilmesi için uygun olmayabilir. Başarılı viral ambalaj birkaç önemli adım bağlıdır. 293TN hücrelerin hücre kültür yüzey içine lentiviral parçacıkların salgılanması için mutlaka gerekli olan SV40 büyük T antijeni eksprese eder. 293TN hücreler transfeksiyondan sırasında hangi az yoğunlukta yeterince hücrelerine lentivector ve ambalaj plazmidler aktarmak için PureFection reaktifin için özellikle önem taşımaktadır. Iyice plakası girdapladıktan takiben bir damla-akıllı şekilde doku kültür levhasına PureFection karışımı ekleme ambalaj plasmidlerin dağıtılması için önemlidirve lentivector hücrelerin tümü boyunca inşa. Uygun vektörler dağıtmak için yetmezliği üretilen yetersiz lentiviral partikülleri ile sonuçlanabilir. Viral ambalaj reaksiyon doku kültür plakaları yüzey alanı üzerine dayanan, yüksek titresi virüsünün üretimi için büyütülebilir. Bir paketlenmiş gereken yapı başına 293TN hücre plakası çeşitli doku kültürü yemekleri seçebilirsiniz. Viral süpernatantları konsantrasyonu yüksek titrede virus oluşturmada özellikle yararlıdır. Hücrelerinin birden plakalardan viral süpernatan bir araya getirilmiş ve in vivo deneyler içinde kullanım için konsantre edilebilir, veya transdüksiyonu için zordur hücreleri için. Üretilen lentiviral parçacıklar Titering hedef hücrelerin transdüksiyonu için kullanılacak MOI doğru bir hesaplanması için de önemlidir. Belirli bir iletim kullanılabilir olduğunu bilmek MOI transdüksiyon başarılı olmadığı durumlarda giderme sağlar. Örneğin, bir MOI olduğu kullanılarakçok düşük bir yapı-of-ilgi eksprese eden çok az Hedef hücrelerin sebep olabilir. Bir MOI çok yüksek olduğu kullanarak, ancak, stres belirtilerini gösteren hedef hücreler ile sonuçlanabilir. Hedefi, bir MOI hücrelerinin sağlığı korurken yapı-of-ilgi ifadesi maksimize olduğu kullanmaktır. Bu HT1080 hücrelerinde lentiviral yapı ile entegre bir kopya ölçen bir qPCR bazlı titering protokolü önermektedir iken, diğer titering yaklaşımlar, aynı zamanda örneğin p24 ELISA veya GFP-pozitif hücrelerin yüzdesi tahmin edilmesi gibi, kullanılabilirler. Hedef hücrelerin Başarılı iletimi de birkaç önemli faktöre bağlıdır. TransDux yüksek iletim verimliliği sağlayan benzersiz bir enfeksiyon reaktif olduğunu, ancak hücreleri için toksik değildir. TransDux genellikle hedef hücreler için toksik olup polybrene, yerine kullanılabilir. Hedef hücrelerin transdüksiyonu TransDux dahil edilmesi, viral partiküllerin üzerindeki yükleri nötralize etmek için yardımcı olur ve hücre içine virüsü olanaks. TransDux hücrelere toksik değildir, çünkü bu nedenle tek bir olasılığını arttırır lentiviral partiküller 72 saate kadar (viral yapıları konak hücre genomunun içine bütünleşik olan süreyi) etmek için hücre ile temas içinde kalmalarının izin verebilir viral parçacıkların hücreye girerek. Bazı zor olan iletiminde hücreleri için transductions transdüksiyon etkinliğini artırmak için izleyen günlerde tekrar edilebilir. Örneğin, 1. günde hücreleri transdüksiyonu, hücrelerin gün 2 dayanmasına izin ve sonra 3. günde tekrar hücreleri transdüksiyonu. Bu, hedef hücrelerin seçimini başlangıcında, başka deneyler ya karakterizasyonu önce son transdüksiyon sonra 72 saat beklemek için önemlidir. Verimli viral ambalaj 5 &#39;ve 3&#39;LTR bölgeler arasında, aynı zamanda lentiviral yapı boyutuna bağlıdır. Lentiviral yapının Bu bölüm, yerli HIV genomunun boyutu karşılık yaklaşık 9 kb veya daha az, olmalıdır. 9 kb mayıs de aşılmasıüretilen pseudoviral parçacıkların kırışıklık titresi. Yeni teknoloji, böyle piggyBac transpozon vektörler gibi, kadar tek bir transfeksiyon ile 100 kb transgenlerin güvenilir, istikrarlı bir entegrasyon için izin verir. Bu yaklaşım, hedef hücre transferinde mümkündür durumlarda lentiviral vektörler için boyut sınırı, aşan yapılar için kullanılan ve viral bir ambalaj adım 9,10 gerek kalmadan ek bir avantaj sağlar olabilir. Bu protokol kullanılarak üretilen pseudoviral parçacıklar çoğu memeli hücre tipleri bulaşabileceğini de bulaşıcıdır. Bu protokolde kullanılan ürünler, ancak bunlar non-kopyelenebilir ve kendinden inaktive pseudoviruses üreten üçüncü nesil biosafe vardır. Bu nedenle, bir hedef hücre ya da hayvanlarda enfeksiyöz veya bulaşıcı olmayan hedef hücre ya da hayvanlarda, içine transdük. Bir biyogüvenlik tavsiye edilen olmamakla birlikte, üçüncü nesil biosafe olmayan başka lentivector plasmidlerin ikamesi mümkündürbakış açısı. Viral üretim protokolü ve hedef hücrelerin sonraki transdüksiyon NIH yönergelere 11 göre, Biyogüvenlik Seviyesi 2 altında yapılmalıdır ve viral parçacıkların tutarken araştırmacıların her zaman bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giymelidir. İkinci 293TN üreticisi hücreler, viral parçacıkların, ve tek kullanımlık pipetler tüpleri uygun bir biyolojik tehlikeli kaba atılmalıdır. Yeniden pipetler ve cam suyu ile dekontamine ve personelin maruz azaltmak için otoklav edilmelidir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM Yüksek Glukoz Orta </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> 293TN Hücreleri </td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> HIV-bazlı lentivectors için </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> FIV bazlı lentivectors için </td></tr><tr><td> Herhangi lentiviral vektör </td><td> SBI </td><td> Çeşitli </td><td> cDNA, shRNA, mikroRNA, transkripsiyon gazetecilere </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-it </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Küresel ultrahızlı bireylerde Titering kiti </td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td> Bu protokolde tarif fakat viral partiküllerin titresi için gerekli değildir </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

packaging hiv- or fiv-based lentivector expression constructs &amp; transduction of vsv-g pseudotyped viral particles

Standart plazmid vektörler de olduğu gibi, bu efektörlerinin geçici ifade elde etmek için düşük-orta verimlilik ile hücrelere plazmid formunda lentivectors transfekte etmek mümkündür. Pseudoviral partiküller halinde ambalaj lentiviral ifade yapıları, buna karşın, primer, gövde ve farklılaşmış hücreler olarak zor olan transfekte hücreleri ile,% 100 transdüksiyon kadar sağlar. Dahası, tipik olarak bu tür dağıtım lentiviral transfeksiyon reaktifi 1, 2 toksisitesi kaynaklanan hücre ölümü gibi kimyasal Transfeksiyonlar, ile ilişkili özel hücresel yanıtları üretmemektedir. Hedef hücrelere transdük zaman, lentiviral yapı genomik DNA entegre ve küçük bir firkete RNA (shRNA), cDNA, mikroRNA ya da reporter gene 3, 4 ve stabil ifadesi sağlar. Stably efektör molekülü ifade hedef hücreler gibi ekspresyon vektörü puromycin veya GFP olarak inşa içinde bulunan bir seçilebilir işaretleyici kullanılarak izole edilebilir. Sonra psViral yapısal genler bulunmadığı ve uzun terminali tekrarlar (LTR) transdüksiyonu 5, 6 halinde kendi kendine inaktive olacak şekilde tasarlanmıştır, çünkü eudoviral parçacıkların hücreleri enfekte hedefi, bunlar hedef hücreler içindeki çoğaltmak olamaz. Verimli lentiviral ambalaj 1, 5, 6, 7 için gerekli olan üç ana bileşen vardır. <ol><li> Ambalaj için gerekli olan genetik öğeleri içeren bazı lentiviral ifade vektörü, viral ifade stabil entegrasyon genomik DNA oluşturmak ve efektör ya da reporter ifadesi. </li><li> Ifade RNA kopyası transkripsiyonu ve paketleme için gerekli proteinleri sağlamak lentiviral ambalaj rekombinant plazmid pseudoviral parçacıklar halinde inşa. Bu protokol viral kat protein için HIV veya FIV genomu ve veziküler stomatit Virüs gr protein (VSV-G) pPACK gag şifreleyen plazmit (SBI), pol, ve devir kullanır. </li><li> 293TN üretmek<html> Yüksek titresi lentiviral üretimi ve bakım için hücreler yeniden oluşturulması için kullanışlı bir neomisin direnç geni, gereklidir SV40 büyük T antijen, hücre ifade r (HEK293 hücrelerden türetilmiş). </li></ol> Viral üretimi protokolünün bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de görülebilir. Viral üretimi lentiviral ekspresyon vektörü ve ambalaj plazmit ile ko-transfekte 293TN yapımcı hücreleri tarafından başlatılır. Viral partiküllerin ortam içine salgılanan. 48-72 saat sonra, hücre kültür ortamı hasat edilir. Hücre döküntüleri hücre kültür ortamından kaldırılır ve viral partiküllerin konsantrasyonu için PEG-onunla santrifüj yoluyla çökeltilir. Üretilen lentiviral parçacıklar daha sonra titre edilmiştir ve hedef hücreler transdüksiyonu için kullanılabilir. Viral titering detayları bu protokol dahil değildir, fakat bulunabilir: ank &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. Bu protokol, gösterilen özel ürünleri kullanılarak optimize edilmiştir. Diğer reaktifler ikame edilebilir, fakat aynı sonuçlar garanti edilemez.

Watch this Scientific Journal Video about Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles at JoVE.com

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral ifade vektörlerinin stably memeli hücreleri ve tüm organizma bölünmesi ve non-bölünmesi farklı efektör moleküller ya da reporter yapıları ifade etmek için en etkili araçlardır. Burada pseudoviral parçacıklar lentivector ifade yapıları paketlemek için ve pseudoviral parçacıkları kullanarak hedef hücreleri transdüksiyonu için nasıl bir protokol sağlar.

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları &amp; VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.9K Görüntüleme.  System Biosciences. Lentiviral ifade vektörlerinin stably memeli hücreleri ve tüm organizma bölünmesi ve non-bölünmesi farklı efektör moleküller ya da reporter yapıları ifade etmek için en etkili araçlardır. Burada pseudoviral parçacıklar lentivector ifade yapıları paketlemek için ve pseudoviral parçacıkları kullanarak hedef hücreleri transdüksiyonu için nasıl bir protokol sağlar.

Video: Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

Tek hücreli Nefelometri mRNA ve yüzey Protein Simian virüs, immün yetmezlik enfekte CD4 ifadede+ T hücreleri izole Rhesus makak üzerinden

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Bir biyogüvenlik seviye 2 ortamda yüksek patojenik Coronaviruses çalışmaya Pseudotyped parçacıklar imalatı

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Psödotipli Virüslerle SARS-CoV-2'ye Karşı Serum Nötralizasyonunun Değerlendirilmesi

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Yazar Spotlight: Pseudotyped Virüslerle Konak-Virüs Etkileşimlerinin İncelenmesi 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

Nötralizasyon Testi Yoluyla SARS-CoV-2'ye Karşı Humoral İmmün Yanıtları İzlemek İçin Moleküler Bir Araç Olarak Psödotiplenmiş Virüsler

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...