Araştırma NSF ödül MCB-1021384 tarafından desteklenmektedir.

1. Anaerobik Tampon Hazırlanması <ol><li> 100 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7.5 1 L hazırlayın. Bir karıştırıcı çubuğa sahip bir 500 ml&#39;lik şişe içine Büchner tamponun 250 mL dökülür. </li><li> Bir lastik tıpa ile şişesi Seal ve bir karıştırma plaka üzerine yerleştirin. Bir Schlenk hattına balonun kısa tüp bağlayın. </li><li> Ajitasyon ile oda sıcaklığında 5 saat boyunca vakum altında Degas tamponu. Bu süre boyunca, her saat gaz giderme ve argon püskürtülerek vakum 5 eliniz gerçekleştirin. </li><li> 10 saniye için argon ile şişesi yıkayın ve vakum manifoldu ayırın. Torpido gözü içine konur. </li><li> Kuvvetli çalkalama ile gece torpido gözünde şişesi açık bırakın. </li></ol> 2. Durduruldu-akış Sistemi Oksijen Çıkarma <ol><li> 0.1 M sodyum asetat, pH 5.0 1 L hazırlayın. 250 ml Büchner balona bu tamponu 125 ml dökün ve adımları 1,2-1,4 gerçekleştirin. </li><li> 5 tarttınAspergillus Nijer (181.300 U / g) ve 0.9 g glukoz, 1.5 ml Eppendorf tüp ve 50 ml Falcon konik tüp kullanarak, sırasıyla gelen mg glukoz oksidaz. Torpido gözü içine hem kapları yerleştirin. </li><li> Anaerobik 0.1 M sodyum asetat, pH 5.0 (nihai 18,13 U / mL &#39;lik konsantrasyonu ve 100 mM, sırasıyla) 50 mL glukoz oksidaz ve glikoz eritilir. Bu çözelti (Şekil 1) ile rezervuar şırınga doldurun. </li><li> Sürücü vanalar &quot;yük&quot; konumunda olduğundan emin olun ve sürücü şırınga (Şekil 1) doldurun. &quot;Sürücü&quot; konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F tampon itin. Bu adımı toplam on kez tekrarlayın. Diğer üç sürücü şırınga ile aynı işlemi uygulayın. Bir saat bekleyin. </li><li> Aynı tampon contai ile rezervuar şırınga çözeltisi yeriniglukoz oksidaz ve glikoz ning. Adım 2.4 tekrarlayın. </li><li> Tekrar 2.5 adım ve çözüm gecede akış sistemi içinde bekletin. </li><li> Gecelik inkübasyondan sonra, tekrar 2.5 adım. </li></ol> 3. Oksijen Doymuş Tampon Hazırlanması <ol><li> 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) hazırlanması ve bir karıştırma çubuğuna sahip bir 50-ml şişe içinde 50 mL dökülür. Bir Wheaton stoper ve bir Wheaton alüminyum mühür ile flakon kap. </li><li> Buz üzerinde şişe yerleştirin. Çözeltisine% 100 oksijen içeren bir tanka bağlı uzun bir iğne batırmak. Bir kanat olarak flakonun stoper üzerinden başka bir kısa iğne yerleştirin. </li><li> Ajitasyon ile 1 saat% 100 oksijen ile Kabarcık çözüm. </li><li> İlk tüpten kısa iğne kaldırmak ve uzun bir iğne çıkarmadan önce 10 saniye bekleyin. Torpido kapalı şişe yerleştirin. </li></ol> 4. NADPH Çözüm hazırlanması <ol><li> 1.5 ml Eppendorf tüp NADPH 1 mg tartılarak i yerleştirintorpido gözü içine t. </li><li> Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7.5, 300 uL NADPH eritilir. Bir spektrofotometre (ε 340 nm = 6,270 M -1 cm -1) ile NADPH konsantrasyonunu belirlemek için torpido gözü bu çözüm 30 uL çıkarın. </li></ol> 5.. Enzim Çözüm gelen oksijen giderimi <ol><li> Torpido gözünde dondurucu ve çözülme enzimini stok solüsyonundan 400 uL atın. Enzim stok solüsyonu (360 uM), daha önce 100 mM NaCl ihtiva eden 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) hazırlanmış ve sıvı azot içinde donduruldu. </li><li> Bir karıştırma çubuğu ile 25 ml şişeye enzim çözeltisi aktarın, bir Wheaton stoper ve bir Wheaton alüminyum mühür ile flakon kap ve torpido gözü kaldırmak. </li><li> Buz üzerinde şişe yerleştirin ve flakon stoper ile bir iğne sokarak bir Schlenk hattına bağlayın. </li><li> Degas 5 eliniz gerçekleştirerek enzim solüsyonu1 saat boyunca her 20 dakikada bir gaz alma ve argon püskürtülerek temizlenmelidir. </li><li> 10 saniye için argon ile flakon yıkayın ve vakum manifoldu ayırın. Torpido gözü içindeki buz üzerinde şişe yerleştirin. </li></ol> 6. Redüktif Half-tepki: İzleme Flavin Azaltma <ol><li> Durdu akışı enstrüman ve üreticinin protokolü takip tek karıştırma modu için Pro-Data kontrol yazılımı hazırlayın. </li><li> Bir dolaşan su banyosunda (15 ° C) açın. 20 dakika için azot gazı ile yoluyla su oksijen çıkarın. Bu akış devresi yoluyla oksijen kirlenmesini önleyen. </li><li> Dolaşımdaki banyosuna durduruldu-akış su banyosu gövde bağlayarak sürücü şırınga sıcaklıkta ve 15 ° C gözlem hücre korur. </li><li> Pro-Data kontrol yazılımı seçin Photodiode Array, Dış tetik (durdu akışı işlemini aktif) ve Logarit ve Denetim Masası penceresindehmic ölçek. </li><li> Pro-Data görüntüleyici yazılımı başlatın ve veri dosyalarını saklanacağı dizini tanımlar. </li><li> Rezervuar şırınga C ve oksijensiz 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) ile F çözeltisi yerine geçer. &quot;Sürücü&quot; konumuna C ve F vanaları kapatın. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Manuel (ram her hareketinden önce Boş tıklayın) toplam ram beş kez ilgili sürücü yükselterek akım devresi boyunca her iki sürücü şırınga olan tampon itin. </li><li> Bu glukoz oksidaz akım devresi tamamen kaldırılmıştır sağlamak amacıyla, toplam 6.6 dört kez adım gerçekleştirin. </li><li> Pro-Data kontrol yazılımı bazal tıklayın. </li><li> Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponunda (15 uM durduruldu akışta karıştırıldıktan sonra nihai konsantrasyon) ile 1100 uL enzim stok solüsyonundan 100 ul karıştırılır. </li><li> Rezervuar syr çözümü değiştirinenzim solüsyonu ile birlikte inge F. &quot;Sürücü&quot; konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F enzim çözeltisi itin. Toplam üç kere uygulayın. Pro-Data kontrol yazılımı, 60 s edinimi süresi ayarlayın. </li><li> Her iki sürücü şırıngalar sürücü şırınga pistonları ile temasta bulunan bunlara karşılık gelen çözümleri ve sürücü koç ile dolu olduğundan emin olun. &quot;Sürücü&quot; konumuna hem vanaları açın ve sürücü gerçekleştirmek için Pro-Data kontrolü yazılımı Acquire tıklatın. Üç kopya olarak verileri elde etmek için iki kat daha fazla bu adımı yineleyin. Enzim okside formunda bu verimler spektrumları. </li><li> Sürücüleri elde A 452 nm değeri kullanılarak, (ε 452 nm = 13.700 M -1 cm -1) karıştırmadan önce enzim konsantrasyonunun belirlenmesi ve NADPH eriyik 4 mL hazırlanmasın 1,5 kat daha konsantre. </li><li> NADPH çözüm ve 6.10 açıklandığı gibi boş ve dolum durdurma şırınga üç kez rezervuar şırınga C çözümü değiştirin. </li><li> Adım 6.11 tekrarlayın. Enzim indirgeme sırasında bu verimler spektrumları. </li></ol> 7. Oksidatif Half-tepki: İzleme Flavin Oksidasyon <ol><li> Durdu akışı enstrüman ve üreticinin protokolü takip çift karıştırma modu için Pro-Data kontrol yazılımı hazırlayın. </li><li> 6,2-6,5 adımları tekrarlayın. </li><li> Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) ile birlikte dört rezervuar şırınga içinde çözelti yerine geçer. &quot;Sürücü&quot; konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F tampon itin. Her sürücü şırınga ile toplam beş kez bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Tot 7.3 dört kez adım gerçekleştirinarkadaşları, tamamen akış devresinden içeriğini çıkarmak için kullanılır. </li><li> Pro-Data kontrol yazılımı bazal tıklayın. </li><li> Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponunda (15 uM durduruldu akışta karıştırıldıktan sonra nihai konsantrasyon) ile 1000 uL enzim stok solüsyonundan 200 ul karıştırılır. </li><li> Bir enzim solüsyonu ile birlikte rezervuar şırınganın çözeltisi yerine geçer. &quot;Sürücü&quot; konumuna bir kapak kapatın. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek sürücü şırıngadan bir akım devresi aracılığıyla enzim çözeltisi itin. Bu adımı toplam üç kez uygulayın. Pro-Data kontrol yazılımı olarak, 0,5 s gecikme süresi ve 60 s edinimi süresi ayarlayın. </li><li> Tüm sürücü şırıngalar sürücü şırınga pistonları ile temasta bulunan bunlara karşılık gelen çözümleri ve sürücü koç ile dolu olduğundan emin olun. &quot;Sürücü&quot; konumuna tüm vanaları açın ve Pro-Dat in Acquire tıklayınsürücü gerçekleştirmek için bir kontrol yazılımı. Üç kopya olarak verileri elde etmek için bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Enzim okside formunda bu verimler spektrumları. </li><li> Şırınga A&#39;da enzim solüsyonu &quot;sürücü&quot; pozisyonu ve boş ve dolum durdurma şırınga 7,7 açıklanan üç kez B vana açma &#39;den 1.5 kat daha konsantre bir NADPH çözümü ile rezervuar şırınga B çözümü değiştirin. </li><li> Oksijenli tamponu ile rezervuar şırınga C çözümü değiştirin. &quot;Sürücü&quot; pozisyonu ve boş ve dolum durdurma şırınga 7.7 açıklandığı gibi üç defa C vana çevirin. Pro-Data kontrol yazılımı olarak, sırasıyla 15 ve 900 s gecikme ve satın alma zamanını ayarlayın. </li><li> Adım 7.8 tekrarlayın. Tamamen indirgenmiş enzim reoxidation sırasında bu verimler spektrumları. </li></ol> 8. Veri Analizi <ol><li> Pro-Data Converter yazılımı başlatın. Seçenekler simgesini tıklayın ve ProDataCSV Kaydet seçeneğini seçin. </li><li> Açıkveri dosyalarını dizinini muhafaza edildi. APL Pro-Data dönüştürücü penceresine dosyaları sürükleyin. Veriler aynı dizinde CSV formatında dosyalar otomatik olarak kaydedilecektir. </li><li> Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, ABD) ile CSV formatında dosyaları açın. 700 nm&#39;de absorpsiyon karşılık gelen çıkarılarak durduruldu-akış izlerinin taban normalize. </li><li> Uygun üstel fonksiyonu için zamana karşı gelen maksimum absorbans arsa takarak KaleidaGraph (Sinerji Yazılım, Reading, PA) kullanılarak düzeltilebilir izlerini analiz edin. Şekil 2B, durdurulmuş-akış cihazı içinde enzim ve NADPH karıştırıldıktan sonra flavin redüksiyon oranını belirlemek üzere, zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir 452 nm&#39;de absorbans gösterilmiştir. Bu durumda, veri en uygun redüksiyon, res birinci ve ikinci faz için hesaplanmış bir çift üstel denklemi ve 0.65 ve 0.23 s -1 oranları kullanılarak elde edilmiştirolarak bulundu. C4a-hydroperoxyflavin ara ve oksijen ile indirgenmiş enzim reaksiyonu sonrasında reoxidation oluşum oranını belirlemek için, sırasıyla, 380 ve 452 nm, (Şekil 3B) olarak durdurulur-akış izleri analiz edilmiştir. Tek bir üstel denklemi kullanılarak, sırasıyla, yarı-reaksiyonu oksidatif birinci ve ikinci adımı için 1.4 ve 0,006 s -1 oranları hesaplandı. </li></ol> 9. Temsilcisi Sonuçlar Önceki bölümlerde açıklandığı deneyler sonucu bir f Sida indirgeyici yarı-tepkimesi flavin indirgenmiş durumunu değişikliklere karşılık 452 nm de absorbans değişiklikler ölçülerek kontrol edilebilir göstermek. Bu adımın oranı uygun denklemi (; Adım 8,4 Şekil 2) &#39;ye uyan verileri tarafından tespit edilebilir. Elde edilen giderme oranı (0.65 s-1) ile hesaplanan k kedi değeri benzerindirgeme reaksiyonu hızını-belirleyici adım olduğunu düşündürmektedir kararlı durum deneyler 2,. Durduruldu-akış çift karıştırma modu yararlanarak, oksidasyon ve bu yarı-reaksiyonda aramaddelerinin oranı (; Adım 8,4 Şekil 3) tespit edilebilir. A f Sida tarafından katalizlenen reaksiyon olarak, C4a-hydroperoxyflavin açıkça (380 nm λ max) algılanır ve oluşumu ve çürüme oranı hesaplanabilir. Elde edilen reoxidation (0,006 s -1) ile yavaş oranı C4a-hydroperoxyflavin yokluğunda ornitin çok kararlı olduğunu göstermektedir. <img alt="Şema 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> A f Sida şeması 1. Mekanizması. FAD kofaktör arasında isoallozaxine halkası gösterilmiştir. Okside flavin (A), NADPH (B) bağlanır ve azaltılmış flavin ve NADP + (C) oluşturmak üzere reaksiyona girer. Moleküler oksijen ve bağlayıcı ile reaksiyondan sonraornitin, C4a-hydroperoxyflavin (D) oluşur. Bu hydroxylating türdür. Ornitin hidroksillenmesi sonra, hydroxyflavin (E) okside enzim oluşturmak üzere susuz olmalıdır. NADP + katalitik döngüsü boyunca bağlı kalır ve (F) çıkacak son üründür. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Şekil 1. Durdu akış alet. A) Applied Photophysics SX20 bileşenlerinin Resim durduruldu-akış spektrofotometre. B numune işleme birimi) Resim. Çift karıştırma modunda akım devresi C) Programı. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Şekil 2. Durdu akış enstrüman NADPH ile Sida anaerobik azaltılması. 30 uM Sida ve 45 mM NADPH eşit hacimlerde karıştırıldıktan sonra kaydedilen A) Spektral değişir. İlk tayfı (SIDA okside) ve son tayfı (tam Sid azaltılmışA) mavi ve kırmızı sırasıyla vurgulanır. Zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedildi 452 nm&#39;de B) absorbans iz. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Durdu akış enstrüman Sida Şekil 3. Oksidasyonu. A) tamamen indirgenmiş Sida ve oksijenli tampon karıştırma eşit hacimlerde sonra Spectral değişiklikleri kaydedildi. Nihai konsantrasyon 15 uM Sida, 22.5 mM NADPH, ve 0.95 mM oksijen edildi. Tayfı 0,034, 4,268 kaydedildi ve 727,494 s, sırasıyla, tamamen indirgenmiş enzim, C4a-hydroperoxyflavin ara madde (380 nm λ max), ve oksitlenmiş enzim (450 nm λ max) karşılık gelir. B) 382 ve 452 nm&#39;de absorbans iz zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedildi.

<ol>
	<li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA,+encoding+L&#45;ornithine+N5&#45;oxygenase,+is+required+for+virulence.">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L&#45;ornithine N5&#45;oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li><li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor.">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li><li>Mayfield, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+spectroscopic,+steady+state,+and+transient+kinetic+studies+of+a+representative+siderophore&#45;associated+flavin+monooxygenase.">Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore&#45;associated flavin monooxygenase.</a> J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).</li><li>Fierke, C. A., Hammes, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+kinetic+approaches+to+enzyme+mechanisms.">Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms.</a> Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , (2009).</li><li>Palfey, B. A., McDonald, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalysis+in+flavin-dependent+monooxygenases.">Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases.</a> Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).</li><li>van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+monooxygenases,+a+diverse+class+of+oxidative+biocatalysts.">Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts.</a> J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).</li><li>Chapman, S. K., Reid, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flavoprotein Protocols. , (1999).</li><li>Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+and+primary+deuterium+isotope+effects+show+that+lactate+CH+and+OH+bond+cleavage+are+concerted+in+Y254F+flavocytochrome+b2,+consistent+with+a+hydride+transfer+mechanism.">Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism.</a> Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).</li><li>Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituent+effects+on+the+reaction+of+Î²-benzoylalanines+with+Pseudomonas+fluorescens+kynureninase.">Substituent effects on the reaction of Î²-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase.</a> Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).</li><li>Yun, D., Garc&#237;a-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III)+complex+as+a+precursor+to+the+diiron(III/IV)+intermediate+X+in+the+assembly+of+the+iron&#45;radical+cofactor+of+ribonucleotide+reductase+from+mouse.">(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron&#45;radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse.</a> Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).</li><li>Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+salt+and+pH+on+the+reductive+half-reaction+of+Mycobacterium+tuberculosis+FprA+with+NADPH+Biochemistry.">Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry.</a> Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).</li><li>Patil, P. V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments.">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Redoks tepkimeleri katalizleyen enzimlere genellikle katalitik döngüsü sırasında önemli absorbans değişikliklere hem, normal şartlarda ve flavinler gibi kofaktörler içerir. Flavin ve okside formu ~ 360 ve 450 nm &#39;maxima sunar, ve onun azaltma genellikle 450 nm 7 absorbans azalması sonucu izlenir. Genel olarak, bazı geçici ara mevcut fakat düzenli spektrofotometrelerde ölçülecek formu ve çürüme çok hızlıdır. Applied Photophysics SX20 durduruldu-akış spektrofotometre (ya da benzer araç) kullanılarak, bu milisaniyelik zaman ölçeği içinde absorbans (ölü zaman, 2 ms) ölçmek için mümkündür. Burada bir model olarak hizmet veren, flavin bağımlı monooksijenaz A f Sida indirgeyici ve oksidatif yarı-tepkimeleri okudu. Hidrit transfer hızı anaerobik koşullar altında NADPH ile enzim karıştırıldıktan sonra 452 nm&#39;de absorbans ile değişikliğinin ölçülmesi ile tespit edildi. Daha sonra, advantag alarakTam azalmanın elde edilene kadar durduruldu-akış aletinin çift karıştırma modunun e, enzim ilk ve sonra indirgenmiş enzim NADP + kompleksinin oksijen ile karıştırıldı, NADPH ile tepkimeye sokulmuştur. Bu prosedürü takiben, geçici oksijenli flavin ara algılamak ve oluşumu ve çürüme oranları ölçmek mümkündür. Bu ara maddelerin tanımlanması kataliz reaksiyona türlerinin doğası hakkında deneysel verileri sağlamaktadır. A f Sida, hydroxylating türdür C4a-hydroperoxyflavin (tipik olarak 370-380 nm&#39;de izlenir), oluşumu durumunda. Buna ek olarak, her bir adımı sürekli oranında ölçen bir reaksiyon oranı-belirleyici adım hakkında bilgi elde etmek ve enzim kinetik ve kimyasal mekanizmaları aydınlatmak için yardımcı sağlar. Genel olarak, benzer yöntemler proteinler gibi, diğer flavoenzymes veya meydana değiştirdiği absorbans için proteinleri için kullanılabileceğini devamain heme, piridoksal fosfat, veya non-heme demir 8-10. Bu yöntemin bir sınırlandırma enzimi saflaştırılmış büyük miktarlarda gerekli olduğunu, ancak bu yüksek verimle bir ifade sistemi kullanılarak aşılabilir. Bir yeterince güçlü bir sinyal tespit edilebilmesi için yeterli protein kullanılarak kayıt spektrası için uygun protein konsantrasyonu tespit, ancak çok böylece enzim boşa değildir. Tipik olarak, durduruldu-akış Deneylerde kullanılan flavin içeren enzimleri için en düşük Enzim konsantrasyonu 6-10 uM (karıştırma sonrası) ve enzimin karşılık gelen molar sönüm katsayısı kullanarak saptanır. A f Sida söz konusu olduğunda, enzim bağlı FAD yüzdesi% 50-65 2&#39;dir. Ciltli bir FAD kofaktör kataliz için gerekli olduğundan Apo-protein Bu deneylerde inaktif olarak kabul edilir. Bu yöntemin bir başka olası sınırlama bir enzim süreçlerini ortaya çıkarsa 2 daha hızlı ms (durdu-akış ölü zaman) bunlar görülemez, ancak there oranları bu sorunu aşmak için azaltılabilir stratejiler bildirilmiştir. Bunun bir örneği, bir ferrodoksin-NADP + redüktaz 11 reaksiyon yüksek bir NaCl konsantrasyonu kullanılarak içerir. Durduruldu-akış akış devresinden oksijen ovma genellikle bu deneyde zor bir adım ve özel bir dikkat gereklidir. Etkin ve ucuz bir yöntemdir burada açıklandığı gibi glukoz oksidaz-glikoz sistemi en laboratuvarlarda başarıyla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, H2O 2 üretimini içeren ve bazı uygulamalar için protocatechuate dioksigenaz-protocatechuate sistemi gibi diğer alternatifi 12 göz önüne alınmalıdır bazı sakıncaları vardır. Oksijensiz bir torpido gözü, kullanımı daha kolay anaerobik koşulları sağlamak için yapar, ancak şart değildir. Bu enzim oksijen yokluğunda azaltılabilir isteyen veya konsantrasyonda oksijen ile reaksiyona olarak oksijen durduruldu-akış akım devresi uzaklaştırılmalıdırbiz belirttiğiniz s. Durdu-akış torpido gözünde olmasına rağmen biz önceki deneylerde aerobik tamponlar kullanıldığı takdirde, oksijen akışı devrede var. Absorbans ölçümleri ek olarak, floresans ve sirküler dikroizm deneyleri karşılık gelen aksesuarlarla Applied Photophysics SX20 durduruldu-akış spektrofotometre içinde gerçekleştirilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Genel Laboratuvar Cihazları </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Vakum pompası </td><td> Şartları yerine getirmemek </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner şişeler </td><td> Balıkçı </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Barlar Stir </td><td> Balıkçı </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Plakalar Stir </td><td> Balıkçı </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk hatları </td><td> Kontes Cam </td><td> - </td></tr><tr><td> Argon tankı </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Azot tankı </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> Nitrojen tankı, ultra yüksek saflıkta notu </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Oksijen deposu </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% Hidrojen dengesini azot tankı </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 Stop-akış spektrofotometre </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Torpido gözü </td><td> Nazlı </td><td> - </td></tr><tr><td> Su banyosu </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Malzemeleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mL BD Falcon tüpler </td><td> Balıkçı </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 mL BD Falcon konik tüpler </td><td> Balıkçı </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1.5 mL Eppendorf mikrosantrifüj tüpler </td><td> Balıkçı </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 ve 25 mL cam şişe </td><td> Balıkçı </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Kauçuk tıpalar </td><td> Balıkçı </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Alüminyum mühürler </td><td> Balıkçı </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagents </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Potasyum fosfat, monobazik </td><td> Balıkçı </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Potasyum fosfat, çift bazlı </td><td> Balıkçı </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> Sodyum asetat </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> A. glukoz oksidaz Nijer </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-Glikoz </td><td> Balıkçı </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Balıkçı </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-Ornithine hidroklorür </td><td> Balıkçı </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderofor A (SIDA) (örn. ferricrocin veya N &#39;, N &quot;, N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1 ölümcüllük için gerekli olan hydroxamate siderofor biyosentezini in ornithine hidroksillenmesi katalize bir FAD içeren monooksijenaz olup. Sida tarafından katalizlenen reaksiyon indirgeyici ve oksidatif yarı-reaksiyonlar (Şema 1) ayrılabilir. yarı-tepkimesi indirgeyici, A f Sida bağlı okside ADÖ, NADPH 2,3 oranında azaltılır. yarı-reaksiyonu oksidatif olarak , azaltılmış kofaktör ornitine bir oksijen atomu aktaran C4a-hydroperoxyflavin orta oluşturmak için moleküler oksijen ile reaksiyona girer. Burada oranları ölçmek ve yüklü bir durdu akış aracı kullanarak Sida farklı spektral formları algılamak için bir prosedür tarif anaerobik torpido. durdu akış aracı olarak, reaktanlarının küçük hacimleri hızla karışık, ve sonrası akım th tarafından durduruldue durdur şırınganın (Şekil 1), gözlem hücre yerleştirilen çözelti spektral değişiklikler zamanla kaydedilmektedir. Deneyin ilk bölümünde, biz NADPH tarafından bir f Sida içinde flavin anaerobik azalma doğrudan ölçülür tek modunda durdu akış aleti nasıl kullanabileceğinizi göstermek. Daha sonra bir f Sida ilk anaerobik yaşlanan bir döngü içinde zaman belirli bir süre için NADPH azalır çift karıştırma ayarları kullanın ve sonra gözlem hücresi (Şekil 1) moleküler oksijen ile reaksiyona. Sadece indirgeyici yarı reaksiyon takip olduğunda, çözümlerin herhangi bir oksijen indirgenmiş flavin kofaktör ile reaksiyona ve sonuçta okside flavin geri azalacağı a-C4a hydroperoxyflavin ara oluşturacak, çünkü bu deney gerçekleştirmek amacıyla, anaerobik tamponlar gereklidir . Enz tam cirosu olacağını çünkü bu kullanıcının doğru azalma oranları ölçmek için izin vermediYme. Yarı-reaksiyonu oksidatif çalışılan edildiğinde enzim azaltılması ve oksidasyon arasında, sadece adımları gözlenir böylece oksijen yokluğunda azaltılması gerekir. Bu deneyde kullanılan tampon, bir oksijen, oksijen ve daha yüksek konsantrasyonlarda yarı-reaksiyonu oksidatif çalışma böylece doymuş olduğunu. Bunlar genellikle flavin içeren monooksijenazları ile indirgeyici veya oksidatif yarı-reaksiyonlar ya çalışılırken yapılan işlemlerdir. Durdu akışı ile yapılan ön kararlı durum deneylerin zaman ölçeği intrinsik hız sabitlerinin belirlenmesi ve reaksiyon 4 ara algılama ve tanımlama izin saniye milisaniye vardır. Burada açıklanan prosedürler diğer flavin-bağımlı monooksijenazları uygulanabilir. 5,6

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Bu indirgeyici ve oksidatif yarı-reaksiyonların her ikisi de araştırmak için bir durduruldu akış aletinin kullanımı açıklanmaktadır<em&gt; Aspergillus</em&gt; Siderofor A (SIDA), bir flavin bağımlı monooksijenaz. Daha sonra Sida ile reaksiyona türler tekabül spektrumları gösterir ve bunların kurulması için oran sabitleri hesaplamak.

Durduruldu-Akış Spektrofotometri kullanarak Flavin-Bağımlı monooksijenaz ve indirgeyici ve Oksidatif Yarı-Tepkime İzlenmesi

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

monitoring-reductive-oxidative-half-reactions-flavin-dependent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K Görüntüleme.  Virginia Polytechnic Institute and State University. Bu indirgeyici ve oksidatif yarı-reaksiyonların her ikisi de araştırmak için bir durduruldu akış aletinin kullanımı açıklanmaktadır Aspergillus Siderofor A (SIDA), bir flavin bağımlı monooksijenaz. Daha sonra Sida ile reaksiyona türler tekabül spektrumları gösterir ve bunların kurulması için oran sabitleri hesaplamak.

Video: Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Biyomühendislik

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the arterial wall lead to tissue injury, which initiates restenosis2-7. This hypothesis needs further investigations including better quantifications of non-uniform strain distribution on the artery following stent implantation. A non-contact surface strain measurement method for the stented artery is presented in this work. ARAMIS stereo optical surface strain measurement system uses two optical high speed cameras to capture the motion of each reference point, and resolve three dimensional strains over the deforming surface8,9. As a mesh stent is deployed into a latex vessel with a random contrasting pattern sprayed or drawn on its outer surface, the surface strain is recorded at every instant of the deformation. The calculated strain distributions can then be used to understand the local lesion response, validate the computational models, and formulate hypotheses for further in vivo study.

Stent-induced arterial strain distributions are characterized using an optical surface strain measurement system. This visualization technique is used to gain insights into the impact of stent implantation on the host vessel.

Bir Gemi Stent Dağıtım sırasında Duvar Mekaniği izlenmesi

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental technique and image analysis protocol presented here can also be applied for imaging microscopic bubbles in other fields of research; therefore, it has a wide range of applications. We apply this to image cavitation around dental ultrasonic scalers. It is important to image cavitation to characterize it and to understand how it can be exploited for various applications. Cavitation occurring around dental ultrasonic scalers can be used as a novel method of dental plaque removal, which would be more effective and cause less damage than current periodontal therapy techniques. We present a method for imaging the cavitation bubble clouds occurring around dental ultrasonic scaler tips using a high-speed camera and a zoom lens. We also calculate the area of cavitation using machine learning image analysis. Open source software is used for image analysis. The image analysis presented is easy to replicate, does not require programming experience, and can be modified easily to suit the application of the user.

Cavitation microbubbles are imaged using a high-speed camera attached to a zoom lens. The experimental setup is explained, and image analysis is used to calculate the area of the cavitation. Image analysis is done using ImageJ.

Yüksek Hızlı Kamera ve Görüntü Analizi Kullanarak Hızlı Hareket Eden Mikrokabarcıkların Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.