연구는 NSF 상을 MCB-1021384에 의해 지원.

1. 무산소 버퍼의 작성 <ol><li> 100 밀리미터 칼륨 인산 버퍼, 산도 7.5의 1 L를 준비합니다. 유나 바있는 500 ML Büchner 플라스크에 버퍼 250 ML 하거라. </li><li> 고무 마개로 플라스크를 밀봉하고 저어 접시에 배치하십시오. Schlenk 라인으로 플라스크의 짧은 튜브를 연결합니다. </li><li> 교반과 상온에서 5 시간 동안 진공 하에서 가스를 제거하다는 버퍼. 이 기간 동안 매시간마다 degassing과 아르곤과 세정 진공의 5 연속 라운드를 수행합니다. </li><li> 10 초 동안 아르곤과 플라스크를 플러시하고 진공 매니폴드에서 연결을 끊습니다. 글러브 박스 안쪽 플라스크를 놓습니다. </li><li> 활발한 교반과 함께 하룻밤 사이에 글러브 박스에서 술병을 열어 둡니다. </li></ol> 2. 중단 - 흐름 시스템에서 산소를 제거 <ol><li> 0.1 M의 아세트산 나트륨, 산도 5.0의 1 L를 준비합니다. 250 ML Büchner 플라스크에이 버퍼 125 ML을 붓고 단계 1.2-1.4를 수행합니다. </li><li> 5 달아서 나누다Aspergillus 니제르 (181,300 U / g)과 0.9 g 포도당 1.5 ML Eppendorf 튜브 50 ML 팔콘 원뿔 튜브를 사용하여 각각의 MG 포도당 산화 효소. 글러브 박스에 모두 컨테이너를 배치합니다. </li><li> 무산소 0.1 M의 아세트산 나트륨, 산도 5.0 (최종 18.13 U / ML의 농도에서 100 밀리미터, 각각) 50 ML에서 포도당 산화 효소와 포도당을 분해. 이 솔루션 (그림 1)과 저수지에 주사기를 채우십시오. </li><li> 드라이브 밸브가 &quot;로드&quot;위치에 있는지 확인하고 드라이브 주사기 (그림 1)을 입력합니다. &quot;드라이브&quot;위치로 F 밸브를 켭니다. 프로 데이터 관리 소프트웨어에서 비우기를 클릭하여 중지 주사기를 비웁니다. 수동으로 해당 드라이브 램을 높이는하여 흐름 회로를 통해 드라이브 주사기 F에서 버퍼를 누르십시오. 이 단계에게 총 10 번 반복합니다. 다른 세 드라이브 주사기와 동일한 절차를 수행합니다. 한 시간 만요. </li><li> 동일한 버퍼 contai와 저수지의 주사기 솔루션을 교체포도당 산화 효소와 포도당을 닝. 단계 2.4 반복합니다. </li><li> 반복은 2.5 단계와 솔루션은 하룻밤 흐름 시스템에 서 수 있습니다. </li><li> 하룻밤 배양 후, 반복, 2.5 단계. </li></ol> 3. 산소 포화 버퍼의 작성 <ol><li> 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (산도 7.5)을 준비하고 저어 막대와 50 ML 유리병에 50 ML을 붓는다. Wheaton의 스토퍼와 Wheaton의 알루미늄 도장 병을를 쏠. </li><li> 빙판에 병을 놓습니다. 솔루션으로 100 % 산소를 포함하는 탱크에 연결된 긴 바늘을 담가. 통풍구와 같은 유리병의 마개를 통해 또 다른 짧은 바늘을 삽입합니다. </li><li> 교반 : 1 시간 동안 100 % 산소로 거품이 솔루션입니다. </li><li> 먼저 유리병에서 짧은 바늘을 제거하고 긴 바늘을 제거하기 전에 10 초 기다립니다. 글러브 박스에서 닫힌 유리병를 놓습니다. </li></ol> 4. NADPH 솔루션의 작성 <ol><li> 1.5 ML Eppendorf 튜브에 NADPH의 1 밀리그램을 무게와 내가 배치글러브 박스에 티. </li><li> 무산소 100 밀리미터 칼륨 인산 버퍼, 산도 7.5 300 μL의 NADPH를 해산. 분광 광도계 (ε 340 nm의 = 6270 M -1 cm -1)와 NADPH 농도를 결정하기 위해 장갑 상자에서이 솔루션의 30 μL를 제거합니다. </li></ol> 5. 효소 솔루션에서 산소의 제거 <ol><li> 글러브 박스에서 냉동고와 해동에서 효소 주식 용액 400 μL를 가져가라. 효소 주식 솔루션은 (360 μm의) 이전에 100 밀리미터 NaCl을 포함하는 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (산도 7.5)에 준비하고, 액체 질소에 냉동되었다. </li><li> 유나 바와 25-ML 유리병에 효소 솔루션을 전송, Wheaton의 스토퍼와 Wheaton의 알루미늄 도장 병을 모자하고 장갑 상자에서 제거합니다. </li><li> 빙판에 유리병을 넣고 유리병의 마개를 통해 바늘을 삽입하여 Schlenk 라인에 연결합니다. </li><li> 가스를 제거하다 5 연속 순찰을 수행하여 효소 용액1 시간 20 분마다 degassing과 아르곤과 세정 진공 청소기. </li><li> 10 초 동안 아르곤과 유리병을 소독하고 진공 매니폴드에서 연결을 끊습니다. 글러브 박스 안의 얼음 병을 놓습니다. </li></ol> 6. Reductive 하프 반응 : 모니터링 플라빈 감소 <ol><li> 정지 - 흐름 악기와 제조 업체의 프로토콜에 따라 단일 혼합 모드의 프로 데이터 컨트롤 소프트웨어를 준비합니다. </li><li> 순환 물 목욕 (15 ° C)를 켭니다. 20 분 동안 그것을 통해 질소를 꿈틀하여 물에서 산소를 제거합니다. 이것은 흐름 회로를 통해 산소 오염을 방지합니다. </li><li> 순환 목욕 정지 흐름의 물 목욕 주택을 연결하여 드라이브 주사기의 온도와 15의 관측 셀 ° C를 유지합니다. </li><li> 프로 데이터 컨트롤 소프트웨어 선택 Photodiode 배열, 외부 트리거 (중지 흐름 작업을 활성화하기 위해), 그리고 Logarit의 제어판 창에서hmic 스케일. </li><li> 프로 데이터 뷰어 소프트웨어를 실행하고 데이터 파일이 저장됩니다 디렉토리를 정의합니다. </li><li> 저수지 주사기 C와 무산소 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (산도 7.5)와 F의 솔루션을 교체합니다. &quot;드라이브&quot;위치로 C와 F 밸브를 켭니다. 프로 데이터 관리 소프트웨어에서 비우기를 클릭하여 중지 주사기를 비웁니다. 수동 (숫양의 각 운동하기 전에 비어 클릭) 총 숫양 다섯 번이나 해당 드라이브를 높여 흐름 회로를 통해 두 드라이브 주사기에서 버퍼를 누르십시오. </li><li> 그 포도당 산화 효소가 흐름 회로에서 완전히 제거되었는지 확인하기 위해서, 총 6.6 네 번 단계를 수행합니다. </li><li> 프로 데이터 제어 소프트웨어에 기준을 클릭합니다. </li><li> 무산소 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (15 μm의의 정지 흐름에서 믹싱 후 최종 농도)의 1100 μL와 효소 주식 용액 100 μL를 섞습니다. </li><li> 저수지 SYR의 솔루션을 교체효소 솔루션 인게 F 조. &quot;드라이브&quot;위치로 F 밸브를 켭니다. 프로 데이터 관리 소프트웨어에서 비우기를 클릭하여 중지 주사기를 비웁니다. 수동으로 해당 드라이브 램을 높이는하여 흐름 회로를 통해 드라이브 주사기 F에서 효소 솔루션을 누르십시오. 총에서이 세 번 수행합니다. 프로 데이터 제어 소프트웨어에서 60 s의 수집 시간을 설정합니다. </li><li> 두 드라이브 주사기가 드라이브 주사기 피스톤과 접촉에 해당 솔루션 및 드라이브 마리 가득 있는지 확인하십시오. &quot;드라이브&quot;위치로 두 밸브를 켜고 드라이브를 수행하기 위해 프로 - 데이터 관리 소프트웨어에서 가져오기를 클릭합니다. 세중의에있는 데이터를 얻기 위해 두 번 이상이 단계를 반복합니다. 효소의 산화 형태의 이러한 수율의 스펙트럼. </li><li> 드라이브에서 얻은 452 nm의 값을 사용하여 (ε 452 nm의 = 13,700 M -1 cm -1)을 혼합하기 전에 효소 농도를 결정하고 NADPH solutio 4 ML 준비N 1.5 배 더 집중. </li><li> NADPH 용액과 6.10에 설명된대로 빈과 리필 중지 주사기 세 번 함께 저수지 주사기 C의 솔루션을 교체합니다. </li><li> 6.11 단계를 반복합니다. 효소의 감소하는 동안 이러한 수율의 스펙트럼. </li></ol> 7. 산화 반 반응 : 모니터링 플라빈 산화 <ol><li> 정지 - 흐름 악기와 제조 업체의 프로토콜에 따라 이중 혼합 모드의 프로 - 데이터 관리 소프트웨어를 준비합니다. </li><li> 단계 6.2-6.5를 반복합니다. </li><li> 무산소 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (산도 7.5)와 네 개의 저수지의 주사기에서 솔루션을 교체합니다. &quot;드라이브&quot;위치로 F 밸브를 켭니다. 프로 - 데이터 관리 소프트웨어에 빈을 클릭하여 중지 주사기 비웁니다. 수동으로 해당 드라이브 램을 늘리면 흐름 회로를 통해 드라이브 주사기 F에서 버퍼를 누르십시오. 각 드라이브 주사기로 총이 단계는 다섯번을 수행합니다. </li><li> 한잔에 7.3 네 번 단계를 수행알 완전히 흐름 회로에서 내용을 제거합니다. </li><li> 프로 데이터 관리 소프트웨어에 기준을 클릭합니다. </li><li> 무산소 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (15 μm의의 정지 흐름에서 믹싱 후 최종 농도) 1000 μL와 효소 주식 용액 200 μL를 섞습니다. </li><li> 효소 솔루션 저수지의 주사기의 솔루션을 교체합니다. &quot;드라이브&quot;위치로 밸브를 돌립니다. 프로 데이터 관리 소프트웨어에서 비우기를 클릭하여 중지 주사기를 비웁니다. 수동으로 해당 드라이브 램을 높이는하여 드라이브 주사기의 흐름이 회로를 통해 효소 솔루션을 누르십시오. 이 단계에게 총 세 번 수행합니다. 프로 데이터 제어 소프트웨어에서 0.5 s의 지연 시간을 60 s의 수집 시간을 설정합니다. </li><li> 모든 드라이브 주사기가 드라이브 주사기 피스톤과 접촉에 해당 솔루션 및 드라이브 마리 채워져 있는지 확인하십시오. &quot;드라이브&quot;위치로 모든 밸브를 켜고 프로 DAT에서 수집을 클릭드라이브를 수행하는 제어 소프트웨어. 세중의에있는 데이터를 얻기 위해이 단계를 두 번 더 반복합니다. 효소의 산화 형태의 이러한 수율의 스펙트럼. </li><li> 주사기 A에서 효소 용액 &quot;드라이브&quot;위치와 빈과 리필 중지 주사기에게 같은 7.7에 설명된 세 차례에 B 밸브를 돌려보다 1.5 배 더 집중 NADPH 솔루션 저수지 주사기 B의 솔루션을 교체합니다. </li><li> 산소 버퍼와 저수지 주사기 C의 솔루션을 교체합니다. &quot;드라이브&quot;위치와 빈과 리필 중지 주사기에게 7.7에 설명된대로 세 차례에 C 밸브를 켭니다. 프로 데이터 제어 소프트웨어에서는 각각 15, 900의에서 지연 및 수집 시간을 설정합니다. </li><li> 7.8 단계를 반복합니다. 완전히 감소 효소의 재산화 동안 이러한 수율의 스펙트럼. </li></ol> 8. 데이터 분석 <ol><li> 프로 데이터 컨버터 소프트웨어를 실행합니다. 옵션 아이콘을 클릭하고 ProDataCSV에 저장을 선택합니다. </li><li> 열기데이터 파일이 저장된 디렉토리. APL 프로 데이터 컨버터 창으로 파일을 끕니다. 데이터는 같은 디렉토리에 CSV 형식의 파일로 자동 저장됩니다. </li><li> 마이크로 소프트 엑셀 (마이크로 소프트, 레드 몬드, 워싱턴, 미국)를 사용하여 CSV 형식으로 파일을 엽니다. 700 nm의에 해당하는 흡수를 빼는 방법으로 정지 - 흐름 추적의 기준을 정상화. </li><li> 적절한 지수 함수에 시간 대 상응 최대의 흡광도의 음모를 맞추하여 KaleidaGraph을 (시너지 소프트웨어, 독해, PA)를 사용하여 수정된 흔적을 분석합니다. 그림 2B, 중지 흐름 악기의 효소와 NADPH를 혼합 후 플라빈 감소의 속도를 결정하기 위해서는 시간의 함수로 꾸몄다되었다 452 nm의 흡광도에서 표시. 이 경우, 데이터의 가장 적합한는 감소, 고해상도의 첫 번째와 두 번째 단계에 대해 계산되었다 이중 지수 방정식과 0.65와 0.23의 -1의 속도를 이용하여 얻은 것입니다pectively. C4a-hydroperoxyflavin 중급와 산소로 감소 효소 반응 후 재산화 형성의 속도를 확인하려면, 우리는 각각 380과 452 nm의, (그림 3B)에서 정지 - 흐름 추적을 분석했다. 단일 지수 방정식을 사용하여, 우리는 각각 하프 반응 산화의 첫 번째와 두 번째 단계 1.4 및 0.006의 -1의 속도를 계산. </li></ol> 9. 대표 결과 이전 섹션에서 설명한 실험의 결과는 F SidA의 reductive 하프 반응은 플라빈의 산화 환원 상태의 변화에 대응하는 452 nm의 흡광도에서의 변화를 측정하여 모니터링할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 단계의 속도는 적절한 방정식 (; 단계 8.4 그림 2)에 데이터를 맞추 의해 결정됩니다. 얻은 감소 속도 (0.65들 -1)로 계산 K 고양이 값과 비슷감소 반응의 속도 결정 단계 -임을 암시 정상 상태 실험 2. 정지 - 흐름의 이중 혼합 모드를 활용, 산화이 반 반응의 중간체의 속도는 (; 단계 8.4 그림 3) 결정하실 수 있습니다. F SidA하여 촉매 반응에서 C4a-hydroperoxyflavin 분명 (380 nm의 λ의 최대) 감지되고, 형성과 부식의 비율을 계산할 수 있습니다. 취득 재산화 (0.006들 -1)의 느린 속도는 C4a-hydroperoxyflavin가 부재에서 ornithine 매우 안정을 나타냅니다. <img alt="계획 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> F SidA의 제도 1. 원리. 유행의 cofactor의 isoallozaxine 고리가 표시됩니다. 산화 플라빈 ()는 NADPH (B)에 바인딩하고 감소 플라빈와 NADP +를 (C) 형성 반응. 의 분자 산소와 결합과 반응 후ornithine, C4a-hydroperoxyflavin는 (D) 형성됩니다. 이것은 hydroxylating 수종입니다. ornithine의 hydroxylation 후 hydroxyflavin (E)는 산화 효소를 형성하여 수분이 있어야합니다. NADP +는 촉매주기 전반에 걸쳐 구속 남아 (F) 출시되는 마지막 제품입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> 그림 1. 정지 - 흐름 악기. ) 응용 Photophysics SX20의 구성 요소의 그림은 정지 - 흐름 분광 광도계를. B 샘플 처리 단위의) 그림. 이중 혼합 모드에서 흐름 회로의 C) 제도. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> 그림 2. 정지 - 흐름 악기의 NADPH와 SidA의 무산소 감소. 30 μm의 SidA 45 μm의 제품 NADPH의 동등 권을 혼합 후 녹음) 스펙트럼 변경됩니다. 첫번째 스펙트럼 (SidA을 산화)와 마지막으로 스펙트럼은 (완전 시드에게 줄어) 청색과 적색, 각각으로 강조하고 있습니다. 시간의 함수로 기록 452 nm의시 B) 흡광도 추적. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> 정지 - 흐름 악기의 SidA의 그림 3. 산화. ) 완전히 감소 SidA와 산소 버퍼의 혼합 동등 권 이후 스펙트럼 변화를 기록했습니다. 최종 농도가 15 μm의 SidA, 22.5 μm의의 NADPH, 그리고 0.95 MM 산소 있었다. 스펙트럼은 0.034, 4.268로 기록하고, 727.494 S는 각각 완전 감소 효소, C4a-hydroperoxyflavin 중급 (380 nm의 최대의 λ) 및 산화 효소 (450 nm의 λ의 최대)에 해당합니다. B) 382과 452 nm의 흡광도에서 추적은 시간의 함수로 기록.

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V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments.">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

산화 환원 반응을 catalyze 효소는 일반적으로 촉매주기 동안 중요한 흡광도 변화를 받아야 hemes 및 flavins 같은 cofactors가 포함되어 있습니다. 플라 빈의 산화 형태 ~ 360과 450 nm의 흡광도에서 맥시멈을 제시하며, 감소는 일반적으로 450 nm의 7시 흡광도 감소에 따라 감시하고 있습니다. 일반적으로 일부 과도 중간체가 존재하지만 정규 spectrophotometers로 측정되어야하는 형태와 부식이 너무 빠르다. 응용 Photophysics SX20 중지 흐름 분광 광도계 (또는 이와 유사한 악기)를 사용하면, 그것은 밀리초 시간 척도에서 흡광도 변화 (죽은 시간, 2 MS) 측정이 가능하다. 여기 모델로 봉사, 플라빈 의존 monooxygenase F SidA의 reductive 및 산화 반 반응을 공부했습니다. 수소 전송 속도는 무산소 조건 하에서 NADPH과 효소를 혼합 후 452 nm의 흡광도에서의 변화를 측정에 의해 결정되었다. 그 후, advantag를 복용전체 감소가 달성되기 전까지 중지 흐름 악기의 이중 혼합 모드 E, 효소가 먼저 나서 할인 효소-NADP + 복잡한는 산소와 혼합되었다, NADPH로 반응했다. 이 절차에 따라 그것은 일시적인 산소 플라 빈의 중간체를 감지하고 형성과 붕괴의 속도를 측정할 수 있습니다. 이러한 중간체의 식별은 촉매의 반응 수종의 특성에 대한 실험 데이터를 제공합니다. F SidA, hydroxylating 수종입니다 C4a-hydroperoxyflavin (일반적으로 370-380 nm의에서 모니터)의 형성의 경우. 또한, 각 단계의 일정한 비율을 측정하는 것은 한 반응의 속도 - 결정 단계에 대한 정보를 얻고 효소의 운동 및 화학적 메커니즘을 명료하게하다하는 데 도움이 있습니다. 일반적으로 유사한 접근 방식은 같은 단백질과 같은 다른 flavoenzymes하거나, 발생한 변경되는 흡광도를 위해 단백질, 사용할 수있는 cont아무것도 헴, 피리 독살 인산, 또는 비 헴 철 8-10. 이 방법의 한계는 정화 효소의 대량이 필요한 것이지만, 이것은 높은 수율로 표현 시스템을 사용하여 극복할 수 있습니다. 하나는 강한 충분한 신호가 관찰 수 있도록 충분한 단백질을 사용하여 녹음 스펙트럼을위한 최적의 단백질 농도를 결정하지만, 너무 많은 그래서 효소가 낭비되지 않습니다. 일반적으로 정지 - 유동 실험에 사용 플라빈 함유 효소의 낮은 효소 농도는 6-10 μm의 (혼합 후)이고 효소의 해당 어금니 흡광 계수를 사용하여 결정됩니다. F SidA의 경우에는 효소 구속 유행의 비율 50~65% 2입니다. 바운드 유행의 cofactor는 촉매 작용에 필요한이므로 APO-단백질은 이러한 실험에서 비활성 상태로 간주됩니다. 이 방법의 또 다른 가능한 제한 효소의 프로세스가 발생할 경우 2보다 더 빠른 MS가 (정지 - 흐름의 죽은 시간) 그들이 관찰되지 않는 일이다오히려이 요금은이 문제를 극복하기 위해 감소 수있는 전략을보고됩니다. 이것에 대한 한 예로 ferredoxin-NADP + 환원 효소 11 반응에 높은 NaCl 농도를 사용하여 포함한다. 정지 - 흐름의 흐름 회로에서 산소 닦고는 종종 본 실험에서 복잡한 단계이며 특별한주의가 필요합니다. 그것이 효과적이고 저렴한 방법이기 때문에 여기에 설명된 포도당 산화 효소 포도당 시스템은 대부분의 실험실에서 성공적으로 사용됩니다. 그러나, H 2 O 2의 생산을 포함하고 어떤 어플 리케이션을 위해 protocatechuate dioxygenase-protocatechuate 시스템과 같은 다른 대안는 12 간주되어야하는 몇 가지 단점이 있습니다. 무산소 글러브 박스의 활용은 쉽게 무산소 조건을 보장하기 위해 만들지만, 필수가 아닙니다. 우리가 효소가 산소의 부재로 감소되고 싶어하거나 농도에서 산소와 반응으로 산소가 정지 흐름의 흐름 회로에서 제거되어야합니다우리가 지정한들. 정지 - 흐름 글러브 박스에 있지만 우리가 이전 실험에서 에어로빅 버퍼를 사용한 경우, 산소 유량 회로에 있습니다. 흡광도 측정뿐만 아니라, 형광 및 원형 dichroism의 assays는 해당 액세서리와 응용 Photophysics SX20 중지 흐름 분광 광도계에서 수행할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 일반 실험실 장비 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 배기기 </td><td> 웨일스 사람 </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner flasks </td><td> 어부 </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> 막대를 저어 </td><td> 어부 </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> 번호판을 저어 </td><td> 어부 </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk 라인 </td><td> Kontes 유리 </td><td> - </td></tr><tr><td> 아르곤 탱크 </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> 질소 탱크 </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> 질소 탱크, 초고 순도 급 </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> 산소 탱크 </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5 % 수소 밸런스 질소 탱크 </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 세인트opped 흐름 분광 광도계 </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> 글러브 박스 </td><td> 수줍어하는 </td><td> - </td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 용품 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ML BD 팔콘 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 ML BD 매가 원뿔 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1.5 ML Eppendorf의 microcentrifuge 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 및 25 ML 유리 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> 고무 stoppers </td><td> 어부 </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> 알루미늄 물개 </td><td> 어부 </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 시약TS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인산 칼륨, 일염기의 </td><td> 어부 </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> 인산 칼륨, 이염 </td><td> 어부 </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> 아세트산 나트륨 </td><td> 시그마 </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> A.에서 포도당 산화 효소 니제르 </td><td> 시그마 </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-글루코스 </td><td> 어부 </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> 어부 </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-Ornithine 하이드로 클로라이드 </td><td> 어부 </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderophore (SidA)는 (예 : ferricrocin 또는 N &#39;, N&#39;, N &#39;&#39; &#39;- triacetylfusarinine C) 1 독성에 필수적인 hydroxamate siderophores의 생합성에서 ornithine의 hydroxylation을 catalyzes 유행 함유 monooxygenase입니다. SidA에 의해 촉매 반응은 reductive 및 산화 반 반응 (제도 1)로 나눌 수 있습니다. 하프 반응 reductive에서 F SidA에 바인딩 산화 유행은, NADPH 2,3에 의해 감소됩니다. 하프 반응 산화에 , 감소 cofactor는 ornithine에 산소 원자를 전송 C4a-hydroperoxyflavin 중간을 형성하는 분자 산소와 반응. 여기, 우리가 속도를 측정하고에 설치되어 중지 흐름 악기를 사용 SidA의 다양한 스펙트럼 형태를 감지하는 절차를 설명 무산소 장갑 상자. 정지 - 흐름 악기에서 reactants 작은 볼륨이 빠른 속도로 혼합이며, 흐름 이후 번째로 정지전자 정류장 주사기 (그림 1), 관찰 전지에 배치 솔루션의 스펙트럼 변화는 시간이 지남에 기록됩니다. 실험의 첫번째 부분에서는, 우리는 NADPH에 의해 F SidA의 플라빈의 혐기성 환원 직접 측정 단일 모드에서 정지 - 흐름 악기를 사용하는 방법을 보여줍니다. 그러면 F SidA 처음 anaerobically 노화 루프의 시간을 지정된 기간 동안 NADPH에 의해 감소되는 이중 믹싱 설정을 사용하고 관찰 세포 (그림 1)에서 분자 산소와 반응. 오직 reductive 반 반응을 모니터링하는 경우, 솔루션의 모든 산소가 줄어든 플라 빈의 cofactor로 반응하고 궁극적으로 산화 플라 빈으로 다시 가옥 것이다 C4a-hydroperoxyflavin 중간을 형성하기 때문에이 실험을 수행하기 위해서는 무산소 버퍼가 필요 . enz의 전체 매상이있을 수도 있기 때문에 이것은 사용자가 정확하게 감소의 속도를 측정하는 것을 허용하지 것입니다yme. 하프 반응 산화가 연구중인 경우 효소가 감소하고 산화 사이 단지 단계가 관찰되고 있도록 산소의 부재로 감소되어야한다. 본 실험에 사용되는 버퍼 중 하나는 산소가 우리가 산소보다 높은 농도에서 하프 반응 산화를 공부할 수 있도록 포화 상태입니다. 이들은 종종 플라빈 함유 monooxygenases로 reductive이나 산화 반 반응 중 하나를 공부하면 수행 절차입니다. 정지 - 흐름으로 수행 미리 정상 상태 실험의 시간 척도는 고유 속도 상수의 결정 및 반응 4 중간체의 탐지 및 식별을 허용 초 밀리초입니다. 여기에 설명된 절차는 다른 플라빈 종속 monooxygenases에 적용할 수 있습니다. 5,6

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Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

우리는 reductive 및 산화 반 반응 모두를 조사하기 위해 중지 흐름 악기의 사용을 설명<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; siderophore (SidA), 플라빈 종속 monooxygenase. 그러면 SidA의 반응의 종류에 해당하는 스펙트럼을 보여 주며 우리는 그들의 형성에 대한 속도 상수를 계산합니다.

중단 - 흐름 분광 광도법을 사용하여 플라빈 종속 Monooxygenase의 Reductive 및 산화 반쪽 반응을 모니터링

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

monitoring-reductive-oxidative-half-reactions-flavin-dependent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K 조회수.  Virginia Polytechnic Institute and State University. 우리는 reductive 및 산화 반 반응 모두를 조사하기 위해 중지 흐름 악기의 사용을 설명 Aspergillus fumigatus siderophore (SidA), 플라빈 종속 monooxygenase. 그러면 SidA의 반응의 종류에 해당하는 스펙트럼을 보여 주며 우리는 그들의 형성에 대한 속도 상수를 계산합니다.

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

연구

생체공학

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the arterial wall lead to tissue injury, which initiates restenosis2-7. This hypothesis needs further investigations including better quantifications of non-uniform strain distribution on the artery following stent implantation. A non-contact surface strain measurement method for the stented artery is presented in this work. ARAMIS stereo optical surface strain measurement system uses two optical high speed cameras to capture the motion of each reference point, and resolve three dimensional strains over the deforming surface8,9. As a mesh stent is deployed into a latex vessel with a random contrasting pattern sprayed or drawn on its outer surface, the surface strain is recorded at every instant of the deformation. The calculated strain distributions can then be used to understand the local lesion response, validate the computational models, and formulate hypotheses for further in vivo study.

Stent-induced arterial strain distributions are characterized using an optical surface strain measurement system. This visualization technique is used to gain insights into the impact of stent implantation on the host vessel.

선박의 스텐 트를 배포하는 동안 벽 역학 모니터링

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

티슈 엔지니어링 혈관 이식 및 이후의 이식을위한 수술 기법<em&gt; 생체</em&gt; 모니터링

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental technique and image analysis protocol presented here can also be applied for imaging microscopic bubbles in other fields of research; therefore, it has a wide range of applications. We apply this to image cavitation around dental ultrasonic scalers. It is important to image cavitation to characterize it and to understand how it can be exploited for various applications. Cavitation occurring around dental ultrasonic scalers can be used as a novel method of dental plaque removal, which would be more effective and cause less damage than current periodontal therapy techniques. We present a method for imaging the cavitation bubble clouds occurring around dental ultrasonic scaler tips using a high-speed camera and a zoom lens. We also calculate the area of cavitation using machine learning image analysis. Open source software is used for image analysis. The image analysis presented is easy to replicate, does not require programming experience, and can be modified easily to suit the application of the user.

Cavitation microbubbles are imaged using a high-speed camera attached to a zoom lens. The experimental setup is explained, and image analysis is used to calculate the area of the cavitation. Image analysis is done using ImageJ.

고속 카메라 및 이미지 분석을 사용하여 빠르게 움직이는 마이크로 버블 영역의 이미징 및 정량화

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.