1. Jel hazırlanması <ol><li> Bir Erlenmeyer balona agaroz uygun kitle dışarı tartılır. Agaroz jel aw / v yüzdesi çözeltisi kullanılarak hazırlanır. Bir agaroz jel konsantrasyonu% -2% 0.5 arasında değişen en jeller ile ayrılması için DNA fragmanlarının boyutlarına bağlıdır. Tampon hacmi şişenin kapasitesinin 1/3 &#39;den daha büyük olamaz. </li><li> Agaroz içeren balona tampon çalışan ekleyin. Karıştırmak için Swirl. Tamponlar çalışan en yaygın jel TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) ve TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA) vardır. </li><li> Agaroz / tampon karışımı eritin. Bu en yaygın olarak mikrodalga fırında ısıtılması ile yapılır, aynı zamanda bir Bunsen ateşte yapılabilir. 30 sn aralıklarla, termos ve girdap içeriği iyice karışana kadar kaldırın. Agaroz tamamen eriyene kadar tekrarlayın. </li><li> 0.5 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyona etidyum bromid (EtBr) eklenir. Alternatif olarak, jöle, aynı zamanda elektro sonra boyanmış edilebilirbir zaman eşit uzunlukta için tampon çalışan destaining ardından 15-30 dakika, 0.5 mg / ml EtBr içeren tampon çalışan phoresis. </li></ol> Not: EtBr şüpheli bir kanserojendir ve düzgün kurumun mevzuatına göre bertaraf edilmelidir. EtBr içeren jeller kullanılırken eldiven her zaman giyilmelidir. DNA boyama Alternatif boyalar mevcuttur, ancak EtBr duyarlılık ve maliyeti nedeniyle en popüler biri olmaya devam etmektedir. <ol start="5"><li> Agaroz bir 65 ° C su banyosunda benchtop veya kuluçka yoluyla soğumasını bekleyin. Aksi jel tepsisi eğrilmesi olacaktır. </li><li> Döküm aygıtı içine jel tepsi yerleştirin. Alternatif olarak, aynı zamanda, bir kalıp oluşturmak için bir jel tepsinin açık kenarları bandı olabilir. Kuyuları oluşturmak için jel kalıp içine uygun bir tarak yerleştirin. </li><li> Jel kalıp içine erimiş agaroz dökün. Agaroz oda sıcaklığında ayarlamak için izin ver. Tarak ve jel kutusuna jel yerleştirin. Alternatif olarak, gEl aynı zamanda plastik sargısıyla ve 4 saklanabilir ° C kullanımı (Şekil 1) kadar. </li></ol> 2. Jel Aparat ve DNA parçaları Ayrılması kurulması <ol><li> (Şekil 2) ayrılması için DNA örnekleri için boya yüklenmesi ekleyin. Jel yükleme boya genellikle 6X konsantrasyonu (% 0.25 bromphenol mavisi,% 0.25 ksilen cyanol,% 30 gliserol) yapılır. Yükleniyor boya için DNA örneği gitti ne kadar izlemenize yardımcı olacak ve aynı zamanda örnek jel gömülmek sağlar. </li><li> Istenilen gerilim Program güç kaynağı (elektrot arasındaki 1-5V/cm). </li><li> Jel yüzeyini kaplayacak kadar çalışan tamponu ekleyin. Bu jel hazırlamak için kullanılan ile aynı çalışan tampon kullanılması önemlidir. </li><li> Güç kaynağına jel kutusunun yol açar takın. Güç kaynağını açın ve jel kutusu ve güç kaynağı çalıştığını doğrulamak. </li><li> Kapağı çıkarın. Yavaş yavaşve dikkatli bir şekilde (Şekil 3) jel içine DNA (ler) yerleştirin. Uygun bir DNA boyutu işaretleyici her deney örnekleri ile birlikte yerleştirilmelidir. </li><li> Jel kutusunun kapağı değiştirin. Katot (siyah kabloları) yakın anot (kırmızı uçları) daha kuyular olmalıdır. Elektrotlar güç kaynağı doğru yuvalara takılı olup olmadığını kontrol edin çift. </li><li> Gücü açın. Boya uygun bir mesafe göç kadar jel çalıştırın. </li></ol> 3. Ayrı DNA parçacıkları gözlemlemek <ol><li> Elektroforez tamamlandığında, güç kaynağını kapatın ve jel kutusunun kapağını kaldırın. </li><li> Jel kutusundan jel çıkarın. Jel yüzeyinden aşırı tampon dökülür. Herhangi bir ekstra çalışan tampon emmek için kağıt havlu üzerine jel tepsisine yerleştirin. </li><li> Jel tepsiden çıkarın ve jel UV ışığa maruz jel. Bu en yaygın bir jel dokümantasyon sistemi (Şekil 4) kullanılarak yapılır. DNA bantları göstermelidirturuncu floresan bantları gibi. Jelin bir resim (Şekil 5) alır. </li><li> Düzgün jel ve kurum düzenlemelerine başına çalışan tampon atın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 5 PCR ürünleri agaroz jel elektroforez sonra, tipik bir sonucu temsil etmektedir. Ayırma işleminden sonra, sonuçta elde edilen DNA fragmanları açıkça tanımlanmış bant olarak görülebilir. DNA standart veya numune merdiven gruplarından boyutları tayin edilmesi için yararlıdır sağlayan bir dereceye kadar ayrılmalıdır. Örnekte gösterildiği, 765 bp, 880 bp ve 1022 bp DNA parçaları 2-log DNA merdiveni ile birlikte% 1.5 agaroz jel üzerinde ayrılır. <img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> Tarak çıkarılmasından sonra Şekil 1. A katılaşmış agaroz jel. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> Şekil 2. Bir öğrenci, onun DNA örnekleri için yükleme boya ekledi. <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> Şekil 3. Jel bir kuyuya DNA örneği yüklenirken bir öğrenci. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> Şekil 4. Bir jel dokümantasyon sistemi bir örnek. <img alt="Şekil 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> Şekil 5. Bir jel elektroforez sonrası bir görüntüsü. EtBr 1 saat için 100 V ayırma takiben 0.5 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyon, elektroforez için daha önce jel ilave edildi. Jel UV ışık ve jel dokümantasyon sistemi ile çekilen resmi maruz kaldı.

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Agaroz jel elektroforezi nükleik asitlerin ayıran etkin ve etkili bir yol olduğu kanıtlanmıştır. Agaroz yüksek jel gücünde büyük DNA parçalarının ayrılması için düşük yüzde jeller kullanılmasını sağlar. Molekül eleme jel matris içinde agaroz 7 demetler tarafından üretilen gözeneklerin büyüklüğü ile belirlenir. Genel olarak, agaroz, küçük gözenek büyüklüğü ve daha yüksek konsantrasyonda. Geleneksel agaroz jeller 100 bp ve 25 kb arasında DNA parçalarının ayrılması en fazla etkilidir. 25 kb daha büyük DNA parçaları ayırmak için, bir iki farklı yönden gelen alternatif akım uygulama içerir darbe alan jel elektroforezi 6, kullanmanız gerekecektir. Bu şekilde, daha büyük ölçekli DNA fragmanları bunlar mevcut yönde değişiklik ile kendilerini reorient hızını ile birbirinden ayrılır. 100 bp daha küçük DNA parçaları daha etkili bir şekilde poliakrilamid jel elektroforez ile birbirinden ayrılır. Aksineagaroz jel, poliakrilamid jel matris bir serbest radikal tahrik kimyasal reaksiyon ile oluşturulur. Bu ince jeller, yüksek konsantrasyon olan dikey çalıştırılır ve daha iyi çözünürlüğe sahiptir. Kapiler elektroforez sıralama Modern DNA kullanılır ise, bu sayede kılcal tüpler bir jel matriks ile doludur. Kılcal tüp kullanımı ve böylece hızlı DNA parçalarının ayrılması (ve DNA dizisinin belirlenmesi) sağlayarak, yüksek voltaj uygulama için olanak sağlar. Agaroz hydroxyethylation yoluyla düşük erime agaroz oluşturmak için değiştirilebilir. Düşük erime agaroz genellikle ayrılmış DNA parçalarının izolasyonu istendiği zaman kullanılır. Hydroxyethylation etkin bir şekilde gözenek büyüklüğüne 8 azaltarak agaroz demetleri ambalaj yoğunluğu, azaltır. Bu, aynı boyda DNA fragmanı olarak, bir standart agaroz jel aksine, bir düşük erime agaroz jel üzerinde hareket etmek için daha uzun zaman alacaktır anlamına gelir. Demetleri birbirleriyle ilişkilendirmek içinayarlayın sonra kovalent olmayan etkileşimler ile 9, yeniden erir bir agaroz jel mümkündür. EtBr agaroz jel 10 DNA leke için kullanılan en yaygın reaktif. UV ışığa maruz kaldığında, etidyum molekülün aromatik halkanın elektron aktive edilir, hangi zemin durumuna elektronların dönüş olarak enerji (ışık) salınımına yol açar. EtBr, konsantrasyon bağımlı bir tarzda DNA molekülü başına araya ilave olarak çalışmaktadır. Bu yoğunluğu göre, herhangi bir DNA bandında DNA miktarı tahminine sağlar. Çünkü olumlu ücret, EtBr kullanımı% 15 oranında DNA göç hızı azaltır. EtBr bir şüphelinin mutajen ve kanserojen olduğu, bu nedenle içeren agaroz jel işlerken bir özen gerekir. Ayrıca, EtBr bir tehlikeli atık olarak kabul edilir ve uygun şekilde bertaraf edilmelidir. Agaroz jel DNA Alternatif lekeleri SYBR Altın, SYBR yeşil, Kristal Mor ve Metil Mavi içerir. Bunlardan,Metil Blue ve kristal viyole jelden DNA fragmanının geri kazanım isteniyorsa böylece mutasyon olasılığı azaltarak, DNA gruplarından görüntülenmesi için UV ışığı jel maruz gerekmez. Bununla birlikte, kendi duyarlılıkları EtBr göre daha düşüktür. SYBR altın ve SYBR yeşil EtBr daha düşük toksisite ile hem çok hassas, uv bağımlı boyalar, ancak çok daha pahalıdır. Dahası, bütün alternatif boyaların olamaz biri ya da jel doğrudan ilave edildiği zaman iyi iş değildir, bu nedenle jel elektroforezi sonra mesaj lekeli olması gerekmektedir. Çünkü maliyet, kullanım kolaylığı ve hassasiyeti, EtBr hala birçok araştırmacı için tercih edilen boya kalır. Ancak, bu tür tehlikeli atık bertaraf zor veya genç öğrenciler olduğu gibi bazı durumlarda, bir deney performans, daha az toksik bir boya tercih edilebilir. Jel elektroforez kullanılan yükleme boyalar üç ana amaca hizmet eder. Önce örnek yoğunluğu ekleyinBu jel içine batırmak olanak tanır. İkincisi, boyaların renk sağlamak ve yükleme işlemini basitleştirmek. Son olarak, boyalar DNA parçacıkları göç etmiş olduğu mesafe tahmini için izin jel ile standart tarife üzerinden hareket ettirin. Ayrılan DNA parçalarının kesin boyutlar her bandın tarafından katedilen mesafe karşı bir DNA standart farklı bantlar için moleküler ağırlığa sahip log çizerek belirlenir. DNA standardı bilinmeyen DNA örnekleri karşı mukayese edilebilir önceden belirlenmiş boyutlardaki DNA parçalarının bir karışımını içeriyor. DNA&#39;nın farklı formları farklı oranlarda jel üzerinde hareket dikkat etmek önemlidir. Supercoiled plazmid DNA, çünkü kompakt konformasyon, yavaş hareket açık dairesel bir formu ile aynı boyutta doğrusal bir DNA parçası, ardından hızlı jeli içinden geçmektedir. Sonuç olarak, DNA ayrılması için 1970&#39;lerde agaroz jeller kabulünden bu yana, varbiyolojik bilimler araştırma en kullanışlı ve çok yönlü tekniklerinden biri olduğu kanıtlanmıştır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Agaroz I </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> Asit borik </td><td> Sigma </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Bromofenol mavi </td><td> Sigma </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> Etidyum bromür </td><td> Sigma </td><td> E7637 </td><td> Tehlikeli atık olarak bertaraf edilmesi için kanserojen-ihtiyacı </td></tr><tr><td> Asetik sirke asidi </td><td> Balıkçı </td><td> BP2401-212 </td><td> Aşındırıcı </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Balıkçı </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylene cyanol FF </td><td> Sigma </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> Tris baz </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Araştırmacı / YP jel dokümantasyon sistemi </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baykuş Easycast B1 Mini jel elektroforez sistemi </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301 güç kaynağı </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

Agaroz jel elektroforezi 100 bp den 25 kb 1 arasında değişen boyutlarda DNA parçaları ayıran en etkili yoludur. Agaroz deniz yosunu cins Gelidium ve Gracilaria izole edilen ve tekrarlanan agarobiose (L-ve D-galaktoz) alt birimlerinin 2 oluşur. Jelleşme sırasında, agaroz polimerler non-kovalent ilişkilendirmek ve gözenek boyutları bir jel moleküler eleme özelliklerini belirlemek demetleri bir ağ oluştururlar. Agaroz jel elektroforezi kullanımı DNA ayrılması devrim. Agaroz jel onaylanmasından önce, DNA öncelikle sadece boyut bir yaklaşım sağlanır sükroz yoğunluk gradient santrifüj kullanılarak ayrıldı. Agaroz jel elektroforez ile DNA ayırmak için, DNA jel ve uygulanan akım önceden dökme kuyulara yüklenir. DNA (RNA) molekülün fosfat omurgası olumsuz bir elektrik alanı yerleştirildiği zaman, bu nedenle, şarj edilmiş, DNA fragmanları p göçedecektirositively anot ücret. DNA üniform bir kütle / yük oranına sahip olduğu için, DNA molekülleri, yapılan yol moleküler ağırlığının 3 log ile ters orantılı olduğu gibi bir kalıp içinde bir agaroz jeli içinde boyutu ile birbirinden ayrılır. Bir agaroz jeli ile DNA hareketi için öncü modelinin ön kenarı ileriye doğru hareket eder ve 4 boyunca molekülün geri kalan çeker sayede, &quot;reptation yanlı&quot; edilir. ; 2) agaroz konsantrasyonu; 3) DNA yapısı 5; 4) etidyum bromid, 6 arasında uygulanan gerilim, 5) bulunması) türü DNA molekülü 1) boyutu: bir jel yoluyla bir DNA molekülü göç oranı aşağıdaki tarafından belirlenir agaroz ve 7) elektroforez tamponu. Ayırma işleminden sonra, DNA molekülleri uygun bir boya ile boyama sonra UV ışığı altında görüntülendi olabilir. Bu protokolü takip ederek, öğrenciler olmalıdır: <ol><li> DNA fragmanları bir jel matriks içerisinde ayrılmış olan tarafından mekanizmasının anlaşılması </li><li> Konformasyon nasıl anlayınDNA molekülü bir jel matris yoluyla hareketlilik belirleyecek </li><li> Kendi ihtiyaçları için uygun konsantrasyonda bir agaroz çözümü belirlemek </li><li> DNA örneklerinin elektroforezi için bir agaroz jel hazırlayın </li><li> Jel elektroforez cihazı ve güç kaynağı kurma </li><li> DNA parçalarının ayrılması için uygun bir gerilim seçmek </li><li> Etidyum bromür DNA bantlarının görüntülenmesi için izin mekanizmasını anlamak </li><li> Ayrılmış DNA parçalarının boyutlarını belirlemek </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments at JoVE.com

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agaroz jel elektroforez ile DNA parçalarının ayrılması için temel bir protokol tarif edilmektedir.

DNA kırıntıları Ayrılma Agaroz Jel Elektroforezi

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

agarose-gel-electrophoresis-for-the-separation-of-dna-fragments

Research

JoVE Journal

Biology

763.5K Görüntüleme.  University of California Los Angeles. Agaroz jel elektroforez ile DNA parçalarının ayrılması için temel bir protokol tarif edilmektedir.

Video: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and others. However, the traditional SGE protocol is quite tedious, and the experiment takes a long time. Moreover, the chemical consumption in SGE experiments is very high. This work proposes a simple method for the separation of DNA fragments based on an SGE chip. The chip is made by an engraving machine. Two plastic sheets are used for the excitation and emission wavelengths of the optical signal. The fluorescence signal of the DNA bands is collected by smartphone. To validate this method, 50, 100, and 1,000 bp DNA ladders were separated. The results demonstrate that a DNA ladder smaller than 5,000 bp can be resolved within 12 min and with high resolution when using this method, indicating that it is an ideal substitute for the traditional SGE method.

Traditional slab gel electrophoresis (SGE) experiments require a complicated apparatus and high chemical consumption. This work presents a protocol that describes a low-cost method to separate DNA fragments within a short timeframe.

Akıllı Telefon ile DNA Parçalarının Ayırılmasının Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Biyokimya

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Biyomühendislik

DNA Gel Electrophoresis

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of agarose, and within the gel, charge particles will migrate and separate based on size. The negatively charged phosphates of the DNA backbone cause DNA fragments to move toward the anode - a positively charged electrode.
The video explains the mechanism by which DNA fragments are resolved on an agarose gel, and it provides a step-by-step generalized procedure for how to prepare agarose gels, load DNA samples, run a DNA gel, visualize DNA fragments, and properly dispose of the gel and running buffer after the experiment is concluded.

DNA Gel Electrophoresis: Concept, Procedure, and Applications

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

Education

JoVE Science Education

Temel Biyoloji

Hücresel ve Moleküler Biyolojide Temel Yöntemler

Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

Separating Protein with SDS-PAGE: Procedure and Applications

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

Gel Purification

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, washing and eluting from a silica column. DNA is believed to bind to silica in the presence of high salt via a salt bridge. Following binding, DNA is washed of impurities and eluted under low salt conditions disrupting this interaction.
This video goes through a step-by-step, generalized procedure for cutting out a band from the gel, gel solubilization, purification through binding to a silica column, and elution of purified DNA. In addition, the presentation discusses several tips for ensuring successful gel purification, including the importance of running an agarose gel with a marker or ladder that has DNA of known sizes.

Gel Purification: Recovery of DNA Fragments after Electrophoretic Separation

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

Microfluidic Capillary Electrophoresis for Fragment Sizing of PCR Products: A Microchip-Based Electrophoretic Separation Technique to Separate DNA Fragments Based on Size

Source: Wang, H., Zhu et al. <a href="https://www.jove.com/v/59963">A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the microfluidic capillary electrophoresis technique to separate PCR amplicons based on their size. This technique helps in fragment sizing using fluorescent dyes and standard molecular size markers.

PCR Ürünlerinin Parça Boyutlandırması için Mikroakışkan Kılcal Elektroforez: DNA Parçalarını Boyuta Göre Ayırmak için Mikroçip Tabanlı Bir Elektroforetik Ayırma Tekniği

Source: Wang, H., Zhu et al. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

Elektroforez Teknikleri

DNA Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify DNA fragments using a gel extraction protocol.
Gel extraction follows five major steps: running gel electrophoresis to separate fragments, isolating the individual bands, extracting DNA from those bands, and removing the dye and salts from the extracted mixture to obtain pure DNA.
In cloning experiments, both the insert and vector DNA fragments are obtained after digestion with restriction endonucleases. These DNA fragments of varying sizes are mixed with contaminants, such as enzymes, salts, etc., that can inhibit the ligation reaction that follows. Gel extraction is therefore used to obtain pure DNA fragments before ligation.
To set up a gel for extraction, a lower percent (0.7-0.8%) agarose solution is used to ensure efficient migration of the DNA bands. In addition, a wide-combed gel cast is used to obtain thick DNA bands that are easy to isolate. Then, gel electrophoresis is performed at a lower voltage to prevent heating of the gel and damage to the DNA.
Once gel electrophoresis is complete, the ethidium bromide-stained DNA is identified by exposing the gel to long-wavelength UV for a short time. Short exposure to UV radiation prevents damage to DNA. This is followed by cutting out the desired band using a clean razor blade.
The isolated gel slice containing the DNA fragment of interest is then processed through one of the commercially available gel extraction kits. All of these kits follow the same basic principle. First, the agarose gel is dissolved by a buffer solution containing salts, such as sodium iodide. Next, DNA is bound to a column containing an anionic resin and washed a few times with a dilute alcoholic solution to remove impurities. The column is then dried by spinning in a centrifuge. The pure DNA can now be eluted with buffer or deionized water.

Agarose Gel Electrophoresis for Separation of DNA Fragments

DNA Agaroz Jel Elektroforezi

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify ...

JoVE Core

Moleküler Biyoloji

Unit 2

DNA ve RNA Çalışmaları

KEY TERMS AND CONCEPTS

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

To begin this procedure, add 250 microliters of a previously prepared protein sample solution to each slot of a 13-centimeter IPG strip holder. Place an 18-centimeter IPG strip, gel-side down, onto each protein sample solution, taking care to avoid bubbles. Then, add 3 to 4 milliliters of mineral oil to cover each IPG strip.
Next, assemble each IPG strip holder into an isoelectric focusing system, with the pointed end on the back plate, and the square end on the front plate. After rehydrating the IPG strips for 18 hours at room temperature, set the IEF parameters on the isoelectric focusing system with a total runtime of 7.5 hours and 36,875 volt hours.
After IEF, take out each IPG strip from the isoelectric focusing system, and remove the excess mineral oil with an insoluble paper towel. Then, wrap each strip in a sheet of plastic wrap, and store at -80 degrees Celsius.
To cast a 12% PAGE gel, add double-distilled water, 1.5 molar Tris-hydrochloric buffer, 40% acrylamide/bisacrylamide stock solution, 10% ammonium persulfate, and TEMED to a beaker. Mix the gel solution gently, taking care to avoid bubbles.
Gently pour the gel solution into a multi-casting chamber, up to the expected gel height of 19 centimeters. Immediately, add about 3 milliliters of double-distilled water to the multi-casting chamber to cover each resolving gel, and allow each gel to polymerize for about one hour.
This step is very important to prepare a high-quality SDS-PAGE gel. An equal volume water must be immediately added on the top of each gel.
Prepare two liters of electrophoresis buffer, then, add the buffer to an electrophoresis separation unit buffer tank.
After removing the focused IPG strips from the freezer, place them in a plastic vessel containing 1 milliliter of reducing equilibrium buffer and a trace of bromophenol blue, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking. After removing the reducing equilibrium buffer, add 4 milliliters of alkylation equilibrium buffer, and a trace of bromophenol blue to the IPG strips, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking.
During gel equilibrium, disassemble the multi-casting chamber, and remove the prepared resolving gel cassette. Rinse the gel cassette three times with double-distilled water, then, remove excess water from the gel cassette with an insoluble paper towel, and place it in a gel stander.
Following this, rinse the equilibrated IPG strips with electrophoresis buffer, and remove excess liquid on each IPG strip surface with an insoluble paper towel. Place an IPG strip onto the resolving SDS-PAGE gel, allowing the IPG strip&#39;s plastic side to contact the longer glass plate, with the pointed end to the left.
Now, quickly add 3 to 4 milliliters of hot 1% agarose and SDS electrophoresis buffer, to seal the IPG strip on the top of each SDS-PAGE gel, and place the top side of the IPG strip down on the top of the shorter glass plate, taking care to avoid bubbles.
These steps are very important to seal the IPG strip to an SDS-PAGE gel. The hot agarose solutions must be immediately added, and the IPG strip must be immediately placed into the top of the SDS gel.
After polymerization, insert the assembled gel cassette vertically between the plastic gaskets and a vertical electrophoresis system. Place the top of the gel with the IPG strip next to the cathode. Next, adjust the level of electrophoresis buffer to immerse the gel cassette by adding the appropriate volume of buffer to the electrophoresis system.
Connect and set the power supply in constant voltage mode, and run at 200 volts for about 370 minutes while monitoring the dye. After the run is complete, take the gel cassette out of the electrophoresis system and gently remove the gel from the gel cassette, taking care to avoid tearing the gel.

İki Boyutlu Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Yük ve Moleküler Ağırlığa Dayalı Kompleks Protein Karışımındaki Proteinlerin Analizi İçin Bir Ayırma Tekniği

EoE Sub Articles

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

Prepare two separating gels as described in the text manuscript. Pour the gel between the glass plates using a 1-milliliter pipette, ensuring that the upper 2 centimeters are free of the mixture. Add 70% ethanol on top of the separating gel, creating an even interface between the two layers.
Once the separating gels have polymerized, prepare the stacking gels using instructions in the text manuscript. Then, remove the ethanol from the separating gels, and add the stacking gel solution. Carefully insert a comb with the desired number of pockets, without introducing air bubbles, and allow the gel to polymerize for 20 to 30 minutes.
Load 4 microliters of each sample, as well as the protein ladder, into separate wells. Then, run the gel in Tris-Glycine running buffer at 144 volts for 45 minutes at room temperature. Use pre-warmed Fairbanks solution A to stain the gels on a rocker for 30 minutes, and pre-warmed Fairbanks solution D to decolor the gels on a rocker until the desired background is achieved.

Protein Analizi için Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Moleküler Ağırlığa Göre Proteinleri Ayırmak ve Görselleştirmek İçin Bir Teknik