Bu iş için fon Üniversitesi San Diego Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursları, NIH hibe sağlanan R01-HG007836 ve bilim, ICT ve gelecek planlama Korece Bakanlığı tarafından yapıldı.
Birkaç rakamları önceki sürümleri ilk "Hoople, G. ö ve ark basıldı Jel-seq: Bütün-genom ve yarı geçirgen hidrojel engelleri kullanarak eşzamanlı düşük-girdili DNA ve RNA Kütüphane hazırlık tarafından transcriptome sıralama. Laboratuar bir çip 17, 2619-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " Laboratuar bir yonga üzerinde rakamlar bu yayındaki yeniden yaptırıma.

<ol>
	<li>Mawy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing.">Single-cell sequencing.</a> Nat Methods. 11 (1), 18 (2014).</li><li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells.">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nat Biotech. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA-Seq+reveals+non-genetic+gene+expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA-Seq reveals non-genetic gene expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14 (4), 31 (2013).</li><li>Ramsk&#246;ld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells.">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li><li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science.">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li><li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Hoople, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-seq:+whole-genome+and+transcriptome+sequencing+by+simultaneous+low-input+DNA+and+RNA+library+preparation+using+semi-permeable+hydrogel+barriers.">Gel-seq: whole-genome and transcriptome sequencing by simultaneous low-input DNA and RNA library preparation using semi-permeable hydrogel barriers.</a> Lab Chip. 17, 2619-2630 (2017).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nat Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Dey, S. S., Kester, L., Spanjaard, B., Bienko, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genome+and+transcriptome+sequencing+of+the+same+cell.">Integrated genome and transcriptome sequencing of the same cell.</a> Nat Biotechnol. 33 (3), 285-289 (2015).</li><li>Gopal, A., Zhou, Z. H., Knobler, C. M., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+large+RNA+molecules+in+solution.">Visualizing large RNA molecules in solution.</a> RNA. 18 (2), 284-299 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-PAGE+Gel.">SDS-PAGE Gel.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 087908 (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Qubit 3.0 Fluorometer Manual. MAN0010866. Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd</a> (2017)</li><li>Vitak, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+thousands+of+single-cell+genomes+with+combinatorial+indexing.">Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing.</a> Nat Methods. 14 (3), 302-308 (2017).</li><li>Illumina. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nextera &#174; XT DNA Library Preparation Kit. , (2017).</li><li>Takara Bio USA Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing User Manual. , (2016).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nat Protoc. 2 (3), 739-752 (2007).</li></ol>

Eş-kurucusu ve bilimsel Danışmanı Singlera genomik Inc KZ olduğunu

Jel-seq aygıt uydurma gibi protokol kendisi ile ilişkili çeşitli kritik adımlar vardır. İmalat sırasında jel çeşitli bölgeleri için öngörülen katman kalınlıkları ile başlayan öneririz. Önemli zaman farklı imalat seçenekleri test geçirdim ve en iyi cihazlar malzemeler tablo ve Kimyasallarılistelenen kaset için burada açıklanan protokol üretir. Araştırmacılar bir alternatif kaset sistemi kullanıyorsanız, onlar cihazlar oluştururken kullanılan birimleri tweak için gerek...

Yeni nesil (NGS) sıralama genetik araştırma yaptı yolda derin bir etkiye sahip oldu. Araştırmacılar bir kez tüm türlerin genom sıralama üzerinde duruldu nerede, şimdi tek bir tümör veya bir deneyde bile tek bir hücre genomu sıralamak mümkündür. 1 NGS, aynı zamanda maliyet etkin hücre, transcriptome bilinen veriler topluluğu içindeki bulundu RNA transkript sıralamak için sağlamıştır. Yükseltmek ve DNA veya RNA küçük başlangıç örnekleri sıra yeteneği sadece son beş yıl içinde elde edilmiştir. 2 , 3 , 4 ne yazık ki, standart protokolleri uyumsuzdur ve araştırmacılar DNA veya RNA belirli bir örnek için sıralamak seçmeniz gerekir. Başlangıç bir örnek yeterince büyük olduğunda, ikiye bölünebilir. Daha küçük ölçeklerde ancak, malzeme örnekleri bölme nedeniyle kaybı Kütüphane kalitesini etkileyebilir ve örnekleri havuzu hücreler arasında ilginç varyasyonlar dışarı ortalama olabilir. 5 Ayrıca, araştırmacılar, tek hücre veya küçük heterojen tümör biyopsi gibi bölünemez örnekleri inceleyerek giderek ilgilendi. 6
Bu sorunu çözmek için üç Protokolü son zamanlarda aynı başlangıç örneğinden DNA ve RNA sıralamak için geliştirilmiştir: jel-seq7, G & T-seq8ve DR-seq9. Bu makale aynı anda gelen önemsiz eklenen maliyet 100 hücreler olarak az DNA ve RNA kitaplıkları oluşturmak için kullanılan jel-seq için detaylı bir protokolü sunar. Roman jel-seq DNA ve RNA sadece düşük maliyetli hidrojel matrisleri kullanarak boyutuna göre ayırmak için yetenek yönüdür. RNA fiziksel ayrılması DNA'ın jel-Seq protokolünün çekirdek yeniliktir. Bu ayrılık electrophoretically bu moleküller arasındaki boyut farkları yararlanmak polyacrylamide membranlar kullanarak elde edilir. Bu boyut farkları bağlamda koymak için nasıl DNA ve RNA görüntüsü göz önünde bulundurun: DNA mikron ölçekte var ve geleneksel mikroskoplar kullanılarak görüntülenebilir, RNA nanometre ölçeğinde var ve cryo-elektron gibi karmaşık teknikleri kullanarak yansıma gerekir mikroskobu. 10
DNA ve RNA bu protokol için ayırmak için yaklaşım şekil 1' de gösterilen. Sol panelde çözüm bir membran yakın yüzen DNA ve RNA ücretsiz gösterir. Elektrik alan, sağ panelde gösterildiği gibi uygulandığında, DNA ve RNA membran aracılığıyla geçiş indükler bir elektroforetik güç deneyim. Membran özelliklerini ayarlama tarafından biz DNA RNA--dan ayıran yarı geçirgen bir zar oluşturduk. DNA molekülleri membran karşı itti ama kenarındaki büyük boyutlarından dolayı dolaşmış oldu. Küçük RNA molekülleri, öte yandan, yeniden yapılandırabilir ve membran yollarını örgü. Reptation bilinen bu işlem bir yılan çim hamle yol benzer. Sonunda bu RNA molekülleri daha küçük polimerler için çok zor bir ikinci, yüksek yoğunlukta membran tarafından durdurulur (> 200 baz çifti) aracılığıyla sıyrılmak için. Bir kez fiziksel olarak ayrılmış, DNA ve RNA getirilebilir kurtarıldı ve genom ve transcriptome hakkında bilgi oluşturmak için işlenmiş. DNA ve RNA ayırabilirsiniz, biz RNA cDNA ayırma önce transkripsiyonu ters ise daha iyi sonuçlar elde edilen bulduk. CDNA/RNA melez RNA yalnız daha stabildir ve hala düşük yoğunluklu membran geçebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> Resim 1 . Jel-seq çalışma prensibi. Fiziksel olarak DNA ve RNA ayırmak için kullanılan temel prensip. Uygulamalı elektrik alan, küçük RNA molekülleri düşük yoğunluklu membran geçiş ama büyük DNA molekülleri yüzeyde sıkışıp kalırlar. Bu rakam Ref. 7 Kimya Royal Society izniyle yeniden. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bu kağıt jel-seq cihazın her iki fabrikasyon ayrıntılı olarak açıklar ve DNA ve RNA kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü eşleştirilmiş. Her ikisi de genel bir bakış Şekil 2' de gösterilmiştir. Cihazın katmanlama üç farklı yoğunluk polyacrylamide jeller üst üste çift yığın jelleri oluşturmaya benzer bir işlemde tarafından imal edilmiştir. 11 biyolojik Protokolü PBS içinde askıya 100-1000 hücreleri ile başlar. Hücreleri lysed ve cihazın genomik DNA cDNA/RNA melez ayırmak için kullanılmadan önce RNA cDNA dönüştürülür. Ayrılık ve kurtarma, genomik ve transcriptomic sonra kitaplıkları standart bütün-genom kitaplığı hazırlık seti Protokolü yakından takip eden bir işlem kullanılarak hazırlanır. Geliştirme ve jel-seq doğrulama hakkında daha fazla ayrıntı üzerinde bir çip yayın laboratuarında okumak "jel-seq: Bütün-genom ve yarı geçirgen hidrojel engelleri kullanarak eşzamanlı düşük-girdili DNA ve RNA Kütüphane hazırlık tarafından transcriptome sıralama ." 7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> Resim 2 . Jel-seq protokolü. Sonrasında tamamlanması jel-seq aygıt ve iletişim kuralı oluşturulan eşleştirilmiş DNA ve RNA kitaplıklarına imal etmek. Bu rakam bölümlerini Ref. 7 Kimya Royal Society izniyle çoğaltılamaz. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
DNA ve RNA kitaplıkları tek hücreler üretmek için araştırmacılar G & T-seq ya da DR-devamı G & T-Seq, jel-seq gibi kullanmayı dikkate almanız gerekir, genomik DNA RNA'ın fiziksel bir renk kullanır. Bu yaklaşım mesajcı RNA üzerinde'nın (mRNA) dayanır 3'poliadenile kuyruk aşağı açılır hedef olarak. MRNA üzerinde bir manyetik boncuk biotinylated oligo-dT astar kullanarak yakalanır. MRNA yakalandıktan sonra boncuklar bir mıknatıs ile yerde tutulur ve genomik DNA içeren süpernatant kaldırıldı ve olması için başka bir tüp transfer. Bu fiziksel ayırma tamamlandıktan sonra mRNA ve DNA ayrı kütüphaneleri oluşturulabilir. 8 çalışan bu yaklaşım de ilgi RNA poliadenile ise, ancak bu poliadenile transkript, ribozomal RNA, tRNA veya RNA prokaryot üzerinden gibi çalışmak için kullanılamaz.
DR-seq DNA ve RNA türetilmiş cDNA aynı tüp nerede güçlendirilmiş bir öncesi amplifikasyon adım kullanır. Örnek sonra ikiye bölünmüş ve DNA ve RNA seq kütüphaneleri hazırlanmak için paralel olarak işlenebilir. Genomik DNA ve RNA türetilmiş cDNA arasındaki farkı anlamak, DR-seq Hesaplamalı bir yaklaşım. Bu DNA veya RNA kökenli gibi dizileri ekzonlar sadece mevcut nerede hesaplama açısından genomik DNA veri görüntülenmez. 9 cDNA/RNA ve DNA fiziksel olarak jel-seq ve G & T-seq. tamamlandý olarak ayrılması değil ki bu yaklaşımın bir avantajı olduğunu Dezavantaj, ancak, DR-seq genom ve transcriptome (Yani, ekzonlar intron karşı) bir temanın bilgi gerektirir ve çekirdekleri içinde birçok transkript henüz tam değildir, sıralama gibi uygulamalar için ideal olmayabilir olduğunu spliced ve hala intron içeriyor. 12
Roman jel-seq DNA ve RNA hücre sadece boyutuna göre yüzlerce ayırmak için yetenek yönüdür. Bu yöntem hiç bir priori bilgi genom veya transcriptome, eksik Uçbirleştirme karşı sağlamdır ve poli-adenylated transkript için sınırlı değildir gerektirir. Bir araştırmacı en az 100 hücrelerle başlayabileceğiniz uygulamalarda, jel-seq ucuz ve yaygın olarak kullanılan malzemeler kullanılarak basit bir yaklaşım sağlar.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Reagents&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide Monomer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads</td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Referred to in the text as 6X loading dye</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits</td><td>Kapa BioSystems</td><td>7959613001</td><td>Referred to in the text as 2X qPCR mix</td></tr><tr><td>N,N&amp;prime;-Methylenebis(acrylamide)&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072-100G</td><td>Also known as bis-acrylamide</td></tr><tr><td>NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)</td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Millipore</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)</td><td>Takara/Clontech</td><td>634888</td><td>Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3&amp;rsquo; SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)</td></tr><tr><td>Random hexamer with WTA adapter&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>5&amp;prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>DNA AWAY Surface Decontaminant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7010PK&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Referred to in the text as DNA removal product</td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4415-1L</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Referred to in the text as gel stain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Equipment&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&amp;nbsp;syringe needles, gauge 18</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192554</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Branson CPX series ultrasonic bath</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769363</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2010</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Mesh Filter Plate - Corning&amp;nbsp;HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 &amp;micro;m pore size</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3374</td><td>Referred to in the text as 8 um mesh filter plate</td></tr><tr><td>PowerPac HC Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Vacufuge Concentrator</td><td>Eppendorf</td><td>22822993</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell system</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195&amp;nbsp;</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>UVC500-115V</td><td>Discontinued, any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Gel Doc XR+ Gel Documentation System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>Referred to in the text as gel imager</td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR89</td><td>Referred to in the text as UV transilluminator</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ultrasonic&amp;nbsp;Bath</td><td>Bransonic</td><td>1207K35</td><td>Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.</td></tr></tbody></table>

gel-seq: a method for simultaneous sequencing library preparation of dna and rna using hydrogel matrices

Yükseltmek ve DNA veya RNA küçük başlangıç örnekleri sıra yeteneği sadece son beş yıl içinde elde edilmiştir. Ne yazık ki, genomik oluşturmadan veya transcriptomic kütüphaneler için standart protokolleri uyumsuzdur ve araştırmacılar DNA veya RNA belirli bir örnek için sıralamak seçmeniz gerekir. Jel-seq aynı anda DNA ve RNA bir basit hidrojel aygıtı kullanarak 100-1000 hücrelerle başlangıç için kitaplıklarına hazırlamak araştırmacılar sağlayarak bu sorunu çözer. Bu kağıt eşleştirilmiş kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü yanı sıra cihazın imalatı için detaylı bir yaklaşım sunar. Biz jel-seq araştırmacılar tarafından kolayca uygulanabilecek tasarlanmıştır; birçok genetik labs zaten jel-seq cihaz imalat çoğaltmak gerekli donanımları var. Bizim iletişim kuralı her iki bütün-transkript amplifikasyon (WTA) için yaygın olarak kullanılan kitleri istihdam ve de zaten araştırmacılar için tanıdık olması olasıdır Kütüphane hazırlık kitaplıkları genomik üreten ve transcriptomic usta. Bizim yaklaşım araştırmacılar DNA ve RNA sıralama gücünü ihmal edilebilir maliyet ve yarma olmadan tek bir örnek üzerinde ayı getirmek için sağlar.

GDNA ve cDNA/RNA melez jel-seq cihazda fiziksel ayrılması ile floresan jel görüntüleme görüntülenmeyecektir; temsil edici bir sonuç şekil 3' te gösterilmiştir. Paneli A fabrikasyon jel-seq aygıt gösterir; yanlış renk farklı jel bölgeleri ayırmak için eklendi. Panel B dört farklı renk ayrımlarını doğrulamak için kullanılan yakın gösterir. Üçüncü lane, bir negatif kontrol, arka plan temsil eder ve hiçbir autoflourescence arabi...

Watch this Scientific Journal Video about Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices at JoVE.com

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Jel-seq kitaplıkları için her iki DNA - ve RNA-seq basit hidrojel aygıtı kullanarak 100-1000 hücreden başlayarak ihmal edilebilir ek maliyetle aynı anda hazırlamak araştırmacılar sağlar. Bu kağıt eşleştirilmiş kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü yanı sıra cihazın imalatı için detaylı bir yaklaşım sunar.

Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K Görüntüleme.  University of San Diego. Jel-seq kitaplıkları için her iki DNA - ve RNA-seq basit hidrojel aygıtı kullanarak 100-1000 hücreden başlayarak ihmal edilebilir ek maliyetle aynı anda hazırlamak araştırmacılar sağlar. Bu kağıt eşleştirilmiş kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü yanı sıra cihazın imalatı için detaylı bir yaklaşım sunar.

Video: Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Çevre

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Genetik

AQRNA-seq Kullanarak tRNA Dinamiklerini Analiz Etme

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

Yazar Spotlight: Küçük RNA'ların Haritalanmasında ve Protein Translasyon Mekanizmalarının Çözülmesinde AQRNA-seq Rolü

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Biyokimya

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Biyomühendislik

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Bütün genomik DNA analizi için olağanüstü uzun okunur sıralama

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Damlacık Tabanlı RNA Sıralamaile Yüksek EldeLi Maya Zorlanma Fenotilik

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Bütün genomik DNA analizi için olağanüstü uzun okunur sıralama

Damlacık Tabanlı RNA Sıralamaile Yüksek EldeLi Maya Zorlanma Fenotilik

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu