NCNPR-USDA-ARS Bilimsel sözleşmesi No 58-6408-2-0009; US Army Medical araştırma ve Materyal Komutanlığı tarafından CDMRP hibe Ödül # W81XWH-09-2-0093.

1. THP1 Hücre Kültürü koruyun ve Altkültür <ol><li> Bir% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de RPMI-1640 ortamı içinde THP1 hücreleri (% 10 FBS ve pH 7.4 ile) uygun olmalıdır. </li><li> Altkültür hücreleri 1x10 6 hücre / ml aşmasını hücre sayımı önlemek için haftada iki kez. Bu onların dönüşüm yeteneğini korumak için önemlidir. </li></ol> 2. Korumak ve Altkültür Leishmania donovani promastigotlar Kültür <ol><li> L. koruyun RPMI-1640 yılında donovani promastigotlar (S1, Sudan suşu) 26% 10 FBS ile orta (Sodyum Bikarbonat ve Sodyum Piruvat olmadan) ° C </li><li> Altkültür L. donovani 20-25x10 6 promastigotlar / ml.Caution aralığında en yüksek konsantrasyon hücreleri ile, haftada iki kez promastigotlar: Bütün ortam ve çözümler kullanımdan önce oda sıcaklığına getirilmesi gerekmektedir. </li></ol> 3. A 9 tohumlama ve THP1 hücrelerinin farklılaşma6-Mikroplaka ve 16 odası Cam Kültür Slayt. <ol><li> % 10 ısı inaktive FBS ile RPMI-1640 yılında dört günlük bir hücre kültürü 2.5x10 5 hücre / ml (hücre sayısı 10 6 hücre / ml &#39;yi geçmemelidir) ve hücre sayımı ile seyreltilmiş THP1 kültür hazırlayın. Her bir 16-kuyu oda slaydı için her bir 96 kuyulu plaka ve kültür 4 ml kültür 20 ml hazırlandı. </li><li> Forbol 12-miristat seyreltilmiş hücre kültürü süspansiyon 13-asetat (PMA) (THP1 ayrımında) (50 mikrogram / DMSO ml stok 10 μl/20 ml kültür) (seyreltilmiş hücreler kültürde nihai PMA konsantrasyon olmalıdır ekle 25 ng / ml). </li><li> Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay karşılaştırmak için, açık, düz dipli, 96-plaka ve 16 odası, cam, mikroskopik kültürü slayt eşzamanlı deneyleri kurmak. </li><li> Her iyi veya odasına THP1-PMA-tedavili hücrelerde 200 ul dağıtın. </li><li> 96-p inkübehücrelerin hemen hemen tam bir türev sağlamak için% 5&#39;lik CO2 kuluçka makinesi, bir gece boyunca 37 ° C de ilişkilidir ve 16-iyi oda slaytlar. </li></ol> Not: Normalde süspansiyon büyümeye THP1 hücreler, yapışık makrofajlar ayrılır. 4. Leishmania donovani promastigotlar ile dönüştürülmüş THP1 hücrelerinin enfeksiyon <ol><li> Leishmania donovani promastigotlar ile farklılaşmış THP1 hücre kültürü enfeksiyon için, parazitlerin çoğunluğu infektif metacyclic aşaması (uzun silindirik formlar, ~ 5-6 gün eski kültür) olmalıdır. </li><li> Parazit oranı 1:10 THP1 hücre Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Promastigote-Kurtarma-Dönüşüm-Testi hem de enfeksiyon için en uygunudur. </li><li> L. seyreltilmiş bir kültür hazırlayın dan: donovani 2.5x10 6 parazit / ml bir parazit sayısı (parazit oranı = 1:10 THP1 hücreleri) ile promastigotlar% 2 FBS ile RPMI-1640 ortamı içinde bir 5-6 günlük bir kültür. </li><li> Adım 3.5 (THP1 hücre kültürü gece boyunca farklılaşma sonra), ve levhalar oda slaytlar çıkarmak orta kaldırmak ve serum içermeyen RPMI-1640 ortamı ile bir defa hücre kültürleri yıkayın. </li><li> Dikkatli bir şekilde yıkamadan sonra PMA ile tedavi edilen serum içermeyen, sıcak, RPMI-1640 (~ 37 ° C) orta, L. seyreltilmiş 200 ul kültür ile serum içermeyen aracı madde ile yerine THP1 hücreleri donovani promastigotlar (2.5x10 6 parazitler / ml) aşamasında 4,3. Her plaka ve 16-kuyu odası slaytlar THP1 hücreleri olmadan THP1 parazit olmaksızın hücreleri ve parazitlerin kontrol kuyuları ayarlayın. </li><li> THP1 hücre kültürüne parazit ilave edildikten sonra, 37 plaka ve slaytlar inkübe ° C,% 5 parazitler THP1 farklılaşmış hücreleri enfekte izin verecek şekilde 24 saat boyunca CO2. </li></ol> 5. Testi Uyuşturucu / Bileşikleri ile Enfekte makrofajlar Tedavisi <ol><li> TestAmfoterisin B, pentamidin ve tarama için standart anti-leishmanial ilaç olarak Miltefosine. Su ya da DMSO gibi reaktif tabloda belirtilen içinde ilaç / Test bileşiklerinin stok solüsyonları hazırlanır. 6 konsantrasyonlarda her ilaç bileşik sınayın. </li><li> Seri olarak% 2 FBS ile RPMI-1640 ortamı ile yeni bir 96-kuyucuklu levha ya da 2 ml&#39;lik tüp (oda slaytlar için) olarak (1:5) standart ilaç ve test bileşiklerinin seyreltik. Bu plaka ilaçlar / test bileşiği konsantrasyonları nihai konsantrasyonlar 2X vardır. </li><li> L. ile enfekte kültür plakları ve oda slaytlar yıkayınız donovani promastigotlar (adım 4.5 &#39;dan itibaren) serumsuz, RPMI-1640 ortamı ile en az 5 kez. Her kuyu / odasına 100 ul kültür ortamı (% 2 FBS ile RPMI-1640) ekleyin. Birden yıkama olmayan içselleştirilmiş promastigotlar tümüyle kaldırılmasını sağlamak için gereklidir. </li><li> Her iyi veya odasına seri-seyreltilmiş standart anti-leishmanial ilaçlar veya test bileşikleri 100 ul orta ekleyin. Enfeksiyonu ayarlamated THP1 hücreler her plaka / kamara slayt eşzamanlı ilaçlar olmadan denetler. </li><li> 37 plakaları ve oda slaytlar inkübe ° C, 48 saat boyunca% 5 CO2. </li></ol> 6. Odası Slayt Boyama, Floresan Mikroskop Görüntüleme ve Görüntü Analiz Enfeksiyon miktarının ve İlaç Tedavi Etkisi <ol><li> 48 saat inkübasyondan sonra, serum içermeyen RPMI-1640 ortamı ile oda kayar 3 kez yıka. Slaytlardan plastik odaları soyun ve 30 saniye süreyle metanol slaytlar daldırarak hücreleri düzeltmek. Kurutma için hava akımı altında biyo-kukuleta slaytlar bırakın. </li><li> (1:2,000) stok (10.000 X) su ile seyrelterek bir SYBR Green I boyama çözüm (5X) hazırlayın. </li><li> I, oda sıcaklığında 15 dakika için çözelti leke seyreltilmiş SYBR Yeşil ile karanlık koşulları altında slaytlar Leke, su ile bir kez yıkama ve kurutma için hava akış altında slaytlar bırakın. </li><li> Stai üzerinde tam bir cam lamel yerleştirinmontaj orta yardımıyla ned slayt. </li><li> THP1 hücrelerin dijital görüntüler yakalayın: enfeksiyon (boş) olmadan, enfeksiyonu olan (kontrol), enfekte hücreleri eşliğinde Nikon Eclipse 90i floresan mikroskop kullanılarak dilüsyondan farklı standart ilaçlar veya test bileşikleri (Şekil 3, 5 ve 6)) ile tedavi NIS eleman AR 3.2 yazılımı tarafından. </li><li> Makrofaj çekirdekleri (büyük) ve parazit çekirdekleri (kinetoplast küçük), Ulusal Sağlık Enstitüleri (geliştirilen bir yayım-mevcut, Java tabanlı görüntü işleme programıdır ImageJ (Şekil 7), kullanarak Kont <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb. info.nih.gov / ij / download</a> ). Başına 100 amastigotes sayısını THP1 hücreleri gibi dönüştürülmüş veri ifade eder. </li></ol> 7. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay: L. Kontrollü lizis donovani Amastigotes ile enfekte makrofajlar<ol><li> Adımdan 96 çukurlu bir mikrolevhadaki yıkanır 5.5 üç serum içermeyen RPMI-1640 kültür ortamı ile kez. </li><li> Farklı konsantrasyonlarda, 30 için% 0.05 SDS tedavi test ayrı deterjanlar arasında sn kontrollü lizis (kurtarıldı parazit &#39;canlılığı minimum kayıpla maksimum hücre lizis) için en uygunudur. </li><li> Son yıkamadan sonra her kuyudan serum içermeyen aracı madde çıkarın ve her bir kuyucuğa RPMI-1640 20 ul (% 0.05 SDS) ekleyin. 30 sn için çalkalanır ve plaka her bir kuyucuğa (% 10 FBS) ile RPMI-1640 180 ul komple ekleyin. </li><li> Promastigotlar kurtularak amastigotes dönüşüm için 48 saat için 26 ° C sıcaklıkta inkübe plakaları. </li></ol> 8. Dönüştürülmüş Promastigote Kantitatif Analiz (alamarBlue assay) <ol><li> 26, bir 48 saat inkübasyondan sonra ° C, bütün canlı kurtarılmış amastigotes promastigotlar (Şekil 1B) dönüştürülür. 96-p her oyuğuna alamarBlue 10 ul eklelates. </li><li> 26 ° C&#39;da gece boyunca plaka inkübe edin. </li><li> Gecede inkübasyondan sonra, 544 nm eksitasyon, 590nm emisyon bir Fluostar Galaxy fluorimeter (BMG Lab Technologies) standart floresan plakaları okuyun. </li><li> ExcelFit (Şekil 7-9) ile işlem IC bu eğriler 50 / IC 90 değerleri (Tablo 1) ile doz tepki eğrileri (ilaç ya da test bileşiğinin konsantrasyon yüzde büyüme vs) hazırlayın. </li></ol> 9. Parazitler Oranı THP1 Hücrelerinin Standardizasyon <ol><li> Testin duyarlılığı belirlemek için parazit oranı THP1 hücreleri standartlaştırın. Not: Düşük / parazitler numaraları / yüksek enfeksiyon duyarlılığı ve tarama seçicilik ile tehlikeye atabilir. </li><li> Protokol kullanılması dışında fark (bölüm 3 ve 4) THP1 hücreleri tohumlama ve Leishmania promastigote enfeksiyon için yukarıda tarif izleyerek parazit oranı THP1 hücreleri standardize1:1.25, 1:2.5, 1:5 ve 1:10 gibi parazitler THP1 hücrelerin erent oranları. </li><li> 16 kamaralı slayt (görüntü analizi için) ve 96-plaka (parazit-kurtarma tahlil için) parazit kurtarma ve görüntü analizi testleri karşılaştırmak formatlarda hem deney hazırla. </li></ol> 10. Kontrollü hücre lizis için ayrı deterjanlar Standardizasyon <ol><li> Bu deneyin temel amacı anlamlı kurtarıldı amastigote parazitlerin canlılığı etkilemeden tamamlandı / maksimum THP1 hücreleri lizis ulaşmak için THP1 hücrelerin kontrollü lizis protokolü optimize etmektir. </li><li> Farklı konsantrasyonları ile muamele farklı süreler (Şekil 2) bu tür Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 ve SDS gibi değişik deterjanlar test edin. </li><li> Parazit oranı THP1 hücreleri 1:10 &#39;dur ve diğer koşullar, yukarıda bölüm 1-8 kadar benzerdir. </li><li> Farklı tedavi süresi için% 0.05 SDS tedavi daha test edins daha kontrollü hücre lizis optimize etmek. </li></ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, 22-26 (2010).</li><li>Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+scenario+of+drug+development+for+leishmaniasis.">Current scenario of drug development for leishmaniasis.</a> Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).</li><li>Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Resistance+in+Leishmaniasis.">Drug Resistance in Leishmaniasis.</a> Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).</li><li>Mikus, J., Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+colorimetric+method+to+screen+drug+cytotoxicity+against+Leishmania+using+the+dye+AlamarBlue.">A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue.</a> Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).</li><li>Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Axenic+Amastigote+System+for+Drug+Screening.">An Axenic Amastigote System for Drug Screening.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).</li><li>Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+anti-leishmanial+drugs+against+Leishmania+donovani+is+host+cell+dependent.">In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent.</a> J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).</li><li>Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antileishmanial+activity+and+immune+modulatory+effects+of+tannins+and+related+compounds+on+Leishmania+parasitized+RAW+264.7+cells.">Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells.</a> Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).</li><li>Maia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+five+different+types+of+macrophages+by+Leishmania+infantum.">Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum.</a> Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).</li><li>Neal, R. A., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+for+determining+the+activity+of+compounds+against+the+intracellular+amastigote+form+of+Leishmania+donovani.">An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani.</a> J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).</li><li>Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+staining+procedures+for+the+flow+cytometric+analysis+of+U-937+cells+infected+with+different+Leishmania-species.">Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species.</a> J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).</li><li>Giorgio, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Detection+of+Leishmania+Parasites+in+Human+Monocyte-Derived+Macrophages:+Application+to+Antileishmanial-Drug+Testing.">Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).</li><li>Mandal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+of+Leishmania+donovani+clinical+isolates+against+drug+using+a+colorimetric+&#946;+Lactamase+assay.">High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric &#946; Lactamase assay.</a> Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).</li><li>Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+assay+for+Leishmania+amazonensis+promastigotes+expressing+multimeric+green+fluorescent+protein.">Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein.</a> Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).</li><li>Buckner, F. S., Wilson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+screening+compounds+against+Leishmania+Amastigote+Grown+in+macrophages.">Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages.</a> Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).</li><li>Sereno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+Leishmania+cell+based+drug-screening+procedures.">Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures.</a> Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).</li><li>Gupta, S., Nishi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visceral+leishmaniasis:+experimental+models+for+drug+discovery.">Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery.</a> Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).</li><li>Roy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episomal+and+stable+expression+of+the+luciferase+reporter+gene+for+quantifying+Leishmania+spp.+Infections+in+macrophages+and+in+animal+models.">Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Makrofaj-amastigote modellere dayalı anti-leishmanial ilaç tarama için kullanılabilecek birkaç yöntem vardır. Tahliller ana hayvanlardan yani peritoneal eksuda hücreleri (PEC), periferik kan monosit hücrelerinde (PBMC) toplanan makrofajlar ile yapılabilir 6 ya da kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM) veya fare gibi monositik hücre hatları (J774 ve RAW264.7 ) 7 ve insan (THP1, U937, HL-60) 8 monositik hücreleri. Konak hücreler bölünerek kullanmak testleri, parazit ve konak hücre sayısı hem de ilaç aktivitesi karıştırıcı etkisi dikkate alınmasının sağlanması gerekmektedir. Bu tür fareler ve sıçanlar gibi çeşitli kaynaklardan toplanan farklılaşmış birincil makrofajlar doğada olmayan bölünmesi, ancak bu hücre hazırlıkları homojen hücre popülasyonlarının olmayabilir. Monositik hücre-kaynaklı hücre hatları doğal olarak homojen olan ve makrofaj-amastigote bazlı tarama için iyi bir modeldir. Farklı monositik hücre hatları dışında, sorumluluk yönünrentiated THP1 hücrelerinin (insan akut monositik lösemi hücre hattı) olmayan bir bölme monolayer oluştururlar ve primer izole makrofajlara cazip bir alternatif sunabilir. Makrofaj-amastigote tabanlı tarama çeşitli şekillerde yapılabilir. 9 sayma doğrudan hücre ve parazit dayalı klasik mikroskopik değerlendirme emek yoğundur. Otomasyon yokluğu Bu testin yararlılığı sınırlar. Hücrelerinin sayımı zaman alıcı ve bir boyama işlemi ile parazit hayatiyetinin saptanması bu yana IC 50 değerleri arasında yanlış tayin verebilir zordur. Birçok flüoresan boyalar ve monoklonal antikorlar akış sitometrik deneyleri 10, 11 için hesaplanan olabilir, bu testler aynı zamanda bağlı olarak tek bir gün için ilaç muamele zaman aralığının daha az hassaslık ve sınırlama ile sınırlıdır. Hücre içi amastigotes 12,13,14 büyümesi miktarının belirlenmesi için çeşitli haberci gen deneyleri bulunmaktadır. Bir otomated tarama muhabiri genleri kullanarak mümkün olabilir, ancak bu ölçümlerin de bazı dezavantajları var. Öncelikle, bu ölçümlerin çoğunluğu ilaç tarama deney için ideal olmayabilir muhabiri genlerin episomal ifadesi, bakımı için ilaç seçimi gerektirir. Muhabir gen tanıtıldı hangi yolu da parazitin fizyolojik özelliklerini etkiler ve tarama üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Raportör gen bir episomal plazmid parçası ise, raportör nispi çıkış yerine ilaç 14 aktivitesine göre transfekte edilen plasmidin kopya sayısı (hücreden hücreye göre değişir) bağlı olabilir. Bununla birlikte, ya da genomik mimari bozarak veya sadece dış raportör proteinlerin 15 varlığı ile biyolojik etkileri olabilir; parazitler raportör gen sağlamak için seçici basınç gerekmez dönüştürülür Bazı raportör parazitleri. Bir raportör gen temelli analizlerde, oradaduyarlılık ve zemin aktivitesi 16 sorunlar. En önemlisi, muhabir gen ifadesi deneyleri, GFP muhabiri gene15 ile özel bir, çok canlı ve ölü hücre içi amastigotes ayırd edemeyebilirler. Lusiferaz muhabiri gen esas Tahliller canlı ve ölü hücre içi amastigotes arasındaki ayırt edebilir, ancak bu testler için substrat ve hücre lizis tamponu büyük ölçekli tarama 17 için pahalıdır. Bu dezavantajları ve makrofaj-amastigote tabanlı önceki tarama testlerinin sınırlamaları aşmak için, bu parazit-kurtarma ve dönüşüm testi geliştirilmiş ve optimize ettik. Bu testte iyi bir homojenlik olması ve konak hücreleri gibi, doğal olmayan bölme vardır THP1 hücreleri, esas alınmaktadır. Burada anlatılan Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay testi intrasellüler amastigotes Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma dayalı test karşılaştırılabilir. Floresan ve DIC mikroskop, dijital imagMakrofaj çekirdekler ve parazit çekirdeklerin sayma diferansiyel için ImageJ tarafından e analizleri, mikroskobik sayım testi rafine var. Floresan ışığı filtreler ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) filtreler altındaki görüntüleri yakalama intrasellüler parazit daha doğru sayma için dijital görüntü kalitesi iyileştirilmiştir. Floresan ve DIC Hem görüntü net makrofaj hücre hatları ve floresan intrasellüler çekirdekleri ile dijital görüntüler elde etmek için birleştirilebilir. Makrofaj çekirdekler ve parazit çekirdekleri ayirt ImageJ ile tanınabilir. Bu nedenle, Sayısal-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay hem otomasyon ve büyük ölçekli tarama uygulaması için potansiyel var. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Analizinde kritik adımlar şunlardır: (a) Leishmania promastigotlar maruz kaldıktan sonra THP1 hücre kültürlerinde tekrarlanan yıkamalar, olmayan stajyer neredeyse tümüyle kaldırılmasını sağlamak içinalized promastigotlar ve SDS ile enfekte THP1 hücreleri (b) kontrollü bir parçalama. Adımları Hem de otomasyon ile kontrol edilebilir ve testin throughput ile ödün vermemelidir. Varsa test ilaç / bileşiklere Leishmania enfekte THP1 hücrelerinin maruz kaldıktan sonra yıkamanın ikinci adım, kalan olmayan içselleştirilmiş parazitleri kaldırır. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay mevcut mikroskobik, muhabir gen ve görüntü analizi testleri üzerinde önemli avantajlar sunuyor. Testi, Basit, sağlam ve tekrarlanabilir olması büyük ölçekli tarama için otomatik olabilir ve bu nedenle yeni anti-leishmanial ilaç keşfi için büyük bileşiklerin kitaplıkları taramasında önemli uygulama olmalıdır. Bundan başka, aynı zamanda in vitro tahlil Leishmania laboratuar izolatlarına, hem de klinik enfektivite değerlendirmek için kullanılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P1585 </td><td> THP1 hücrelerin farklılaşması için gereklidir. </td></tr><tr><td> RPMI-1640 ortamı </td><td> Invitrogen </td><td> 23400021 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-TeK Odası Sürme Sistemi (16 Daire) </td><td> Thermo Scientific Nunc </td><td> 178599 </td><td></td></tr><tr><td> Berrak, Düz Tabanlı, 96-Well Tabaklar </td><td> BD Falcon </td><td> 353075 </td><td> Plakalar 96-kuyucuklu plak deneyi gerçekleştirmek </td></tr><tr><td> Amfoterisin B </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> A4888 </td><td> Standart anti-leishmanial ilaç (2 mg / ml) DMSO içinde çözülür </td></tr><tr><td> Pentamidin izotionat Salt </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P 0547 </td><td> Standart anti-leishmanial ilaç (2 mg / ml) DMSO içinde çözülür </td></tr><tr><td> Miltefosine </td><td> EMD Biosciences ABD </td><td> 475841 </td><td> Standart anti-leishmanial ilaç serum içermeyen RPMI-1640 ortamı (taze hazırlamak) (2 mg / ml) içinde çözülür </td></tr><tr><td> Sodyum stiboglukonat </td><td> EMD Biosciences ABD </td><td> 567565 </td><td> Standart anti-leishmanial ilacın% 4 FBS ile RPMI-1640 hazırlamak. (1 mg / ml) </td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> L 5750 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan Mikroskop </td><td> NIKON </td><td> ECLIPSE 90i </td><td></td></tr><tr><td> Floresans Mikroplaka Okuyucu </td><td> BMG </td><td> Polar Star Galaxy </td><td></td></tr><tr><td> Orta Montaj </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> M 1289 </td><td></td></tr><tr><td> BirlamarBlue </td><td> Abd Serotec </td><td> BUF012 B </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> S 9430 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Fisher Sci. </td><td> 523500 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P2256 </td><td></td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S11050H </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P6474 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> NP-40 </td><td> Calbiochem </td&gt; <td> 492016 </td><td></td></tr></tbody></table>

a parasite rescue and transformation assay for antileishmanial screening against intracellular leishmania donovani amastigotes in thp1 human acute monocytic leukemia cell line

Leishmaniasis çoğunlukla özellikle gelişmekte olan ülkelerde, yoksulların en yoksulları etkileyen, dünyanın en ihmal edilen hastalıklardan biridir. 350 milyondan fazla insan leishmaniasis yakalanma riski olarak kabul edilir ve yaklaşık 2 milyon yeni vaka yılda 1 meydana gelir. Leishmania donovani Visseral leishmaniasis (VL), hastalığın en ölümcül formu etkeni. Leishmaniasis tedavisinde kullanılan ilaçların tercih 2 sınırlıdır; mevcut tedavilerin sınırlı etkinlik sağlar ve tedavi edici dozlarda pek çok zehirlidir. Buna ek olarak, ilk basamak tedavi ilaçların çoğu zaten çoklu ilaç direnci 3 artan nedeniyle programı kaybetti. Anti-leishmanial ilaçların mevcut boru hattı da ciddi tükenmiş. Sürekli çabaları yeni bir anti-leishmanial ilaç keşfi boru hattı zenginleştirmek için gerekli, ve bu çaba in vitro tarama modellerinde uygun mevcudiyetine bağlıdır vardır. in vitro promastigotlar 4 ve axenic amastigotes deneyleri 5 öncelikle Ancak, hücre içi amastigotes ile karşılaştırıldığında, önemli hücre, fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler farklılıklar için uygun olmayabilir anti-leishmanial ilaç taraması için kullanılır. Makrofaj-amastigotes modelleri ile Tahliller leishmaniasis patofizyolojik durumlarda en yakın olarak kabul edilir ve bu nedenle in vitro tarama için en uygun vardır. Ayrılmış, non-bölme insan akut monositik lösemi hücreleri (THP1) izole birincil makrofaj alternatif olarak (bir çekici hale) ve hücre içi amastigotes karşı farklı bileşiklerin anti-leishmanial etkinliğinin test edilmesi için kullanılabilir. Burada, biz saf bileşiklerin taranması ve eşya doğal için Leishmania donovani ile in vitro enfekte farklılaşmış THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm tahlil sunmakucts özü ve hücre içi Leishmania amastigotes karşı etkinliğinin belirlenmesi. Dışı bölme makrofajlar, THP1 hücreleri (1) farklılaşma, L. ile makrofajların (2) enfeksiyonu: tahlil aşağıdaki adımları içerir donovani metacyclic promastigotlar, test ilaç, enfekte makrofajlar (4) kontrollü parçalanması, (5) serbest / amastigotes kurtarma ve promastigotlar canlı amastigotes (6) dönüşümü ile enfekte hücrelerin (3) tedavi. Tahlil promastigotlar dönüşümü yeteneklerini üzerinde minimal etkisi ile canlı intraselüler amastigotes neredeyse komple kurtarma ulaşmak için Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin kontrollü lizis deterjan tedavisi kullanılarak optimize edildi. Farklı makrofaj: promastigotlar oranları maksimum enfeksiyon elde etmek için test edildi. Enfeksiyon Kantitasyonu canlı dönüşümü yoluyla yapıldı, kurtarılan Leishmania bir alam kendi büyüme promastigotlar ve değerlendirilmesinde amastigotes96-mikroplatelerde arBlue florometrik tahlil. Bu testte, şu anda kullanılmakta mikroskobik, transgenik muhabir gen ve dijital görüntü analizi testleri ile karşılaştırılabilir. Bu testte sağlam ve sadece canlı ve ölü amastigotes ayırd edemeyebilirler muhabiri gen ve görüntü analizi testleri ile karşılaştırıldığında canlı intrasellüler amastigotes ölçer. Ayrıca, tahlil anti-leishmanial ilaç mevcut panel ile doğrulandı ve başarılı bir şekilde büyük ölçekli saf bileşiklerin tarama ve doğal ürün türevleri (Tekwani ve ark. Yayınlanmamış) bir kütüphane ile tatbik edilmiştir.

Bir kantitatif analiz 24, 48, 72 ve 96 saat sonrası ilaç tedavisi için Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Testi hem yapıldı L. doğrudan sayma yöntemi, enfeksiyon donovani-enfekte makrofajlar (THP1 hücreleri), aşağıdaki denklem ile hesaplandı: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1.jpg" /> Amastigotes (amastigotes çekirdeğinin sayma ile belirlenir) / 100 THP1 hücreleri (THP1 hücre çekirdekleri altında sayıldı sayma ile belirlenir) (Şekil 7) ile enfekte olan THP1 hücrelerinin yüzdesi farklı standart veya test bileşiklerinin etkisi incelemek için, daha doğru bir ölçüsüdür transforme bu sayı, doğrudan bileşiklerin genel bir etki ile ilgili olduğu için, bazı önceki kağıtlar de bildirildiği gibi, ya da bir azalma sayesindemakrofaj cells.Infection gelen makrofaj hücreleri veya parazit toplam kaldırma parazitler çeşitli zaman aralıklarında (Şekil 10 ve Tablo 1) için farklı dilüsyonlarda farklı standart ilaçlarla tedavi enfekte THP1 hücrelerin dijital görüntüleri hesaplandı. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Testi için ise bağıl floresans birimleri (RFU) idi okuması ise okuma-out Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Testi için amastigotes infection/100, THP1 hücreleri dönüştürüldü doğrudan infekte makrofajların kurtarıldı canlı Leishmania amastigotes sayısıyla orantılıdır ve promastigotlar dönüşür. AlamarBlue tahlil rutin Leishmania promastigotlar anti-leishmanial ilaç taraması için kullanılır. Testi başlangıçta standart ve Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin kontrollü lizis için optimize oldu. Amaç için deterjan tre koşulları optimize etmek için yapıldıKurtarılan amastigotes canlılığı üzerine minimal etki THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis verim, olgunun,. Şekil 1 tam tahlil protokolü bir mikroskopik görünümü gösteriyor. Leishmania amastigotes ile enfekte olan bozulmamış THP1 hücrelerinde Şekil 1A &#39;da görülebilir. Şekil 1B deterjan tedaviden sonra THP1 hücrelerinin lizisi gösterir. Şekil 1C kısmen promastigotlar ve Şekil 1B dönüştürülmüştür Leishmania amastigotes, kurtarılan göstermektedir içine amastigotes hemen hemen tam bir dönüşüm göstermektedir promastigotlar ve sonraki yayılması. Bu dönüştürülmüş promastigotlar büyüme kantitatif alamarBlue eklenmesi ve bir mikroplak okuyucu üzerinde floresans ölçümleri ile izlenebilir. NP-40 (Şekil 2A) ve Triton X-100 (Şekil 2B) ile muamele enfekte THP1 hücreleri lize, fakat aynı zamanda canlılığı etkilemiş veKurtarılan amastigotes dönüşümü. Tween 20 (Şekil 2C) ve Tween 80 (Şekil 2D) ile muamele transforme promastigotlar düşük sayılar ile gösterildiği gibi amastigotes tamamlanmamış bir kurtarma içine çıkan, THP1 hücrelerinin lizisi en uygun yol açmamıştır. 30 sn için% 0.05 SDS (Şekil 2E) ile tedavi Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis vermiştir ve kurtarılan amastigotes canlılığı ve dönüşüm etkilemedi. Diğer optimizasyon sn canlı Leishmania amastigotes (Şekil 2F) en yüksek kurtarma vermiştir 20-30 için% 0.05 SDS ile hücrelerin tedavisinin gösterdi. Sonraki deneylerde, 30% 0.05 SDS ile muamele san kullanılmıştır. SDS tedavisi için prosedür, tek ya da çoklu plakalar için de aynıdır. Birden plaklarda SDS tedavi kanallı pipet ile sütun sütun uygulanmıştır. Serum içermeyen aracı madde tüm 8 levhanın bir sütun kuyuları ve 20 ve mu çıkarıldı,% 0.05 SDS l, sütun 8 kuyu içinde ilave edildi ve% 10 FCS içeren RPMI-1640 ile 30 saniye sonra seyreltildi. Testin ilk standardizasyon sırasında, plaka olmayan içsel promastigotlar için mikroskop altında kontrol edildi. Beş yıkamanın bir asgari standart bileşikler ve üç yıkamalar SDS tedavi adım 7&#39;den önce gerekli olduğu ile enfekte makrofaj hücrelerinin tedavisinde 5 adımda önce parazitlerin giderilmesi için gerekli idi. Bu yüzden, hücreler, 8 kez yıkanmış ve herhangi bir görünür olmayan içsel promastigotlar enfekte THP1 hücrelerinin lizisi kontrol önce kaldı. Sayısal Görüntü Analizi ve Doğrudan Sayma Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin dijital görüntüleri (Şekil 3 SYBR Green I ile boyanma özelliği kinetoplast DNA ile makrofaj çekirdekler ve intraselüler Leishmania çekirdekleri Hem floresan filtreleri altında gözlendi sonra Nikon Eclipse 90i floresan mikroskop yakalandı). Ayrıca, enfekte THP1 hücrelerin görüntüleri de DIC altında ele geçirildi. Görüntüler hem birleşti edildiğinde, intrasellüler amastigotes ile THP1 hücrelerin anahatları (Şekil 4) daha net görüldü. ImageJ yazılımı bu görüntüleri analiz etmek için kullanılmıştır. ImageJ Sağlık (National Institutes of geliştirilen bir kamu alanı, Java tabanlı, görüntü işleme programıdır <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</a> ). ImageJ Java eklentileri ve kaydedilebilir makroları aracılığıyla genişletilebilirlik sağlayan bir açık mimarisi ile dizayn edilmiştir. Özel toplama, analiz ve işleme eklentileri ImageJ built-in editörü ve bir Java derleyicisi kullanılarak geliştirilebilir. ImageJ tarafından THP1 hücrelerin çekirdeklerinde ve parazit çekirdeklerin sayma diferansiyel için, görüntü ImageJ açıldı. Hücre sayacı Yazılımı eklenti Çözümle seçenek bulundu. Görüntü başlatıldı ve hücre sayacı tip 1 THP1 c için seçildiell çekirdek ve hücre sayacı tip 2 parazitin çekirdeği (Şekil 3) için seçildi. Diferansiyel sayma en az 200 THP1 hücre çekirdeğine ve bu THP1 hücre çekirdeğinde mevcut hücre içi amastigotes için yapıldı. Parazit-kurtarma tahlil ve görüntü analiz yöntemi ile karşılaştırılması farklı makrofaj ile THP1 hücreleri enfektivite değerlendirmek için yapılmıştır:. Promastigote oranları: promastigotlar oranları (Şekil 4) Şekil 5, farklı makrofaj de THP1 hücrelerinde diferansiyel enfektivite temsil eder. Her iki yöntem de benzer sonuçlar ve makrofaj gösterdi: 1:10 promastigote oranı optimum ve tekrarlanabilir enfektivite vermiştir. Parasite-rescue/transformation tahlil ve dijital görüntü analizi için koşulları optimize edildiğinde, bu ölçümlerin yarar anti-leishmanial ilaç taraması için değerlendirildi. Leishmania ile enfekte THP1 hücreleri standart bir farklı konsantrasyonları ile tedavi edilmiştiryani nti-leishmanial ilaçlar Amfoterisin B, 24 ile 96 saat arasında değişen farklı zaman aralıkları için pentamidin ve Miltefosine. Parazit için deneme / dönüşüm testi üç nüsha olarak yapıldı kurtarıldı ve sayma yöntemi ile doğrudan hücrelerin deney iki kopya halinde yapıldı. Şekil 6 işlenmemiş ve Leishmania-enfekte bulaşmış bulaşmamış, kontrol, THP1 hücreleri tedavi kontrolü mikroskobik görüntüleri gösterir. Doz tepki eğrileri, parazit-kurtarma ve dönüşüm tahlil (transforme parazitler vs ilaç konsantrasyonu) ve görüntü analizi deneyi (amastigotes/100 THP1 hücrelerinin sayısı) (Şekil 7-9) elde edildi. Ilaçların IC 50 ExcelFit göre hesaplanmıştır ve Tablo 1&#39;de sunulmaktadır. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay benzer sonuçlar gösterdi. Dijital Görüntü-Analiz-Direk-Sayım-Assay erken 24 zaman noktalarında ve 48 saat ilaç t sırasında daha az uygun olduğureatments, Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay ilaç tedavileri sonrası 24-96 saat boyunca tüm zaman noktalarında bildirilen değerleri ile daha tutarlı sonuçlar gösterirken. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay ile sonuçlarda bu fark Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma ilaç tedavisinin erken dönemlerinde cansız amastigotes varlığı nedeniyle olabilir -Testi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig1.jpg" /> Şekil 1. Leishmania donovani bir mikroskopik görünümü promastigotlar için kurtarma ve dönüşüm amastigotes. A - Leishmania amastigotes ile enfekte Bağlanan THP1 hücreleri, B - kontrollü parçalanması C sonra yapışkan, enfekte THP1 hücreleri - enfekte THP1 makrofaj hücreleri D kurtarıldı amastigotes itibaren Leishmania donovani promastigotlar dönüşenler - tran Büyüme ve çoğalmasformed Leishmania donovani promastigotlar. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2.jpg" /> Farklı deterjan ile Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerinden amastigotes arasında THP1 hücreleri ve kurtarma lizis Şekil 2. Promastigotlar canlı Leishmania donovani amastigotes ve dönüşümün maksimum kurtarma ulaşmak için enfekte THP1 hücrelerin kontrollü lizis optimizasyonu. Analizi. İki deterjan konsantrasyonu (% 0.05 ve% 0.1) ve arıtma için iki zaman dilimi (30 saniye ve 60 saniye) test edilmiştir. RFU = rölatif floresan birimleri. Her bir çubuk yinelenen gözlemler ortalama temsil eder. [A] NP-40 ile tedavi edilen THP1 hücrelerinin lizisi neden olur ve ayrıca kurtarılan amastigote parazitlerin canlılığı etkilenir. [B] Triton X-100 treatment THP1 hücrelerinin lizisi neden olur ve ayrıca kurtarılan amastigote parazitlerin canlılığı etkilenmiş [C] Tween 80 amastigotes kurtarmak için THP1 hücrelerinin lizisi kısmi neden olmuştur. [D] Tween 80 amastigotes kurtarmak için THP1 hücrelerinin lizisi kısmi neden olmuştur. [E ] SDS tedavi THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis neden ve% 0.05 / 30 kurtarıldı amastigotes canlılığı etkilemez vermedi sn. [F 20-30 için% 0.05 SDS] Tedavi sn THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis neden ve yaşayabilir bir parazit kurtarıldı promastigotlar dönüşmek amastigotes. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig3.jpg" /> Şekil 3,. Leishmani ile in vitro enfekte farklılaşmış bir THP1 hücrelerinin Floresan dijital görüntübir donovani amastigotes. Karakteristik kDNA ayrıca her bir parazit çekirdek ile görülebilir. Makrofaj çekirdeği (mN) (1) ve parazit çekirdekleri (pN) (2) enfeksiyon nicel değerlendirmesi için ImageJ analiz yazılımı tarafından farklı olarak işaretlenmiş ve farklı olarak sayılabilir. Miktar amastigotes/100 THP1 hücrelerinin sayısı olarak yapıldı. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4054/4054fig4.jpg" /> Şekil 4. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay (alt panel) ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay (üst panel) arasında karşılaştırma. Makrofaj: 1:10 promastigote oranı optimal infeksiyon vermiştir. Hem benzer sonuçlar gösterdi. Parazit-kurtarma denemesi bazı arka plan değerleri gösterdi. Her çubuk gösterileri yinelenen değerleri ortalamasıdır. <img alt="Şekil 5," src = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig5.jpg&quot; /&gt; Şekil 5 farklı THP1 tarafından Leishmania promastigotlar ile enfekte THP1 hücreleri:. Promastigote oranı. Amastigotes/100 THP1 hücrelerinin sayısı olarak nicel sonuçlar Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. <img alt="Şekil 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6.jpg" /> Şekil 6. Leishmania donovani ile enfekte THP1 hücrelerin Dijital görüntüler (Floresan + DIC) değişik süreler için standart anti-leishmanial ilaçlarla tedavi sonrasında amastigotes. Sonuçlar amastigotes/100 THP1 hücre sayısı gibi niceliksel ve arıtılmamış kontrollere kıyasla yüzde büyüme hesaplamak ve IC 50 değerlerini belirlemek için kullanılmıştır. <img alt="Şekil 7" fo: İçerik-width = &quot;4.75in&quot; fo: src = src = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig7.jpg&quot; / &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig7highres.jpg&quot;&gt; Şekil 7. Karşılaştırılması Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve anti-leishmanial uyuşturucu taraması (Amophotericin B) Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Testi. Infekte makrofajların farklı dönemler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. IC 50 (mg / ml) değerleri Excelfit tarafından doz yanıt eğrisi hesaplanmıştır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig7large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 8," fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8.jpg" /> Şekil 8., Bir Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay Karşılaştırılmasınti-leishmanial uyuşturucu taraması (pentamidin). Infekte makrofajların farklı dönemler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. IC 50 (mg / ml) değerleri Excelfit tarafından doz yanıt eğrileri hesaplandı. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig8large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 9" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9.jpg" /> Şekil 9. Karşılaştırılması Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve anti-leishmanial uyuşturucu taraması (Mitefosine) için Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Testi. Infekte makrofajların değişik süreler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. IC50 (ug / ml) değerleri Excelfit ile doz tepki eğrilerinden yola çıkılarak hesaplanmıştır.<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig9large.jpg" target="_blank">Büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> Testi İlaç </td><td colspan="2"> 24 saat bir </td><td colspan="2"> 48 saat bir </td><td colspan="2"> 72 saat bir </td><td colspan="2"> 96 saat bir </td></tr><tr><td> IACA b </td><td> PRTA c </td><td> IACA b </td><td> PRTA c </td><td> IACA b </td><td> PRTA c </td><td> IACA b </td><td> PRTA c </td></tr><tr><td> Amfoterisin B </td><td> 0.24 ± 0.03 </td><td> 0.17 ± 0.01 * </td><td> 0.12 ± 0.04 </td><td> 0.20 ± 0.07 </td><td> 0.06 ± 0.01 </td><td> 0.06 ± 0.01 </td><td> 0.11 ± 0.03 </td><td> 0.10 ± 0.03 </td></tr><tr><td> Pentamidin </td><td> &gt; 10 </td><td> 2.55 ± 1.16 * </td><td> 2.88 &amp; plusmn; 0.58 </td><td> 1.43 ± 0.91 </td><td> 1.24 ± 0.35 </td><td> 1.52 ± 0.16 </td><td> 0.71 ± 0.63 </td><td> 0.98 ± 0.33 </td></tr><tr><td> Miltefosine </td><td> 0.38 ± 0.02 </td><td> 0.19 ± 0.08 * </td><td> 0.24 ± 0.06 </td><td> 0.30 ± 0.08 </td><td> 0.36 ± 0.02 </td><td> 0.16 ± 0.06 </td><td> 0.21 ± 0.15 </td><td> 0.17 ± 0.10 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve anti-leishmanial ilaç tarama için Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay Karşılaştırılması. Infekte makrofajların farklı dönemler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. IC 50 (mg / ml) değerleri Excelfit (Şekil 7-9) ile doz yanıt eğrileri hesaplandı bir saati sonrası ilaç tedavisi, b. IACA = Görüntü Analizi ve Doğrudan SaymaAssay; c PRTA = Parazit-Kurtarma ve Dönüşüm Testi. Verilen değerler ug / ml olarak IC 50 (parazit büyüme içinde en az% 50 inhibisyonuna neden olan ilaç konsantrasyonu) olan ve en az üç deneyin ortalaması ± SD vardır. * (&lt;0.05) istatistiksel olarak farklı IACA ile IC50 değerleri karşılaştırıldı.

Watch this Scientific Journal Video about A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic L

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Enfekte THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm testi<em&gt; In vitro</em&gt; Ile<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Anti-leishmanial ilaç tarama için optimize edilmiştir. Tahlil THP1 hücreleri, promastigotlar enfeksiyonu, testi ilaçlar, infekte makrofajların kontrollü lizis, amastigotes kurtarılması promastigotlar ve izleme promastigote büyüme dönüşüm ve florometrik tayini ile yayılması ile tedavi farklılaşma içerir.

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

a-parasite-rescue-transformation-assay-for-antileishmanial-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

22.1K Görüntüleme.  University of Mississippi. Enfekte THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm testi In vitro Ile Leishmania donovani Anti-leishmanial ilaç tarama için optimize edilmiştir. Tahlil THP1 hücreleri, promastigotlar enfeksiyonu, testi ilaçlar, infekte makrofajların kontrollü lizis, amastigotes kurtarılması promastigotlar ve izleme promastigote büyüme dönüşüm ve florometrik tayini ile yayılması ile tedavi farklılaşma içerir.

Video: A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

Hamsterlar ve Dorsal Skin Kutanöz Leishmaniasis: Antileishmanial Uyuşturucu Tarama için Faydalı Model

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to efflux the DNA-binding dye Hoechst 33342. This "side population" of cells can be identified using flow cytometric methods after the Hoechst 33342 dye is excited by an ultraviolet (UV) laser. The side population of many cell types contains stem- or progenitor-like cells. However, not all cell types have an identifiable side population. Danio rerio, zebrafish, have a robust in vivo model of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), but whether these zebrafish T-ALLs have a side population is unknown. The method described here outlines how to isolate the side population cells in zebrafish T-ALL. To begin, the T-ALL in zebrafish is generated via the microinjection of tol2 plasmids into one-cell stage embryos. Once the tumors have grown to a stage at which they expand into more than half of the animal's body, the T-ALL cells can be harvested. The cells are then stained with Hoechst 33342 and examined by flow cytometry for side population cells. This method has broad applications in zebrafish T-ALL research. While there are no known cell surface markers in zebrafish that confirm whether these side population cells are cancer stem cell-like, in vivo functional transplantation assays are possible. Furthermore, single-cell transcriptomics could be applied to identify the genetic features of these side population cells.

Here, we describe a technique to isolate the side population cells from a zebrafish model of myc-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). This side population assay is highly sensitive and is described for zebrafish T-ALL, but it may be applicable to other malignant and non-malignant zebrafish cell types.

Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and maintained in culture, provides an exciting opportunity to facilitate the modeling of the epithelial response to enteric infections. In vivo, intestinal epithelial cells (IECs) play a key role in regulating intestinal homeostasis and may directly inhibit pathogens, although the mechanisms by which this occurs are not fully elucidated. The cytokine interleukin-22 (IL-22) has been shown to play a role in the maintenance and defense of the gut epithelial barrier, including inducing a release of antimicrobial peptides and chemokines in response to infection.
We describe the differentiation of healthy control hiPSCs into iHOs via the addition of specific cytokine combinations to their culture medium before embedding them into a basement membrane matrix-based prointestinal culture system. Once embedded, the iHOs are grown in media supplemented with Noggin, R-spondin-1, epidermal growth factor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, and Y-27632 dihydrochloride monohydrate. Weekly passages by manual disruption of the iHO ultrastructure lead to the formation of budded iHOs, with some exhibiting a crypt/villus structure. All iHOs demonstrate a differentiated epithelium consisting of goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells, and polarized enterocytes, which can be confirmed via immunostaining for specific markers of each cell subset, transmission electron microscopy (TEM), and quantitative PCR (qPCR). To model infection, Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 are microinjected into the lumen of the iHOs and incubated for 90 min at 37 &#176;C, and a modified gentamicin protection assay is performed to identify the levels of intracellular bacterial invasion. Some iHOs are also pretreated with recombinant human IL-22 (rhIL-22) prior to infection to establish whether this cytokine is protective against Salmonella infection.

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived intestinal organoids offer exciting opportunities to model enteric diseases in vitro. We demonstrate the differentiation of hiPSCs into intestinal organoids (iHOs), the stimulation of these iHOs with cytokines, and the microinjection of Salmonella Typhimurium into the iHO lumen, enabling the study of an epithelial invasion by this pathogen.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücresini kullanma- Salmonella ve diğer patojenlere karşı epitelyal hücre korumasını Incelemek ve değiştirmek Için bağırsak organoidleri türetilmiştir

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Bir bakteriyel yapay kromozom cDNA klon rekombinant Zika virüs kurtarma

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to visceral lesions. Currently, 12 million people are estimated to be infected with Leishmania worldwide and over 1 billion people live at the risk of infection. Leishmania amazonensis is endemic in Central and South America and usually leads to the cutaneous form of the disease, which can be directly visualized in an animal model. Therefore, L. amazonensis strains are good models for cutaneous leishmaniasis studies because they are also easily cultivated in vitro. C57BL/6 mice mimic the L. amazonensis-driven disease progression observed in humans and are considered one of the best mice strains model for cutaneous leishmaniasis. In the vertebrate host, these parasites inhabit macrophages despite the defense mechanisms of these cells. Several studies use in vitro macrophage infection assays to evaluate the parasite infectivity under different conditions. However, the in vitro approach is limited to an isolated cell system that disregards the organism&#39;s response. Here, we compile an in vivo murine infection method that provides a systemic physiological overview of the host-parasite interaction. The detailed protocol for the in vivo infection of C57BL/6 mice with L. amazonensis comprises parasite differentiation into infective amastigotes, mice footpad cutaneous inoculation, lesion development, and parasite load determination. We propose this well-established method as the most adequate method for physiological studies of the host immune and metabolic responses to cutaneous leishmaniasis.

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Here, we present a compiled protocol to evaluate the cutaneous infection of mice with Leishmania amazonensis. This is a reliable method for studying parasite virulence, allowing a systemic view of the vertebrate host response to the infection.

Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için Leishmania amazonensis ile Vivo Enfeksiyon

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...