Bu çalışma Fritz Thyssen Vakfı (RK 10.11.2.153), Alman Araştırma Kurumu (DFG, KR2119/3-2 ve RK KR2119/8-1), Eğitim Federal ve Araştırma Bakanlığı (BMBF hibeleri tarafından desteklenen , NGFNplus; RK 01GS08134) ve [LFB için] hayırsever Hertie Vakfı Doktora Bursu. Biz video çekimi sırasında verdikleri destek nedeniyle Carolin Obermaier ve Julia Westermeier ederim.

1. Cilt Biyopsi ve İnsan Fibroblast ekimi <ol><li> Deri biyopsisi deneyimli bir hekim tarafından alınmalıdır. Prosedür steril koşullar altında yer alır ve lokal anestezi gerektirir. Biyopsi için kullanılan tipik siteleri üst kol, omuz veya bel iç tarafı vardır. </li><li> Siz kültür insan fibroblastlar için yeterli doku almak için punch biyopsi ile 4x4mm veya 6x6mm çaplı numune alabilir. </li><li> Cilt 2-4 T25 matara onları ayırmak için steril koşullar altında eşit küçük parçalara biyopsisi kesin. Her şişenin Epidermisin 2-3 adet içermelidir. Kültür ortamı% 15 FCS,% 1.1 sodyum piruvat ve% 1 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı içinde penisilin / streptomisin içerir. </li><li> 37 hücreleri inkübe ° C ve% 5 CO2. İlk fibroblastlar epidermal örnek dışında büyümek kadar beklenen yayılma süresi 1-2 haftadır. Büyüme sorunla karşılaşmadım varsa, fibroblast büyüme fa yararlanabilirctor (5-10 ng / ml FGF2) hücrelerinin büyümesini geliştirmek için. </li><li> % 50-70 bir hücre konfluense erişildikten sonra, primer insan fibroblastları dondurulabilir. 50-70% konfluent kadar saati geldiğinde, hücre hatları arasında farklılık gösterir. % 90 FCS artı% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde fibroblastlar dondurun. </li></ol> 2. Canlı Hücre Görüntüleme Mikroskobu için İnsan Fibroblastlar hazırlanması Yaşlanması ile ilişkili değişiklikler birden fazla geçit sonra hücrelerin özelliklerini değiştirebilirsiniz Genel olarak, insan fibroblastları ile deneyler 10 Aşağıdaki pasajlar ile yapılmalıdır. Şüphe durumunda, beta-galaktosidaz deneyleri, ilgili hücreler içinde yaşlanma sürecinin indüksiyon değerlendirmek için de kullanılabilir. Genellikle yaşlı fibroblastlar (yukarıya bakınız) kullanmayın. Dahası, çeşitli hücre çizgileri karşılaştırmak için, her bir hücre hattı da aynı kanal adedi ile çalışır. Sağlıklı kontrollere göre farklı genetik olarak homojen hastaların karşılaştırılması tavsiye edilir. Ancak, bazenspesifik mutasyonları taşıyan hastalarda nadir olarak, bu belli bir pasaj sayısı ve farklı kontrol hatları ile sadece bir hastada alınan cilt biyopsilerinde eklenmek zorunda anlamına gelebilir olabilir - burada dahil tüm hatlar aynı pasajda sayısını sağlamak esastır. % 50-70 bir hücre konfluense ulaştığı ancak hiç bir deney planlanmış ise, fibroblastlar dondurulmuş olmalıdır. <ol><li> Denemenin ilk gününde, bir kez PBS ile ekli fibroblastlar yıkayın. Sonra proteolitik DNaz enzimler (yani Accumax) bir hücre dekolmanı çözüm kullanarak şişeyi alttan onları serbest bırakın. </li><li> 4 odacıklı coverglass (kuyu başına 1,8 cm 2 kültür alanı) her bir kuyunun içinde hücreler ve tohum 50,000-70,000 hücreleri saymak. Buna göre, 8-haznesi coverglas için, hücre sayısı ya da daha az bir küçük yarısı (çukur başına 0.8 cm 2 kültür alanı) uygundur. Bu, tohum yerine gerçek tek hücreli bir analiz gerçekleştirmek için küçük bir hücre sayısı önemlidir. Odaları için spesifik bir kaplama is gerekli. </li><li> 24-48 saat sonra, canlı hücre görüntüleme deney gerçekleştirilebilir. Canlı hücre görüntüleme mikroskobu sıcaklık ve CO 2 seviyeleri kontrol küvöz ile donatılmış olduğundan emin olun. Görüntü elde etme sırasında, 37 bir atmosfer ° C ve% 5 CO2 tutulmalıdır. </li><li> Her canlı hücre görüntüleme ölçümü en az üç bağımsız deneyler yapılmalıdır. Toplam olarak, hücre hattı 50 hücreleri en az bir görüntülü olmalıdır. Canlı hücre görüntüleme deneyleri hem de off-line analiz toplama tarafsız veri sağlamak için kör koşulları altında yapılmak zorundadır. </li></ol> 3. İnsan Fibroblastlar Oturma Mitokondriyal Fonksiyon Ölçümü Mitokondrial membran potansiyeli (MMP) bağımlı boyalar ile mitokondriyal fonksiyon geleneksel ölçüm için, floresan aktive hücre sıralama (FACS) birincil yöntemidir. Insan fibroblastları durumunda, hücresel autofluore olarakscence sıklıkla rastlanır ve gerçek boyama sinyal parazit ile yalancı pozitif sonuçlara neden olabilir. Otofloresansı tipik olarak fibroblastlar daha yüksek geçiş numarası ile daha belirgin hale gelir. Bu nedenle, canlı hücre görüntüleme mikroskopisi ile insan fibroblastlar mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için tercih ediyor. <ol><li> 24-48 saat sonra, tohum, RPMI ortamı içinde MMP-bağımlı boya tetramethylrodamine etil ester (TMRE) 50 nM olarak fibroblastlar inkübe edilir. Bu olumsuz görüntü kalitesini etkileyebilir gibi bu RPMI medyum fenol kırmızısı yoksun olmalıdır. Hoechst boyanma 1.6 uM çekirdekleri görselleştirmek için ilave edilmelidir. </li><li> 37 ° C ve% 5 CO2 &#39;de 15 dakika için ışıktan korunmuş boyanma hazırlanan çözelti içinde hücreler inkübe edin. </li><li> RPMI medyum (fenol kırmızısı olmadan) ile boyama çözüm değiştirin. Yıkama adımlı ve hemen görüntü hücreleri olmadan devam edin. 63x büyütme ve kullanma konfokal lazer tarama mikroskopi tekniği (alternatif floresan mikroskobu kullanınApotome tekniği) hücrelerinin tek katmanlarını tanımlamak için kullanılır. 37 uygulanır ° C ve% 5 görüntüleme işlemi sırasında hücreler 2 CO. </li><li> Görüntüleme fibroblastlar, TMRE boyama hızlı çamaşır suyu dışarı olabildiğince floresan ışık uygulanan pozlama süresi azami dikkat zaman. 200 ve 300 ms arasındaki uygun pozlama süresini tanımlayın ve bu aralık aşmamaktadır. Ayarları hücre hatları arasında farklı ise bir yoğunluğuna dayalı karşılaştırmalar yapmak mümkün olacak gibi standart ayarları altında görüntü elde etme, çok önemlidir. </li><li> Görüntülü hücrelerinin etrafında belirli bir yarıçap ışığa maruz kaldıktan sonra dışarı ağartılmış gibi, yeteri kadar photobleached bölümünden sonraki görme alanı tutmak. </li><li> Off-line analizler ImageJ Yazılım (; Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD Wayne Rasband) kullanılarak yapılmaktadır. </li><li> Bir seçim aracını kullanarak ilgi hücreyi seçin. </li><li> 8-bit görüntü dönüştürme (Görüntü &lt;Tip &lt;8-bit). </li><li> Belirsiz gürültü b azaltıny &quot;Benek&quot; fonksiyonu (Süreç &lt;Gürültü &lt;Benek) kullanarak. </li><li> Durumu (Resim &lt;Arama Tabloları &lt;Fire) - &quot;Yangın Arama Tabloları&quot; seçin. </li><li> &quot;Over / Under&quot; işlevi eşik fonksiyonu açın ve (Resim &lt;ayarlayın &lt;Eşiği) eşik ayarlayın. </li><li> Eğer algılanabilir her mitokondriyal partikül (Analiz &lt;Analiz Parçacıklar) için ortalama gri değeri verecektir &quot;parçacıklar analiz&quot; seçeneğini seçin. Bir Excel elektronik olarak verilen sonuç listesini kaydedin. </li><li> Açık sonuç Excel programında dosya ve mitokondriyal yapıların ortalama gri değeri ortalaması (Verilen excel sonuç listesinde &#39;ortalama&#39; olarak gösterilir) hesaplamak. </li><li> Bir yüzey komplo oluşturmak için, &quot;3D&quot; eklentisi bölümünde eklenti &quot;Etkileşimli 3D yüzey komplo&quot; seçin. Burada daha farklı görüntü seçenekleri kullanarak komplo ayarlayabilirsiniz. &quot;Spectrum LUT&quot; için &quot;Orijinal Renkler&quot; değiştirilmesi uygun arsa için yoğunluk ölçek çubuğu verir. </li><li> Alternatif olarakcanlı hücre görüntüleme, MMP-bağımsız boya Mitotracker Green FM bir kombinasyonu ve CM-H 2 XRos kullanılabilecek MMP-bağımlı boya Mitotracker ile insan fibroblastları mitokondriyal işlev analiz etmek için TMRE kullanarak. Yine, insan fibroblastlar için hücre görüntüleme mikroskopisi tercih edilir yaşamak, ama genel olarak bu alternatif de hücrelerin 12 diğer tür FACS analizi kullanılarak kullanılır olmuştur. İnsan fibroblastlarındaki mitokondriyal fonksiyon, protokol bölümünde 5 adım 3-7 ölçmek için bu alternatif yaklaşımı kullanarak &quot;insan fibroblastlar yaşayan mitochondrio-lizozomal kolokalizasyon Ölçümü&quot; uygulanmalıdır. Bununla, Mitotracker Yeşil FM ve Mitotracker CM-H 2 XRos için mitokondri pozitif hem sinyallerin bindirme, hesaplanmış ve tüm mitokondri mevcut oran olarak fonksiyonel mitokondri miktarını belirtir. </li></ol> 4. İnsan Fibroblastlar Oturma Mitokondriyal Morfolojisi Ölçümü <ol><li> 24-48hr tohumlama sonra, RPMI medyum içinde 200 nM Mitotracker Green FM (fenol kırmızısı yok) içinde inkübe hücreleri 37 &#39;de 15 dakika için ışıktan korunmuş ° C ve% 5 CO2. Hoechst boyanma 1.6 uM çekirdekleri vurgulamak için kullanılır. Mitotracker Yeşil FM Tüm mitokondrial yapılar günümüze lekeleri bir MMP-bağımsız bir boya olduğunu. </li><li> Hafifçe bir kez PBS ile yıkayın hücrelerini. </li><li> Hücreleri ve hemen görüntü hücrelere taze RPMI medyum (fenol kırmızısı olmadan) ekleyin. Hücre tabakaları tek tek tanımlamak için 63x büyütme ve konfokal lazer tarama mikroskopi tekniği (Apotome tekniği kullanılarak alternatif floresan mikroskobu) kullanın. </li><li> Off-line analizler ImageJ Yazılım kullanımı ile dışarı alınır. </li><li> Bir seçim aracını kullanarak ilgi hücreyi seçin. </li><li> 8-bit görüntü dönüştürme (Görüntü &lt;Tip &lt;8-bit). </li><li> (Süreç &lt;Gürültü &lt;Benek) &quot;Benek&quot; işlevini kullanarak belirsiz gürültüyü azaltın. </li><li> Mitokondriyal vurgulamak için evrişim filtresi kullanındrial yapılar (&lt;Filtreler &lt;Convolve işleyin). </li><li> Sinyal-gürültü oranı uygun şekilde eşik ayarlayın (Resim &lt;ayarlayın &lt;Eşiği). </li><li> &quot;Parçacıklar analiz&quot; seçeneğini kullanarak, mitokondriyal yapıların otomatik tanımlama (Analiz &lt;Analiz Parçacıklar) Seçilen bir piksel boyutuna göre başlatılır. Çeşitli mitokondriyal parametreleri sonradan, alan, çevre, küçük ve büyük balta ya dairesellik olarak hesaplanır. Bu ölçümler (&lt;Set Ölçümler Analizi) ayrı ayrı ayarlanabilir. Bir Excel elektronik olarak verilen sonuç listesini kaydedin. </li><li> Excel programında sonuç dosyasını açın. Bu tür parametrelerin kullanılması ile mitokondriyal morfoloji analizi yapılabilir. Bu, bir mitokondriyal ağ dallanma derecesini belirten biçim faktörü tanımı, [formül: (2 çevre uzunluğu) / (4 * PI () * bölge)] gibi en-boy oranı mitokondri (formül uzunluğunun belirlenmesine: Majör eksenleri / küçük eksenleri). </li></ol> 5. İnsan Fibroblastlar Oturma Mitochondrio-lizozomal kolokalizasyon Ölçümü <ol><li> 24-48 saat sonra, tohum, 200 nM Mitotracker Green ve FM içinde inkübe hücreler 100 nM Lyostracker Red 37 ° C ve% 5 CO2, 15 dakika süreyle ışıktan korunmuş RPMI ortamı (fenol kırmızısı olmadan) içinde DND-99. Hoechst boyanma 1.6 uM çekirdekleri vurgulamak için kullanılır. </li><li> Taze RMPI orta (fenol kırmızısı olmadan) 100 nM Lyostracker Kırmızı DND-99 içeren ile orta değiştirin. Bu boya tüm görüntüleme oturumu sırasında mevcut olması gerekir. Kuluçka döneminden sonra hücreler yıkamayın. Hemen görüntü hücreleri. Hücre tabakaları tek tek tanımlamak için 63x büyütme ve konfokal tekniği (alternatif Apotome tekniği) kullanın. </li><li> Off-line analizler ImageJ Yazılım kullanımı ile dışarı alınır. </li><li> Eğer kolokalizasyon statü açısından analiz etmek istiyorum, iki ayrı görüntü açın. </li><li> 8-bit görüntü dönüştürme (Görüntü &lt;Tip &lt;8-bit). </li&gt; <li> Her iki görüntüde de &quot;Benek&quot; fonksiyonu (Süreç &lt;Gürültü &lt;Benek) kullanarak belirsiz gürültüyü azaltın. </li><li> Eklenti ilgili kanallar için değerleri verir ve Pearson katsayısı hesaplar kolokalizasyon analiz aracı olarak &quot;Jacop&quot;, katsayısı örtüşen ve Manders &#39;katsayısı (Eklentiler &lt;Jacop) seçin. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Insan fibroblastlar yaşayan Mitokondriyal fonksiyon canlı hücre görüntüleme tekniği yoluyla değerlendirilebilir. Fonksiyonel testlerde, TMRE floresans sinyalinin mitokondrial membran potansiyeli (MMP) ile ilişkilidir. Normal MMP koşullar altında, TMRE floresans azalması MMP (Şekil 1A, alt sıra) ile karakterize patolojik şartlar altında daha (Şekil 1A, üst satır) anlamlı olarak yüksektir. Bu floresan yoğunluğu her mitokondriyal yapısının ortalama gri değerinin ortalamaları hesaplanarak ölçülür ( <strong&gt; Şekil 1B). Floresans yoğunluğu ImageJ yazılım üzerinden ölçülebilir. Burada, &quot;seçeneği interaktif yüzey komplosu&quot; kullanımı farklı pik şiddetleri (Şekil 1A, sağ tarafı) resimde sağlar. Insan fibroblastlar mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi yanında, canlı hücre görüntüleme mikroskopi mitokondriyal morfolojisi farklı parametreler tanımlamak için kullanılabilir. Mitotracker kullanarak yeşil FM boya mitokondriyal yapı kendi MMP (Şekil 2) bağımsız olarak görselleştirilebilir. Bu analiz içine mevcut tüm mitokondriyal yapıların eklenmesi sağlamak önemlidir. ImageJ Yazılımı kullanılarak, morfoloji gibi tek burada mitokondriyal morfoloji parametreleri (Şekil 2, bir &quot;ikili&quot;) tespit edilebilir, ikili şekiller esas alınarak analiz edilir. Form faktörü gibi en-boy oranı bakımından mitokondriyal morfoloji analiz için son zamanlarda örnekler 6, 1 yayınlanan3. Insan fibroblastlar yaşayan ölçülebilir bir diğer önemli özelliği mitokondriyal yapılarının bozulması olduğunu. Bu ilerlemenin ilk adımı canlı hücre görüntüleme mikroskopi mitochondrio-lizozomal kolokalizasyon değerlendirilebilir. Bazı patolojik koşullar lizozomlar (Şekil 3A) ile mitokondri artan bir ko ile sonuçlanır. Yine, Mitotracker Green FM kendi MMP bağımsız olarak mitokondriyal leke yapılar için kullanılır. Buna ek olarak, Lysotracker Kırmızı DND-99 ile boyanma lizozomal yapılar görüntülenmesi izin verir. Bu yıkama adımları görselleştirme için çok düşük olur sinyal azaltmak gibi Lysotracker Kırmızı boya, görüntüleme işlemi sırasında mevcut olduğunu önemlidir. Kolokalizasyon yeşil (Mitotracker Yeşil FM) ve kırmızı (Lysotracker Kırmızı DND-99) boyama (beyaz oklar, Şekil 3A) örtüşme nedeniyle net sarı floresan sinyalleri tarafından temsil edilir ve Pearson coe hesaplanması ile belirlenirfficient (Şekil 3B). Genel olarak, ImageJ yazılım ile off-line analizler için, bu ilgi, belirli bir bölge (ROI) tanımı önlenebilir, böylece resim başına bir hücre görselleştirmek için yardımcı olur. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1.jpg" /> Şekil 1. Canlı hücre görüntüleme tekniği ile insan fibroblastlar yaşayan mitokondrial membran potansiyeli (MMP) belirten TMRE floresans sinyal ölçümü. (A) TMRE olan floresan yoğunluğu MMP ile ilişkilendiren bir floresan MMP-bağımlı boya vardır. Hoechst boyalı çekirdekleri (mavi) leke kullanılmıştır. Normal MMP koşullar altında (üst sıra), TMRE floresans azalması MMP (alt sıra) ile karakterize patolojik şartlar altında daha yüksektir. Floresan yoğunluğunun ayrıca gösteriliryoğunluğu yüzey arsa gibi. Ölçek çubuğu 10 mikron gösterir. (B), örnek fibroblastların İstatistiksel analizler (A) &#39;da gösterilmektedir. Patolojik koşullar altında, mitokondri bir azalma TMRE floresans normal MMP durumuna göre ölçülür. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4228/4228fig2.jpg" /> Şekil 2. Canlı hücre görüntüleme tekniği ile insan fibroblastlar canlı mitokondri morfolojisindeki ölçümü. Mitotracker Yeşil FM (yeşil) mitokondriyal yapıları göstermek için kullanılır, bunun için de MMP bağımsızdır. Hoechst boyalı çekirdekleri (mavi) leke kullanılmıştır. ImageJ Yazılımı kullanarak, morfolojisi ikili rakamlar üzerinde analiz edilebilir. Ölçek çubuğu 10 mikron gösterir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig2large.jpg" target="_blank">tıklayınız</a><html> Burada büyük bir rakam görmek için. <img alt="Şekil 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3.jpg" /> Şekil 3. Canlı hücre görüntüleme tekniği ile insan fibroblastlar yaşayan lizozomlar ile mitokondri kolokalizasyon ölçümü. (A) Mitotracker Yeşil FM (yeşil) mitokondrial yapılar leke için kullanılan, Lyostracker Kırmızı DND-99 (kırmızı) lizozomal yapılar görselleştirir. Hoechst boyalı çekirdekleri (mavi) leke kullanılmıştır. Patolojik koşullar altında başarılı bir şekilde ko Lysotracker kırmızı ve yeşil Mitotracker boyama (beyaz oklar) üst üste dolayı sarı bir sinyal ile gösterilir. Ölçek çubuğu 10 mikron gösterir. (B), örnek fibroblastların İstatistiksel analizler (A) &#39;da gösterilmektedir. Yükseltilmiş Pearson katsayısı değeri mitochondrio-lizozomal kolokalizasyon sonuçların bir yüksek derecede./ 4228/4228fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.

<ol>
	<li>de Rijk, M. C., Launer, L. J., Berger, K., Breteler, M. M., Dartigues, J. F., Baldereschi, M., Fratiglioni, L., Lobo, A., Martinez-Lage, J., Trenkwalder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Parkinson's+disease+in+Europe:+A+collaborative+study+of+population-based+cohorts.">Prevalence of Parkinson's disease in Europe: A collaborative study of population-based cohorts.</a> Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 21-23 (2000).</li><li>Dorsey, E. R., Constantinescu, R., Thompson, J. P., Biglan, K. M., Holloway, R. G., Kieburtz, K., Marshall, F. J., Ravina, B. M., Schifitto, G., Siderowf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projected+number+of+people+with+Parkinson+disease+in+the+most+populous+nations.">Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations.</a> Neurology. 68, 384-386 (2005).</li><li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Lewy+bodies.">Alpha-synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388, 839-840 (1997).</li><li>Chung, K. K., Zhang, Y., Lim, K. L., Tanaka, Y., Huang, H., Gao, J., Ross, C. A., Dawson, V. L., Dawson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+ubiquitinates+the+alpha-synuclein-interacting+protein,+synphilin-1:+implications+for+Lewy-body+formation+in+Parkinson+disease.">Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease.</a> Nature. 7, 1144-1150 (2001).</li><li>Kruger, R., Eberhardt, O., Riess, O., Schulz, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+one+biochemical+pathway+to+fit+all+genes.">Parkinson's disease: one biochemical pathway to fit all genes.</a> Trends Mol. Med. 8, 236-240 (2002).</li><li>Krebiehl, G., Ruckerbauer, S., Burbulla, L. F., Kieper, N., Maurer, B., Waak, J., Wolburg, H., Gizatullina, Z., Gellerich, F. N., Woitalla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+basal+autophagy+and+impaired+mitochondrial+dynamics+due+to+loss+of+Parkinson's+disease-associated+protein+DJ-1.">Reduced basal autophagy and impaired mitochondrial dynamics due to loss of Parkinson's disease-associated protein DJ-1.</a> PLoS One. 5, e9367 (2010).</li><li>Exner, N., Treske, B., Paquet, D., Holmstrom, K., Schiesling, C., Gispert, S., Carballo-Carbajal, I., Berg, D., Hoepken, H. H., Gasser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss-of-function+of+human+PINK1+results+in+mitochondrial+pathology+and+can+be+rescued+by+parkin.">Loss-of-function of human PINK1 results in mitochondrial pathology and can be rescued by parkin.</a> J. Neurosci. 27, 12413-12418 (2007).</li><li>Burbulla, L. F., Krebiehl, G., Kruger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+is+the+challenge--the+impact+of+mitochondrial+dynamics+in+Parkinson's+disease.">Balance is the challenge--the impact of mitochondrial dynamics in Parkinson's disease.</a> European journal of clinical investigation. 40, 1048-1060 (2010).</li><li>Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z., Muller, T., Bornemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+mutations+in+the+gene+encoding+Omi/HtrA2+in+Parkinson's+disease.">Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease.</a> Human molecular genetics. 14, 2099-2111 (2005).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> The Journal of cell biology. 183, 795-803 (2008).</li><li>Dagda, R. K., Cherra, S. J., Kulich, S. M., Tandon, A., Park, D., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PINK1+function+promotes+mitophagy+through+effects+on+oxidative+stress+and+mitochondrial+fission.">Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission.</a> The Journal of biological chemistry. , 284-13843 (2009).</li><li>Kieper, N., Holmstrom, K. M., Ciceri, D., Fiesel, F. C., Wolburg, H., Ziviani, E., Whitworth, A. J., Martins, L. M., Kahle, P. J., Kruger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+and+morphology+by+interaction+of+Omi/HtrA2+with+the+mitochondrial+fusion+factor+OPA1.">Modulation of mitochondrial function and morphology by interaction of Omi/HtrA2 with the mitochondrial fusion factor OPA1.</a> Experimental cell research. 316, 1213-1224 (2010).</li><li>Burbulla, L. F., Schelling, C., Kato, H., Rapaport, D., Woitalla, D., Schiesling, C., Schulte, C., Sharma, M., Illig, T., Bauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+the+mitochondrial+chaperone+mortalin+in+Parkinson's+disease:+functional+impact+of+disease-related+variants+on+mitochondrial+homeostasis.">Dissecting the role of the mitochondrial chaperone mortalin in Parkinson's disease: functional impact of disease-related variants on mitochondrial homeostasis.</a> Human molecular genetics. 19, 4437-4452 (2010).</li><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Nguyen, H. N., Byers, B., Cord, B., Shcheglovitov, A., Byrne, J., Gujar, P., Kee, K., Schule, B., Dolmetsch, R. E., Langston, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress.">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li><li>Seibler, P., Graziotto, J., Jeong, H., Simunovic, F., Klein, C., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Parkin+recruitment+is+impaired+in+neurons+derived+from+mutant+PINK1+induced+pluripotent+stem+cells.">Mitochondrial Parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5970-5976 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Ex vivo modeller olarak Hasta deri fibroblast hastalıkla ilişkili genetik bozukluklar karakterize etmek için önemli bir araç haline gelir. Buna ek olarak, deri türevi fibroblastlar kolayca erişilebilir ve kültür üzerine genişletilmiş olabilir. Bunlar endojen gen hastalığa neden olan, ancak etkilenen bireyin tüm genetik arka plan da içerir nedenle, PD ile ilişkili genetik mutasyonu taşıyan hastadan elde edilen birincil hücreler tümör hücre hatları üzerinde kullanılması tercih edilir. B...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog No. </td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı </td><td> Invitrogen </td><td> 52400-025 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 ortamı, hiçbir Fenol Kırmızısı </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-063 </td></tr><tr><td> Dulbecco fosfat-tamponlu salin (DPBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> Fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) </td><td> PeproTech </td><td> 100-18B </td></tr><tr><td> Accumax (dekolmanı çözüm) </td><td> PAA </td><td> L11-008 </td></tr><tr><td> Lab-TekTMII odacıklı coverglasses </td><td> Nalge Nunc Uluslararası </td><td> 115382 </td></tr><tr><td> Tetramethylrodamine etil ester (TMRE) </td><td> Invitrogen </td><td> T-669 </td></tr><tr><td> Mitotracker Yeşil FM </td><td> Invitrogen </td><td> M-7514 </td></tr><tr><td> Mitotracker CM-H2XRos </td><td> Invitrogen </td><td> M-7513 </td></tr><tr><td> Lyostracker Kırmızı DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L-7528 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H-3570 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özgül reaktifler ve ekipman.

the use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of parkinson's disease

Parkinson hastalığı (PH) en sık görülen ikinci hareket bozukluğudur ve 60 1 yaşın üzerindeki insanların% 1 etkiler. Yaşlanma en önemli risk faktörü olduğundan, PD vakaları önümüzdeki yıllarda 2 sırasında artacaktır. Patolojik protein katlanması ve yetersiz protein parçalanma yolları yanında, mitokondriyal fonksiyon ve morfolojisi değişiklikler PD 3-11 nörodejenerasyon daha ayırt edici niteliği olarak işaret edilmiştir. Parkinsonizm moleküler yolaklar incelemek için in vitro modellerde olduğu gibi fare ve insan kanser hücrelerinde araştırma yıl sonra, ex vivo modelleri olarak hasta ve uygun kontrollerin insan fibroblastlar kullanım potansiyeli uyarılar olarak kabul edilir ise, değerli bir araştırma aracı haline gelmiştir. Ölümsüzleştirdiği, oldukça yapay hücre modelleri dışında, hastalıkla ilişkili mutasyonları taşıyan hastaların primer fibroblast görünüşte önemli patolojik özellikler o yansıtacakf insan hastalığı. Burada, cilt biyopsi alınarak kültür insan fibroblastlar ve mitokondriyal fenotipleri tanımlamak için gerekli mikroskobik teknikler ayrıntılı protokolleri kullanarak prosedürü tasvir. Bunlar mitokondriyal fonksiyon ve dinamikleri ile ilgili olan PD ile ilişkili farklı özelliklerini incelemek amacıyla kullanılmıştır. Ex vivo, mitokondri lizozom yolağı yoluyla fonksiyonu, morfolojisi, lizozomlar (organeller aşağılayıcı işlevsiz mitokondri) ve bozulması ile ko açısından analiz edilebilir . Bunlar fenotipleri PD erken belirtileri belirlenmesi için son derece önemli olan ve insan hastalığı-gen taşıyıcılarında klinik motor semptomlar öncesinde olabilir. Dolayısıyla, burada sunulan testlerin nörodejenerasyon patolojik özelliklerini belirlemek ve PD yeni tedavi stratejileri tanımlamak için yardımcı olacak değerli bir araç olarak kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease at JoVE.com

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Parkinson hastalığı yol açan genlerde mutasyon taşıyan hastaların Fibroblastlar kolay erişilebilir bir temsil<em&gt; Ex vivo</emHastalığı ile ilişkili fenotipleri incelemek için&gt; modeli. Canlı hücre görüntüleme yaşayan hücrelerin morfolojik ve fonksiyonel parametreleri çalışma fırsatı verir. Burada insan fibroblastlar ve mitokondriyal fenotipleri sonraki izleme hazırlanması tarif.

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

the-use-primary-human-fibroblasts-for-monitoring-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

16.7K Görüntüleme.  DZNE. Parkinson hastalığı yol açan genlerde mutasyon taşıyan hastaların Fibroblastlar kolay erişilebilir bir temsil Ex vivo modeli. Canlı hücre görüntüleme yaşayan hücrelerin morfolojik ve fonksiyonel parametreleri çalışma fırsatı verir. Burada insan fibroblastlar ve mitokondriyal fenotipleri sonraki izleme hazırlanması tarif.

Video: The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Tıp

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our understanding of the mechanisms underlying parkinsonian symptoms, since it recapitulates the changes in basal ganglia circuitry and pharmacology observed in parkinsonian patients1-4. However, the precise cellular and molecular changes occurring at cortico-striatal synapses of the output pathways within the striatum, which is the major input region of the basal ganglia remain elusive, and this is believed to be site where pathological abnormalities underlying parkinsonian symptoms arise3,5.
In PD, understanding the mechanisms underlying changes in basal ganglia circuitry following degeneration of the nigro-striatal pathway has been greatly advanced by the development of bacterial artificial chromosome (BAC) mice over-expressing green fluorescent proteins driven by promoters specific for the two striatal output pathways (direct pathway: eGFP-D1; indirect pathway: eGFP-D2 and eGFP-A2a)8, allowing them to be studied in isolation. For example, recent studies have suggested that there are pathological changes in synaptic plasticity in parkinsonian mice9,10. However, these studies utilised juvenile mice and acute models of parkinsonism. It is unclear whether the changes described in adult rats with stable 6-OHDA lesions also occur in these models. Other groups have attempted to generate a stable unilaterally-lesioned 6-OHDA adult mouse model of PD by lesioning the medial forebrain bundle (MFB), unfortunately, the mortality rate in this study was extremely high, with only 14% surviving the surgery for 21 days or longer11. More recent studies have generated intra-nigral lesions with both a low mortality rate &gt;80% loss of dopaminergic neurons, however expression of L-DOPA induced dyskinesia11,12,13,14 was variable in these studies. Another well established mouse model of PD is the MPTP-lesioned mouse15. Whilst this model has proven useful in the assessment of potential neuroprotective agents16, it is less suitable for understanding mechanisms underlying symptoms of PD, as this model often fails to induce motor deficits, and shows a wide variability in the extent of lesion17, 18.
Here we have developed a stable unilateral 6-OHDA-lesioned mouse model of PD by direct administration of 6-OHDA into the MFB, which consistently causes &gt;95% loss of striatal dopamine (as measured by HPLC), as well as producing the behavioural imbalances observed in the well characterised unilateral 6-OHDA-lesioned rat model of PD. This newly developed mouse model of PD will prove a valuable tool in understanding the mechanisms underlying generation of parkinsonian symptoms.

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson&#039;s Disease

A protocol for performing unilateral 6-OHDA lesions of the medial forebrain bundle in mice is described. This method has a low mortality rate (13.3 %) with 89% of the surviving animals showing &#62;95% loss of striatal dopamine and 90.63&#177;-4.02 % ipsiversive rotational bias towards the side of the lesion.

Parkinson Hastalığının tek taraflı lezyonlanmıştır 6-OHDA Mouse Model Geliştirme

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

Parkinson Hastalığında nöropeptitler MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

Normal İnsan Beyin Çözünür ve çözünmez PrP Oligomerleri İzolasyonu

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Damar Hastalığı Çalışmaları Farelerde Ortotopik Aort Nakli

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Parkinson Hastalığında Maskeyi Düşürme Duyarlılık Mekanizmalarına Gen-Çevre Etkileşim Modelleri

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Controlling Parkinson's Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time according to fluctuating disease and medication state. In the present realization of adaptive DBS we record and stimulate from the DBS electrodes implanted in the subthalamic nucleus of patients with Parkinson&#39;s disease in the early post-operative period. Local field potentials are analogue filtered between 3 and 47 Hz before being passed to a data acquisition unit where they are digitally filtered again around the patient specific beta peak, rectified and smoothed to give an online reading of the beta amplitude. A threshold for beta amplitude is set heuristically, which, if crossed, passes a trigger signal to the stimulator. The stimulator then ramps up stimulation to a pre-determined clinically effective voltage over 250 msec and continues to stimulate until the beta amplitude again falls down below threshold. Stimulation continues in this manner with brief episodes of ramped DBS during periods of heightened beta power.
Clinical efficacy is assessed after a minimum period of stabilization (5 min) through the unblinded and blinded video assessment of motor function using a selection of scores from the Unified Parkinson&#39;s Rating Scale (UPDRS). Recent work has demonstrated a reduction in power consumption with aDBS as well as an improvement in clinical scores compared to conventional DBS. Chronic aDBS could now be trialed in Parkinsonism.

Controlling Parkinson&#039;s Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) is effective for Parkinson&#8217;s disease, improving symptoms and reducing power consumption compared to conventional deep brain stimulation (cDBS). In aDBS we track a local field potential biomarker (beta oscillatory amplitude) in real time and use this to control the timing of stimulation.

Adaptif Derin Beyin Stimülasyonu İle Parkinson Hastalığı kontrol

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time ...

Developing Neuroimaging Phenotypes of the Default Mode Network in PTSD: Integrating the Resting State, Working Memory, and Structural Connectivity

Complementary structural and functional neuroimaging techniques used to examine the Default Mode Network (DMN) could potentially improve assessments of psychiatric illness severity and provide added validity to the clinical diagnostic process. Recent neuroimaging research suggests that DMN processes may be disrupted in a number of stress-related psychiatric illnesses, such as posttraumatic stress disorder (PTSD).
Although specific DMN functions remain under investigation, it is generally thought to be involved in introspection and self-processing. In healthy individuals it exhibits greatest activity during periods of rest, with less activity, observed as deactivation, during cognitive tasks, e.g., working memory. This network consists of the medial prefrontal cortex, posterior cingulate cortex/precuneus, lateral parietal cortices and medial temporal regions.
Multiple functional and structural imaging approaches have been developed to study the DMN. These have unprecedented potential to further the understanding of the function and dysfunction of this network. Functional approaches, such as the evaluation of resting state connectivity and task-induced deactivation, have excellent potential to identify targeted neurocognitive and neuroaffective (functional) diagnostic markers and may indicate illness severity and prognosis with increased accuracy or specificity. Structural approaches, such as evaluation of morphometry and connectivity, may provide unique markers of etiology and long-term outcomes. Combined, functional and structural methods provide strong multimodal, complementary and synergistic approaches to develop valid DMN-based imaging phenotypes in stress-related psychiatric conditions. This protocol aims to integrate these methods to investigate DMN structure and function in PTSD, relating findings to illness severity and relevant clinical factors.

This protocol describes the complementary neuroimaging techniques of resting state structural connectivity, task-induced deactivation, and structural connectivity analyses to examine the default network in post-traumatic stress disorder. The use of synergistic methods could potentially lead to improved diagnostics and assessments of severity, outcome, and other relevant clinical factors.

TSSB&#39;de Varsayılan Mod Ağı&#39;nın Neuroimaging fenotipleri Geliştirilmesi: Dinlenme Devlet, Çalışma Bellek ve Yapısal Bağlantı Entegrasyonu

Complementary structural and functional neuroimaging techniques used to examine the Default Mode Network (DMN) could potentially improve assessments of ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Için Polikistik Böbrek Hastalığında Küçük Kemirgen modelleri Ultra yüksek Saha MRI Kullanımı<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotiplendirme ve İlaç İzleme

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...