Mitokondriyal metabolizma, T hücresi dayanıklılığının ve hafızasının önemli bir düzenleyicisidir. Bu nedenle mitokondriyal solunumun ölçülmesi, T hücrelerinin özellikleri hakkında önemli bilgiler verir. Denizatı makinesi, mitokondriyal solunumun çeşitli elementlerini, gerçek zamanlı olarak, canlı insan birincil T lenfositlerinde, herhangi bir etiketlemeye gerek kalmadan ölçebilir.
Bu yöntem, kanser immünoterapi başarısının önemli belirleyicileri olan T hücresi uygunluğunu ve hafıza potansiyelini izlemek için çok uygundur. Başlamak için, CD3 / CD28 boncuklarını, milyon hücre başına 12.5 mikrolitre boncuğu bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak ve tüpteki boncukların 12.5 mikrolitresi başına 12.5 mikrolitre PBS ekleyerek yıkayın. Ardından, mikrosantrifüj tüpünü bir dakika boyunca uygun bir mıknatıs üzerine yerleştirin, tamponu atın ve boncukları orijinal T hücresi ortamı hacminde yeniden askıya alın.
Daha sonra, bir ila iki boncuk-hücre oranında milyon hücre başına 12.5 mikrolitre boncuk ekleyin ve hücreleri her birinde yaklaşık beş milyon hücre bulunan iki koşula bölün. Daha sonra, her koşula doğru miktarda sitokin ekleyin ve hücreleri çok kuyucuklu plakalara aktarın. Hücreleri üç gün boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Üç günlük inkübasyondan sonra, sitokinlerin iki katı konsantrasyonda taze T hücresi ortamı hazırlayın. Her bir kuyucuktan hacmin yarısını yeni bir kuyuya aktararak hücreleri yeniden askıya alın ve bölün. Ardından, her bir oyuğa aynı miktarda taze hazırlanmış T hücresi ortamı ekleyin.
Hücre dışı akı testi için, sodyum bikarbonat, Cell-Tak ve sodyum hidroksit içeren kaplama çözeltisi hazırlayın. Ardından, taze bir XF hücre kültürü plakası açın ve her bir kuyucuğa taze hazırlanmış kaplama çözeltisinden 12 mikrolitre ekleyin, böylece kaplama çözeltisinin tüm kuyucukların dibinde eşit dağılımını sağlayın. Plakayı oda sıcaklığında kapağı açık olarak 30 dakika boyunca inkübe edin.
Ardından, kalan sıvı çözeltiyi tüm kuyucuklardan atın. Plakayı 200 mikrolitre steril suyla yıkayın ve sıvıyı atın. Daha sonra, plakayı 200 mikrolitre hücre kültürü sınıfı steril PBS ile yıkayın.
Sıvıyı attıktan sonra, plakanın oda sıcaklığında 30 dakika kurumasını bekleyin. XF hücre kültürü plakasındaki T hücrelerini plakalamak için, deney düzeneğine göre uygun XF RPMI ortamını glikoz, piruvat ve glutamin ile karıştırarak 50 mililitre tahlil ortamı hazırlayın. Hazırlanan ortamı karbondioksit düzenlemeli olmayan bir inkübatörde 37 santigrat dereceye ısıtın ve pH'ı 7.4'e ayarlayın.
Hücrelerin ekilmesi ve oligomisin ve FCCP çözeltilerinin hazırlanması için yeterli ortam sağlayın. Ardından, optimizasyon veya tahlil çalışması için kuyu başına artan sayıda hücreye sahip bir plaka düzeni tasarlayın. Arka plan ölçümleri için medya ile doldurulmuş ve medya enjekte edilmiş dört kuyucuk kullanın.
Daha önce hazırlanan T hücrelerini saydıktan sonra, plaka düzenine göre daha önce kaplanmış XF hücre kültürü plakasının her bir kuyucuğuna uygun sayıda hücre pipetin. T hücrelerini kaplanmış yüzeye yapıştırmak için, XF hücre kültürü plakasını santrifüj edin. Ardından, hücreleri 200 mikrolitre tahlil ortamı ile yıkayın.
Medyayı atın ve 180 mikrolitre taze tahlil ortamı ekleyin. Hücrelerin kuyu yüzeyine tutturulmasını ve eşit olarak dağıtılmasını sağladıktan sonra, XF hücre kültürü plakasını 37 santigrat derecede karbondioksit düzenlemeli olmayan ısıtma kabininde 30 dakika boyunca inkübe edin. Optimizasyon çalışması için, tahlil ortamında oligomisin ve FCCP'nin çalışma çözümlerini hazırlayın.
Ardından, oligomisin veya FCCP'nin çalışma çözeltilerini sensör kartuşunun enjeksiyon portlarına yükleyin. Hiçbir enjeksiyon portunun yalnızca hava içermediğinden emin olun. Tüm boş bağlantı noktalarını tahlil ortamıyla doldurun.
Ardından, plakanın kenarlarını masanın üzerine hafifçe vurarak enjeksiyon portlarındaki potansiyel kabarcıkları çıkarın. Tahlil çalışması için, 20 mikromolar antimisin A çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, plaka düzenine göre, sensör kartuşunun A enjeksiyon portuna 20 mikrolitre oligomisin veya FCCP yükleyin ve tüm kuyucukların B enjeksiyon portuna 22 mikrolitre antimisin A ekleyin.
Temsili bir oligomisin optimizasyon çalışmasında, biriken konsantrasyon bir mikromole ulaştığında oksijen tüketim hızındaki veya OCR'deki bir platoya ulaşılır. Bu konsantrasyondan itibaren, OCR daha fazla azalmadı. Uncoupler FCCP'nin artan konsantrasyonları ile tedavi edilen hücreler için, OCR seviyeleri 0.2 mikromolar FCCP'ye kadar artmış ve daha sonra tam ayrılmanın elde edildiğini gösteren bir platoya ulaşmıştır.
Temsili bir hücre konsantrasyonu optimizasyonu çalışmasında, 200.000 hücreli bir çalışma için ilk OCR, 400.000 hücreli bunun yaklaşık yarısıdır. FCCP tedavisinden sonra, maksimum OCR, 200.000 hücre için dakikada 61.6 pikomol ve 400.000 hücre için dakikada 190.4 pikomoldür. Oligomisin tedavisini takiben, 200.000 hücreli OCR tek haneli rakamlara çöker ve 400.000 hücreli koşudakinden daha düşüktür.
Sitokinler interlökin-2 ve interlökin-15'in T hücrelerinin metabolizması üzerindeki etkisinin araştırılması, interlökin-15 kültürlü hücrelerin daha yüksek maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesine sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bazal solunum ve ATP üretimi etkilenmedi. İnsan T hücrelerinde mitokondriyal metabolizmayı incelemek, dayanıklılıkları ve hayatta kalma potansiyelleri hakkında önemli ipuçları verir.
Bu, T hücresi uygunluğu hakkında daha fazla bilgi ile sonuçlanır ve sonuçta kanser immünoterapi yanıt oranlarını iyileştirebilir.
