Bu çalışma Max Planck Topluluğu tarafından finanse edildi.

1. Matrigel kaplı plakalar ve Medya hazırlanması <ol><li> Matrigel kaplı plakalar Matrigel hazırlanması EBS farklılaşan tutturulması için tercih edilen bir alt tabaka olduğu bulunmuştur ve aynı zamanda bu 10 nöronların etkili fazla büyüme teşvik edilmiştir. <ol><li> Buz üzerinde gecede Matrigel Çözülmeye 10 ml. </li><li> Ertesi gün, buz DMEM/F-12 iki ciltlik jöle benzeri Matrigel sulandırmak ve -20 ° C&#39;de dondurularak saklanmalıdır olabilir önceden soğutulmuş 15 ml konik tüpler içinde 1 ml alikotları hazırlamak </li><li> Nöronal farklılaşma için bir tabak biçimi üzerinde karar verin. Örneğin, bir başlangıç ​​noktası olarak, bir 12-kuyu biçiminde farklılaşma ilk turda yapılmasını önermekteyiz. 4 ° C&#39;de ön-serin dört adet 12 oyuklu plakalar Her prediluted Matrigel çözülmüş ve çözünene kadar yukarı ve aşağı pipetleme ardından önceden soğutulmuş DMEM/F-12 9 ml ilave edilerek dondurulmuş Matrigel bir kısım eritilir. </li><li> O zaman, Buz (nihai Matrigel seyreltme: 1:75) üzerinde DMEM/F-12 15 ml içeren 50 ml&#39;lik yeni bir tüp içine içeriği aktarın. Daha sonra, önceden soğutulmuş 12 oyuklu plakalar, her bir kuyucuğa Matrigel seyreltilmiş 0.5 ml eklenir. Parafilm ile plakaları sarın ve gece oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Ertesi gün, 4 ° C&#39;ye plakaları aktarmak Kaplamalı plakalar kullanılmadan önce birkaç hafta saklanabilir. </li></ol></li><li> Medya </li></ol> EB formasyonu orta (bir 96-plaka farklılaşma gerçekleştirmek için gerekli ~ 15 ml - Şekil 2 Tablo 1 ve şemaya bakınız): DMEM/F-12 0.4 ile% alkol (PVA) 1x N2 1x B27 % 0.05 BSA 20 ng / ml FGF2 10 uM Y-27632 1x PenStrepGln Farklılaşma, orta (bir 96-plaka farklılaşma gerçekleştirmek için gerekli ~ 30 ml, tek Matrigel kaplı 12-plaka nöron oluşumunu takip bkz. Tablo 1): DMEM/F-12 1x N2 <br/&gt; 1x B27 % 0.05 BSA 0.5 uM PD0325901 15 uM SB431542 0.5 uM Dorsomorphin 1x PenStrepGln 2. Zorla EB Oluşumu <ol><li> Tercih besleyici serbest koşullarda hPSCs büyütün. Biz Matrigel kaplı 6-kuyucuğu 15 MEF-klimalı ortamda kullanabilirsiniz. Ancak, ev yapımı ya da ticari tanımlanan medya gibi diğer kültür sistemleri de çalışması gerekir. Farklılaşma deney başlangıç ​​zamanda, hPSCs alt birleşik ve aktif büyüyen olmalıdır. </li><li> Mekanik bir stereo mikroskop altında steril plastik pipet kullanarak kendiliğinden ayırt koloniler çıkarın. </li><li> 1X Y-27632 içeren Accutase kullanarak tek hücreler PBS ve özet kullanarak kalan indiferansiye koloniler yıkayın. EB oluşum ve bir orta hematocytometer kullanarak hücre titre belirlemek küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon 2 dakika için 200 x g&#39;de santrifüj ile pelet tek bir hücre. </li><li> Hücrelerin bir kısım ekleml başına 40.000 ve 80.000 hücreler arasında titre sonuçlanması kalan EB formasyonu orta. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, kuyu başına 4.000 ila 8.000 hücreleri sonuçlanan bir 96V-alt plaka kuyu başına 100 ul aktarın. 1 dakika boyunca 400 xg&#39;de bir salıncak-plakası santrifüj Spin 96-plaka kuyu dibinde hücreleri toplamak, ve hücre kültürü inkübatör aktarmak. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi EBS, bir gecede oluşturacaktır. </li></ol> 3. Nöroektodermin İndüksiyon <ol><li> Ertesi gün (0. gün), farklılaşma, orta 2 ml içeren 3,5 cm bakteriyel çanak içine küçük bir hacimde bir stereo mikroskop ve transfer altında 96V plaka EBS toplamak. Yavaşça EBS yıkamak için birkaç saniye için çanak ajitasyon. </li><li> 100 farklılaşma orta ul başına iyi bir ultra-düşük-eki U-alt 96-plaka ekleyin. Stereomikroskopta altında, 96U-kuyulara bulaşık gelen küçük hacimli transferi EBS (biz başına bir EBll). Nöroektodermin oluşumuna izin vermek için 4 gün boyunca hücre kültürü inkübatör içine yerleştirin 96U plakası. </li></ol> 4. Nöron Oluşumu <ol><li> 4. günde, adım 3.1 &#39;deki gibi bir bulaşık hazırlamak ve ayrıca farklılaşması orta (kuyu başına 1 ml) önceden ısıtılmış Matrigel kaplı 12-plaka içinde DMEM/F-12 değiştirin. </li><li> EBS Kaplama <ol><li> 96U plaka EBS toplayın, bu yukarıdaki gibi ve dikkatle tohum yıkayın onları Matrigel kaplı 12-plaka kuyu içine bir (kuyu başına yaklaşık 8 EBS) tek: EBS eşit rahatsız edilmeden sonucudur izin kuyu içinde dağıtılmış olmalıdır önümüzdeki günlerde nöronlar (Şekil 2 &quot;Günde 5&quot; resme bakın). </li><li> Kuvöz içine 12-plaka geri devir işleminden önce, EBS gevşek RT yaklaşık 10 dakika eklemenize izin verir. Daha sonra, hücre kültürü kuluçka makinesi ile 12-kuyucuklu levha dikkatli bir şekilde aktarılır. Nöronlar Sho olarak, bir sonraki 4 gün içinde, bir radyal bir şekilde dışarı kaplama EBS büyüyecekŞekil 2&#39;de wn (&quot;günlük 8&quot; sağdaki resim). </li></ol></li></ol> 5. Monolayers olarak Nöron Oluşumu <ol><li> Noktası 4 adım alternatif olarak), prosedürün 4. günde, farklılaşma, orta 2 ml içeren 3,5 cm bakteriyel yemeğin içine EBS toplamak, sonra sonra içine bir PBS içeren çanak küçük bir hacimde EBS aktarabilir ve Accutase içeren başka bir yemek. </li><li> Farklılaşma orta küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon tek hücreler, 2 dakika için 200 x g&#39;da santrifüj, ile sindirmek ve bir hematocytometer kullanarak hücre titre belirlesin. Farklılaşma, orta (Y-27632 olmadan) kullanarak ml başına 1-2x10 6 hücre için titre ayarlayın. </li><li> Önceden ısıtılmış Matrigel kaplı 12 oyuklu plaka (çukur başına 1 mi) çözündürüldü, ve hücre kültürü kuluçka makinesi için transfer Levha hücreleri. Mono tabakalar olarak Neuron oluşum günde 7-8 (Şekil 3C) arasında gözlenmiştir. Bununla birlikte, belirtilmelidir ki, bu tek tabaka varyantprosedürün tam hücre sağkalım ve en uygun substrat açısından optimize edilmemiştir. </li></ol>

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rosette-type,+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration.">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li><li>Pera, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation+by+BMP-2+and+its+antagonist+noggin.">Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin.</a> J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).</li><li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+early+fate+decisions+in+human+ES+cells+by+distinct+states+of+TGFbeta+pathway+activity.">Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity.</a> Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).</li><li>Greber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signalling+inhibits+neural+induction+in+human+embryonic+stem+cells.">FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells.</a> EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).</li><li>Anderson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+dysautonomia+is+caused+by+mutations+of+the+IKAP+gene.">Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene.</a> Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability.">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25, 929-938 (2007).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6, e18293 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bizim önceden yayınlanmış prosedürü dahil olmak üzere 10 hPSCs, gelen EB oluşumunu gerektirmeyen En farklılaşma protokolleri manuel veya kaçınılmaz EB boyutlarda heterojenite neden agrega gibi hESC enzim destekli hasat dayanmaktadır. Bu durum, bu şekilde üretilen bir orta boyutta, özellikle de sistematik analiz zor hale getirir bazı hücre çizgilerinden ile farklılaşması verim olarak değişkenlik yol açar. Ayrıca, manuel diseksiyon kendisi tarafından ölçeklenebilirlik ödün hangi ...

hPSCs, oluşan embriyo kökenli insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs), onlar vitro 1-2 çeşitli hücre soylarının ortaya çıkmasına neden olabilir pluripotent anlamı vardır. Çok sayıda farklı hücre tipleri bu hücrelerin bilimsel araştırma ve hücre tabanlı tarama yaklaşımlar için değerli araçlar sunmak, ve hücre tabanlı tedavi için ümit vaat fikrini destekleyen güncel hESC elde edilmiştir. Genellikle ilgi 3-6 belirli bir nöron tipi içine nöral progenitörlerinin manuel izolasyon ve sonraki terminal farklılaşma ardından ilk uyaran genel nöral kaderi esas olarak hESC için nöronal farklılaşma protokoller genellikle karmaşık ve zaman alıcıdır. Bazı bağlamda, bu karmaşıklığı erken insan gelişimi, hangi mimik gibi state-of-the-art yönettiği farklılaşma mekanizmalarının aşamalı eğilimi göz önüne alındığında şaşırtıcı ve kaçınılmaz değildirh kendi içinde son derece karmaşık. Diğer yandan, kısmen de uzak tam olarak optimize edilmesini hala farklılaşma protokolleri ile sonuçlanan, altta yatan moleküler süreçleri anlama eksikliği bizim yansıtıyor olabilir. Nöroektodermin Pera, et al farklılaşmamış hPSCs dönüşüm ile ilgili olarak. BMP / SMAD1/5/8 sinyalizasyon bastırılması hESC 7 nöral indüksiyonu arttırdığını buldu. Ayrıca, Smad2 / 3 sinyal inaktivasyonu nöroektodermin oluşumunu teşvik etmek için 8 gösterilmiştir. Buna göre, bu iki yolun kombine inaktivasyonu hPSCs 4,9 arasında daha verimli sinir indüksiyonuna yol açma eğilimindedir. Daha yakın zamanlarda, biz üçüncü bir sinyal yolağı, FGF / ERK, hESC içinde nöroektodermal taahhüdü ilk adımları güçlü bir baskılayıcı olarak hizmet verdiğini göstermiştir. Tersine, tüm bu üç yollarının eş zamanlı baskı ile nöroektodermin içine hESC yakın homojen dönüşüm yol10 sadece dört gün içinde. Akabinde, fonksiyonel nöronlar içine yüksek verimli terminal farklılaşma sekiz gün içinde gözlenmiştir. Elde nöronlar kısmen onların hızlı derivasyon 10 açıklayabilir periferik sinir sistemi, duyu nöronlar olması olasılığı vardı. Duyusal nöron bakım Kusur gibi ailesel disotonomi 11 gibi bazı insan hastalıkları nedeni kabul edilir. Bu gibi başka fonksiyonel karakterizasyonu için hiPSC teknolojisi 12 dayalı hastalıklar, nöron de herhangi bir özel tür istenmediğinde uygulamalı amaçlı olarak modellenmesi için, bu işlem yararlı bir türev olarak mevcut olabilir. Ancak, farklılaşma biz aslında hESC koloniler 10 kümeleri gelen embriyonik organları dahil oluşumu (EBS) istihdam stratejisi ve bu EB boyutları ile ilgili heterojenlik oldukça derecesi sonuçlandı, ve ayrıca bazı ce nöron oluşumunu verimliliğini tehlikeye çıktıll hatları. Ayrıca, EB boyutlarda heterojenliği nedeniyle, sistematik nöron oluşumu sırasında ve sonrasında ek büyüme faktörleri veya küçük moleküllerin etkilerini test etme olanağı biraz şaşırmış göründü. Bu yazıda, aynı zamanda diğer bağlamlarda 13&#39;te gösterilen, son derece boyutu-kontrollü bir şekilde EBS oluşturmak için bir orta throughput uyumlu, zorla kümeleme tabanlı tekniği bizim önceki yordamı uyarlanmıştır. Daha sonra, süspansiyon EBS olarak nöroektodermin oluşumunu başlatmak üzere, 96-oyuklu plakalar V-şekilli U şeklinde kuyuları ultra-düşük bağlanma plakaları 96-aktarılmıştır oluşturulur. Dört gün sonra, EBS yüksek verim ve homojenliği de ölümcül diferansiye nöronların doğuran üzerinden kaplanmış olabilir. Alternatif olarak, gün-4 EBS tek hücre halinde ayrılmış ve insan nöronların düşük yoğunluklu mono tabakaları ile sonuçlanan, örneğin dışarı kaplama. Koherent sonuçlar şimdiye kadar iki bağımsız de elde edilmiştirrived hESC hatları, HuES6 ve NCL3. Bir ön koşul olarak, başarılı EB oluşum birlikte HESC hayatta kalma 13-14 teşvik etmek için bilinen KAYA inhibitörü Y-27632 ile birlikte, bir sentetik polimer, polivinil alkol (PVA) kullanımı üzerinde sıkı bir şekilde bağlı olduğu anlaşılmıştır. Sonuç olarak, EBS homojenliği 96-V-plakaları içinde oluşan büyük ölçüde rasgele bölme tekniklerine dayalı kütle kültürler olarak EBS oluşumu göre geliştirilmiştir. Bu sistem, bu nedenle yapışkan koşullar altında yüksek kontrollü nöron oluşumu, ardından süspansiyon kültürü içinde nöroektodermin oluşumu için önemli ölçüde geliştirilmiş bir platform sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Matrigel HC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 354263 </td><td> Kullanımı ile ilgili ayrıntılar için metne bakınız </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 21331-020 </td><td></td></tr><tr><td> Poli (vinil alkol) </td><td> Sigma </td><td> 363170 </td><td> Ultrasonik su banyosunda kullanılarak DMEM/F-12 yılında% 0.4 Erime / aşırı ısınmasını önlemek / 4 ° C&#39;de birkaç hafta boyunca muhafaza edilebilir </td></tr><tr><td> N2 Supplement </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 17502-048 </td><td> 100X, dondurulmuş alikotları olarak depolamak </td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 12587-010 </td><td> Dondurulmuş alikotları olarak 50X, mağaza </td></tr><tr><td> Bovine Albumin Serum </td><td> Sigma </td><td> A1595 </td><td> % 10 = 500X, dondurulmuş alikotları olarak depoladığınız </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin L-Glutamine </td><td> PAA </td><td> P11-013 </td><td> Veya eşdeğeri </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> Peprotech </td><td> 100-18B </td><td> Dondurulmuş alikotları olarak% 0,1 10 mg / ml &#39;de çözülür BSA / PBS = 1000X, mağaza </td></tr><tr><td> KAYA inhibitörü Y-27632 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-129 </td><td> Dondurulmuş alikotları olarak DMSO = 1000X, mağaza 10 mM eritilir </td></tr><tr><td> PBS </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Veya eşdeğeri </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> 96-V-alt plakalar </td><td> Nunc </td><td> 277143 </td><td></td></tr><tr><td> PD0325901 </td><td> Akson Medchem </td><td> Akson 1408 </td><td> Dondurulmuş alikotları olarak DMSO = 1000X, mağaza 0.5 mM eritilir </td></tr><tr><td> SB431542 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-163 </td><td> dondurulmuş alikotları olarak DMSO = 1000X, mağaza 15 mM çözülür </td></tr><tr><td> Dorsomorphin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-200689 </td><td> dondurulmuş alikotları olarak DMSO = 1000X, mağaza 0.5 mM çözülür </td></tr><tr><td> 96-U-bottom ultra-düşük eki plakaları </td><td> Corning </td><td> 7007 </td><td></td></tr><tr><td> beta III tubulin antikoru (fare) </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td> 1:1000 &#39;yi kullanabilirsiniz </td></tr><tr><td> beta III tubulin antikoru (tavşan) </td><td> Covance </td><td> SORUN-435P </td><td> 1:2000 &#39;yi kullanabilirsiniz </td></tr><tr><td> BRN3A (POU4F1) antikoru </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8429 </td><td> 1:500 de kullanabilirsiniz </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. &lt;/ Strong&gt; Özel reaktifleri ve ekipmanlar. </td></tr></tbody></table>

rapid and efficient generation of neurons from human pluripotent stem cells in a multititre plate format

Insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) gelen nöronların nesil için mevcut protokoller genellikle önceden terminal farklılaşma için nöral prekürsör hücrelerinin izolasyonu ve genişleme içeren çok adımlı prosedürler vardır bunda sıkıcı vardır. Bu zaman alıcı bir yaklaşım ile karşılaştırıldığında, son zamanlarda üç sinyalleme yolları, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF ve / ERK, kombine inhibisyonu fonksiyonel nöron içine hemen fark ardından hPSCs gelen nöroektodermin hızlı bir indüksiyon teşvik olduğunu bulduk. Burada, biz daha da tekrarlanabilirlik geliştirmek ve orta hacimli uygulamalar ile uyumlu hale getirmek için, bir roman multititre plaka formatı bizim prosedürü adapte etmişlerdir. Yapışık koşullar altında nöronlara geri farklılaşma bir başka dört gün ardından yüzer küreler (embriyoid gövdeler), oluşum içinde nöroektodermin dört gün kapsamaktadır. Bu protokol ile elde Hücrelerin çoğu bipolar duyusal nöronlar görünmektedir. Ayrıca,prosedürü, yüksek verimli olup özellikle uzman beceri gerektirmez, ve maliyet-etkin küçük moleküllerin basit bir kimyasal yapısı orta dayanmaktadır. Bu özellikleri sayesinde, işlem daha fazla fonksiyonel inceleme için yararlı bir platform olarak hem de hücre-bazlı tarama insan duyu nöronlarının veya herhangi bir tür nöronlar gerektiren yaklaşımlar için de kullanılabilir.

Bir önceki raporda, pek çok diğerleri ile uyumlu, hPSCs gelen EBS düşük eki yemekler 10 içine hPSCs rutin bölüştürülmesi sırasında agrega replating basitçe oluşturulmuş olabilir. Çıkan EB boyutları (Şekil 1C, üst) geniş bir dağılım Bu genellikle sonuçları. Bu kaynaklanan bir başka sorun süspansiyon muhafaza EBS EB boyutlarda da yüksek heterojenite giden, birbirleri ile agrega eğiliminde olmasıdır. Bu sorunları aşmak için, biz bu nedenle multititre plakalar...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format at JoVE.com

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

rapid-efficient-generation-neurons-from-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

43.5K Görüntüleme.  Max Planck Institute for Molecular Biomedicine. Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.

Video: Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Biyoloji

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Etkin Sporlanma<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; 96 çukurlu Formatında

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...