Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü, CA131967 bir hibe ile desteklenmiştir.

1. BrdU Ortaklığın (Terminal Etiketleme) <ol><li> Önceki BrdU ilavesi ile 150 mm doku kültürü çanağı 24 saat içinde yaklaşık% 70 birleştiği yere Plaka hücreleri. </li><li> Hasattan önce uygun zaman noktalarında 20 ug / ml BrdU (Sigma) içeren tam kültür ortamı, taze ortam ile değiştirin. Zaman hücrelerin BrdU uzunluğu tipik olarak G2 fazında saat (Şekil 1) 2 ile 5 arasında sürer, hücre tipi ve türler ile değişecektir ile ortam içinde kültürlenmiştir. </li></ol> 2. Monolayer Hücre Kültürleri Kromozom Hasat <ol><li> Plaka kültür ortamı çıkarın ve 15 ml konik santrifüj tüpüne 10 ml toplamak. Kalan ortamı atın. </li><li> 10 ml Versine [veya HBSS (Sigma)] ile bir kez yıkayın hücrelerini. </li><li> Plakasına Versine (ya da HBSS) içinde 5 ml% 0.25 tripsin ekleyin. Hücreler plaka ayrılmış kadar oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Adım 2.1, ortam 10 ml&#39;lik tüp tripsinize hücre süspansiyonu ekleyin. &lt;/ Li&gt; <li> Pelet hücreler 10 dakika için 400 x g&#39;da santrifüj yapılır. 0.5 ml ortam artı hücre peleti bırakarak, süpernatan aspire. </li><li> Pasteur pipeti ile pipetleme tarafından iyice hücreler süspanse edin. </li><li> Hipotonik çözelti 3 damla ekleme (0.075 M KCl (Sigma), 37 ° C&#39;a ısıtılmış); bir Pasteur pipeti ile hücre süspansiyonu ilave edilir. 0.5 ml hipotonik solüsyonu eklenir ve bir Pasteur pipeti ile tekrar karıştırın. 5 ml hipotonik çözeltinin hacmi getirin ve tekrar karıştırın. Hücre tipine bağlı olarak 20-45 dakika, 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. 0.5 ml ortam artı hücre peleti bırakarak, süpernatan aspire. </li><li> Tüpü yavaşça getirerek hücre pelet yeniden süspanse edin. Ozmotik şişmiş hücreleri bu noktada kırılgan olacak, bu nedenle bakım sitoplazmik membran bozmayacak şekilde alınmalıdır. </li><li> Hafifçe Pasteur pipett ile pipetleme karışımı;: Carnoy en fiksatif (Metanol 01:03 Buzul Asetik Asit) 3 damla ekleyine. Yavaşça Pasteur pipeti ile pipetleme 0.5 ml fiksatif ekleyin ve karıştırın. Sabitleştirici hacmi 5 ml getirin ve yavaşça Pasteur pipeti ile pipetleme tarafından tekrar karıştırınız. Sabit hücreleri birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de karanlıkta saklanabilir. </li><li> Santrifüj ve adım 2.8 olarak aspire. </li><li> Taze fiksatif içinde hücre pelletini tekrar; pelet ve eklenti ~ 10x Carnoy en fiksatif hacminin hacminin hesaplanabilmesi. </li><li> Hücre süspansiyonu ıslak, buz mikroskop lamı üzerine açılan akıllıca ekleyin; bir ~ 45 ° açıyla tutun ve slayt slayt yüzeyi üzerinde akmaya hücre süspansiyonu sağlar. Kağıt havlu üzerinde düz kaydırak ve sel fiksatif ile slayt Lay ve kurumaya bırakın. Ters bir mikroskop kullanılarak mitotik yayılır varlığı için slaytlar edin. </li></ol> 3. RNase Tedavisi ve Etanol Dehidrasyon <ol><li> 10 mikrogram / ​​her slayt için 2x SSC ml RNaz A (Sigma) Yeri 200 ul; 37 &amp; de inkübeg; C, 1 saat boyunca. </li><li> Yıkama 2x SSC, 3 dakika her biri için, oda sıcaklığında, pH 7.0 ile 3 kez kayar. </li><li> 3 dakika her biri için ve oda sıcaklığında bir EtOH (Sigma) serisi (% 70,% 90 ve% 100) slaytlar kurutmak. </li><li> Hava oda sıcaklığında slaytları kurulayın. </li></ol> 4. In situ Hibridizasyon BAC Artı Kromozom-spesifik Sentromer Numaralama Sondası (CEP) veya Tüm Kromozom Boyalar için prob Kokteyller hazırlanması <ol><li> BAC / CEP eşzamanlı hibridizasyon için, ön-hibridizasyon için iki ayrı probu kokteyller hazırlamak. Bu daha az ve daha büyük bir arka plan sinyal yoğunlukları farklı sıkıntıları sonuçlar altında ayrı ayrı BAC ve CEP problar ön-melezleştirici olduğunu bulduk. Ayrıca bireysel Fosmids BAC klonları yerine de kullanılabilir olduğunu bulduk. Aşağıda açıklanan kokteyl formülasyon için tek bir slayt birimleri temsil etmektedir. Aynı problar kullanılarak birden çok slayt işleme, basitçe hacimleri appropr artırmak<html> Vakit. * BAC DNA prob kokteyli: 11.5 ul hibridizasyon tamponu (% 50 Formamid (Sigma) / 2 x SSC / dekstran sülfat (Sigma)) 2 ul dH 2 O DH 2 O 2.5 ul BAC/Cot1 DNA (protokol etiketleme için aşağıya bakınız) 15 ul toplam hacmi * CEP prob kokteyli: 7 ul CEP hibridizasyon tamponu (% 65 Formamide/2x SSC / Dekstran Sülfat) 2 ul dH 2 O 1 ul CEP/Cot1 DNA (Spektrum Orange/Cy3/Texas Kırmızı ile prelabeled satın) 10 ul toplam hacmi * 3:2 oranı 25 ul / slayt ve mix prob kokteyller CEP prob ile karıştırın BAC prob denatüre ve ön hibridizasyon (adım 5.1) sonra. VEYA </li><li> Tablet 20 ul / tüp içerisine Tüm Kromozom Boya prob (Cy3/Texas Kırmızı) arasında slayt. Denatürasyon ve ön hibridizasyon adıma geçin. </li></ol>&quot;&gt; 5. Slayt ve Probe denatürasyonu ve in situ Hibridizasyon <ol><li> 75 doğasını sonda kokteyl (ler) ° C de 10 dakika. Cot1 tekrarlayan DNA sekansları ile melezleşme ve kromozomların metafaz takiben melezleştirme önlemek için izin vermek için 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de ön-melezleşir. </li><li> 3 dakika boyunca 72% 70 Formamide/2x SSC, pH 7.0 ° C Coplin kavanoz içinde denatüre kayar. </li><li> Hemen 3 dakika her biri için 4 de Coplin kavanozlara bir EtOH serisi (% 70,% 90 ve% 100) ° C slaytlar kurutmak. </li><li> Slaytları oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> 45 Pre-sıcak slaytlar ° C probu ön hybridzation (adım 5.1) son 10 dakika süreyle sıcak slayt üzerinde. Gerekirse ön melezleştirilmiş prob kokteyl karıştırın ve her slayt için 25 ul ekleyin; hafifçe kauçuk çimento ile tüm kenarları boyunca her slayt ve mühür üzerine bir lamel yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için nemlendirilmiş bir oda içinde 37 ° C de bir gece boyunca inkübe edin. </li></ol><ol><li> 3 dk için her 38-40 ° C &#39;de en az% 50 formamide/2x SSC, pH 7.0 içinde 3 kez Coplin kavanoz içinde slaytlar yıkayın. Yıkama sıcaklık probları arasında değişebilir. Yüksek arkaplan hibridizasyon varsa size yıkama sıcaklığını artırabilir. Sinyal soluk ve hiçbir arka plan varsa Tersine, o zaman bu yıkama sıcaklığını düşürebilir. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında PN tampon içinde 1 saat slaytlar 3 dakika ve BrdU algılama adıma geçin. </li></ol> 7. BrdU Algılama <ol><li> Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika (200 ul / dia) için PNM tampon ile blok kayar. </li><li> Bir kağıt havlu üzerine kenarında açarak slaytlar boşaltın. 37 30 dakika için PNM tampon içinde anti-BrdU-FITC (50 ug / ml Roche veya Millipore) 100 ul ekle ° C. </li><li> 3 dakika her biri için oda sıcaklığında PN tampon slaytlar 3 kez yıka. </li><li> Boşaltmaküzerine aşırı PN tampon bir kağıt havlu üzerine kenarında açarak birer birer kayar. 20 ul DAPI / antifade montaj çözüm (Invitrogen) ekleyin. Bir kağıt havlu ile slayt örtün ve hava kabarcıklarını ve fazla montaj çözümü zorlamak için lamel üzerine bastırın. Görüntü analizi ile devam edin. </li></ol> 8. Görüntü yakalama ve BrdU Ortaklığın nicel <ol><li> Görüntüleri Olympus BX61 Floresan Mikroskop ve Olympus CCD Kamera, 100x objektif, otomatik filtre tekerleği ve Cytovision yazılım (Uygulamalı Imaging) ile yakalanır. BrdU bir FITC filtresi kullanılarak yakalanır; kromozom boyalar (Texas Red, Metasystems veya Cytocell), BAC nin (Cy3) ve CEP (Vysis Spektrum Turuncu) probları Texas Red veya Cy3 filtre kullanarak yakalanır; DAPI bir DAPI Filtresi (bkz. yakalanır Şekiller 2 ve 3). </li><li> Ilgi Bireysel kromozomları BAC / CEP veya kromozom özel boya problar (Şekil 2B ve 3B) ile tanımlanır. KullanılmasıCytovision yazılım, ilgi her kromozom bir bütün olarak metafaz yayılım &quot;cut-out&quot;, bir çizgi uzun kol (Şekil 2C ve 3C) kısa kolundan kromozom uzunluğu boyunca çekilir. Cytovision yazılım her bir kromozom uzunluğu boyunca piksel yoğunluk profili ölçmek için kullanılır. Cytovision yazılım piksel tarafından işgal edilen alan hesaplar ve her bir izole kromozom üzerinde BrdU ya da DAPI sinyalleri tarafından temsil edilen piksel şiddeti miktarını belirler. Her bir kromozom tarafından temsil edilen ortalama piksel şiddeti sonra, piksel (Tablo 1 ve Şekil 4) toplam sayısını elde etmek için bu piksel işgal ettiği alan ile çarpılır. Buna ek olarak, bu protokol kromozom son kopyalayan bölgelerin görüntülenmesi için olanak sağlar. Buna göre, BrdU şirketleşme bantlı deseni kromozomların aktif kopyalayan bölgelerin tespiti için izin verir ve Chromos arasında çoğaltma zamanlama farklılıklarıome çiftleri bu bantlama modeli (Şekil 2 ve 3) farklılıklar olduğu görülmektedir. Son olarak, bağlayıcı desenler bu farklılıklar homolog kromozomlar veya kromozom kollarının 4 arasındaki çoğaltma zamanlama farkı bir tahmini için izin veren her kromozom 6,7, bilinen çoğaltma zamanlaması haritalar mukayese edilebilir. Örneğin, iki kromozom 6 3A kromozom 6 4 normal çoğaltma zamanlama kıyasla&gt; 2 saat arasında model bantlama bir fark görüntü Şekil var. Buna ek olarak, burada tarif edilen bir benzer bir prosedür başarılı bir şekilde inaktif ve aktif X kromozomuna 8,9 arasında uyumsuz çoğaltma zamanlama incelenmesi için kullanılmıştır. Aktif ve inaktif X kromozomu X kromozomundan boyalar kullanılarak tespit edilmiştir. Görüntü Quips mFISH yazılımı (Vysis) ve X kromozomuna tarafından işgal edilen piksel sayısı ve floresan la tarafından işgal edilen piksel sayısı kullanılarak elde edildiBeled BrdU sonra NIH Image (hesaplanmıştır <a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html</a> ). </li></ol> 9. Floresan Etiketleme için BAC DNA Nick yaptı (Vysis) <ol><li> Bir mikrofuge&#39;de tüp soğutulmuş için aşağıdaki prob karışımı ekleyin: DH 2 O 70 ul (4 mg DNA) 10 ul .2 mM dUTP-Turuncu veya Yeşil 20 ul .1 mM dTTP 20 ul 10x Nick yaptı Tampon 40 ul NT dNTP nin (eksi dTTP) 40 ul nick yaptı enzim 200 ul toplam hacim @ 16 inkübe ° CO / N. 10 dk için 70 ısıtma ile reaksiyon ° C durdurun. 5 dakika buz üzerinde soğutun. </li><li> Sonda karışımı aşağıdaki ekleyerek etanol ile DNA çökelti: 200 ul prob çözümü 48 ul 3 M NaOAc 160 ul Cot1DNA (.25 mg / ul) 1.200 ul% 100 EtOH </li><li> O / N 10 dk için -80 ° C&#39;de saklayın </li><li> I Spinn 20 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de soğuk. EtOH kapalı Durusu. % 70 EtOH ile 1 kez yıkayın. Daha önce olduğu gibi döndürün. EtOH kapalı Durusu. Hava sadece EtOH cekene kadar kurutun. 100 ng / BAC DNA ul&#39;lik nihai konsantrasyon için 40 ul dH 2 O de yeniden süspanse edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Kromozom yayılır hazırlanması burada açıklanan başarılı çoğaltma-zamanlama testi için kritik bir adımdır. Hipotonik tedavi öncesinde colcemid ön adım dahil sıklığı ve mitotik hücrelerin yayılmasını yardımcı olabilir. Bu tipik olarak hasat öncesi 1-3 saat için colcemdi hücrelerin ortaya çıkarmak, ve 10 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda colcemid kullanımı. Ancak, ön arıtma adımı colcemid dahil G2 uzunluğu değiştirebilir ve dolayısıyla kromozom 3&#39;ün yoğun...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> Roche Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 mikrogram / ul </td></tr><tr><td> Nick Çeviri Takımı </td><td> Abbott Moleküler (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrum Orange dUTP </td><td> Abbott Moleküler (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> Abbott Moleküler (Vysis) </td><td> Değişir </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP hibridizasyon tamponu </td><td> Abbott Moleküler (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP hibridizasyon tamponu </td><td> Abbott Moleküler (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> Kromozom paiNTS </td><td> MetaSystems Grubu </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> Olympus BX61 Floresan Mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop görüntüleme yazılımı sistemi </td><td> Uygulamalı Görüntüleme </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> Dijital Kamera </td><td> Olimpos </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> YERİNDE HİBRİTLEŞMEYLE TARİFLER IN Formamid Çözümleri 70% Formamide/2x SSC 35 ml Formamid * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 HCI ile pH 7.0 &#39;a (Sigma) * Bu, -20 ° C&#39;de depolanmış olan o formamid kullanılması önemlidir Uzun süreli depolama oda sıcaklığında formik asit ile pH w üretecektirhasta çok düşük. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamid (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O HCI ile pH 7.0 &#39;a (Sigma) 20x SSC, 4 L&#39; 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na Sitrat (Sigma) hacmi dH 2 O PN Tamponu [0,1 M NaP0 4% 0,1 NP_40 (Sigma)] 0.1 M çözelti sodyum fosfat her (Filtre sterilize ve 500 ml alikotları saklamak) olun. 0.1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13.8 g NaH 2 P0 4 (Sigma): hacmi dH 2 O 0.1 M NaH 2 P0 4 1 M </strong&gt; 14.2 g NaH 2 P0 4 (Sigma) hacmi dH 2 O. PN:, 1 M NaH 2 P0 4 ile 2 HP0 4 pH 8.0 0.1 M Na pH ayarlama. Filtre sterilize ve NP-40 1 ml ekleyin. PNM 50 ml 1.25 gram yağsız kuru süt (Sigma) 25 ml PN tamponu (yukarıda tarifi) Sürekli karıştırarak, yaklaşık 15-20 dakika boyunca karıştırılır. 10 dakika için 400 x g&#39;da 2 kez Spin. Süpernatant kullanın ve çöktürülmüş süt proteinleri rahatsız değil emin olun. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

Memeli DNA replikasyonu zamansal bir çoğaltma programı sonrasında, S fazında farklı zamanlarda kromozomlar boyunca birçok bölgeden başlatır. Çoğaltma zamanlaması özellikleri epigenetik değişikliklere duyarlı doku-spesifik ve gelişimsel ipuçları tarafından düzenlenen dinamik bir süreç olduğu düşünülmektedir. Ancak, nerede ve DNA replikasyonu kromozomlar boyunca başlattığında düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Homolog kromozomlar genellikle ancak bu kuralın önemli istisnalar vardır, eşzamanlı çoğaltırlar. Örneğin, dişi memeli hücrelerinde iki X kromozomu X inaktivasyonu 1 olarak bilinen bir süreç yoluyla geç kopyalayan olur. 2-3 saat olarak tahmin çoğaltma zamanlaması, bu gecikme ile birlikte, genlerin çoğunluğu transkripsiyonel bir X kromozomu üzerinde susturdu olur. Buna ek olarak, X inaktivasyonu merkezi olarak bilinen bir ayrık cis-hareket eden odağı, th dahil olmak üzere, bu X inaktivasyonu işlem düzenlertüm inaktif X kromozomu üzerinde gecikmiş çoğaltma zamanlaması e indüksiyonu. Buna ek olarak, kanser hücreleri ve hücreler bulunan bazı kromozom tüm kromozom 2,3 etkilemektedir&gt; 3 saat bunun çoğaltma zamanlaması önemli bir gecikme görüntülemek iyonizan radyasyona maruz. Bizim laboratuvar son çalışmaları ayrık olduğunu bozulması cis-oyunculuk tüm kromozom 4 etkileyen bir çok geç kopyalayan fenotipe otozomal lokus sonucu gösterir. Ek &#39;kromozom mühendislik&#39; çalışmaları tüm memeli kromozomları bireyin kromozom Uygun çoğaltma zamanlaması 5 kontrol ayrık cis-etkili lokus içeren düşündüren, bu anormal çoğaltma zamanlaması fenotipe birçok farklı kromozom sonucu etkileyen bazı kromozom göstermektedir. Burada, floresan in situ hibridizasyon ile kombine kromozom çoğaltma zamanlaması kantitatif analizi için bir yöntem mevcut. Buyöntem, aynı hücre içinde Homolog kromozomlar arasındaki çoğaltma zamanlaması doğrudan bir karşılaştırma sağlar, ve 6 uyarlanmıştır. Buna ek olarak, bu yöntem tam kromozom replikasyonu zamanlama etkileyen değişiklikler ile ilişkili kromozomal düzenlenmesinde çok kesin tanımlanması için olanak sağlar. Bu yöntem son yıllarda geliştirilen yüksek kapasiteli mikro-dizi üzerinde veya yeniden düzenlenmiş ve kromozomlar un düzenlenmeyecek üzerinde sunmaktan homolog allelleri arasındaki farkı ayırt edemez protokolleri sıralama avantajları vardır. Burada açıklanan yöntem tek hücreler değerlendirir Buna ek olarak, bu bir nüfus içinde hücrelerin sadece küçük bir bölümü içinde mevcut olan kromozom üzerinde çevrilme kromozom replikasyonu zamanlama değişiklikleri tespit eder.

Insan kromozom 6 için çoğaltma zamanlama analizinin bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. 6q16.1 bulunan ASAR6 gen 4, bir silme içeren hücreler, 5 saat boyunca BrdU maruz mitotik hücre için hasat edilmiş ve bir kromozom 6 boya probu (Vysis) ile FISH ve BrdU eklenmesi için işleme tabi tutulmuştur. İki 6&#39;ın arasındaki BrdU bantlama modeli önemli bir fark olduğunu unutmayın, hangi öncesinde kromozom 6&#39;nın [bkz 4 6. kromozomun desen bantlama çoğal...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi kullanır<em&gt; In situ</em&gt; Memeli kromozom çoğaltma zamanlamasını değerlendirmek için hibridizasyon (FISH). Bu teknik aynı hücre içinde yeniden ve un-yeniden düzenlenmiş kromozomun doğrudan karşılaştırma olanağını sağlamaktadır.

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

chromosome-replicating-timing-combined-with-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

13.9K Görüntüleme.  Oregon Health & Science University. Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi kullanır In situ Memeli kromozom çoğaltma zamanlamasını değerlendirmek için hibridizasyon (FISH). Bu teknik aynı hücre içinde yeniden ve un-yeniden düzenlenmiş kromozomun doğrudan karşılaştırma olanağını sağlamaktadır.

Video: Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...