Name: simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes at JoVE.com

We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. Doku Diseksiyon ve Fiksasyon (60 dk) <ol><li> Drosophila beyinleri için, 1 x PBS (fosfat tamponlu tuzlu su), bir damla 3. instar larvaları yerleştirin. Aktif kalabalık olmayan flakon ya da şişe tarama olan büyük 3. instar larvaları seçin. <ol><li> Ağız kanca tutmak ve vücudun (Şekil 1A, B) uzunluğu aşağı 2/3 kapmak için başka bir cımbız çifti kapmak için bir ultra ince cımbız çifti kullanın. Larva sindirim sistemi beyin, ventral ganglionlar, tükürük bezleri ve bir kısmını ortaya çıkarmak için ağız kanca yavaşça çekin. Beyin ve ventral ganglionlar ayırmak için cımbız kullanarak (Şekil 1A, B), bir plastik Petri plakası üzerinde 1x PBT (Tween ile fosfat tamponlu tuzlu su) bir damlacık Diğer doku ve yerden. </li></ol></li><li> Nasonia testis disseksiyonlarıyla için, erkek 3 günlük eski pupa (kırmızı gözlü sarı organları) seçin. Erkek Nasonia f göreceli küçük kanat ped uzunlukları varpupa aşamada (Şekil 1C) sırasında emales. <ol><li> Bir cımbız çifti ve diğer cımbız çifti kullanarak göğüs bölgesinde yakın karın üstündeki pupa tutun, karın çok uzak ucu kapmak ve gözyaşı bırak şeklinde testisler çekin (onlar yağ ile çevrili olacak nazikçe sarsılmış olabilir gövdesi; Şekil 1D). Bir plastik Petri plaka üzerinde 1x PBT bir damlacık uygun Ezici, ve yer önleyecek testis, herhangi bir dış vücut parçaları ayırın. </li></ol></li><li> Her slayt için, dört ya da beş doku örneklerinde (yani., Drosophila larva beyinleri veya Nasonia testisler) toplam teşrih. NOT: Daha fazla beş numune kalabalık çekirdekleri ve kromozomların yol açacaktır. </li><li> İsteğe bağlı olarak, mitotik kromozom euchromatic bölgelerinde kardeş kromozomlardalerde bir ayrılmanın elde edilmesi için bir hipotonik çözelti ile dokuyu tedavi etmek: (5-10% 0.5 sodyum sitrat bir damla 1x PBT&#39;den beyinleri aktarmaken fazla 10) dakika. NOT: Kolşisin (bir mitoz inhibitörü) metafaz 11 de mitoz sayısının artırılması için yararlı olabilir. Olumsuz kromozom çözünürlüğü etkileyebilir çünkü çok büyük sağlıklı larva yayılması ve morfolojisi, kullanılan ve hatta istenmeyen doğruya, kullanımı gereksizdir. </li><li> Temiz Sigmacote ile tedavi edilen kapak kayma yüzeyi üzerine tespit edici çözeltisi (% 45, asetik asit içinde% 2.5 paraformaldehit) bir damlacık (~ 20 ul) yerleştirin. NOT: Kullanım her gün için sabitleştirici çözüm taze olun. % 45 asetik asit içinde 1.8-3.7% paraformaldehid kadar Sabitleme çözeltiler FISH için en iyi sonuçları vermektedir. Immün-FISH için bu protokolü beyinleri veya testis dışındaki dokuları kullanarak, ya da uyarlama farklı fiksatif ile deneme gerekebilir (farklı fiksatif listesi için, 12 bakınız). </li><li> Dikkatle ultra ince cımbız, minimide ile sabitleştirici damlacık içine diseksiyon tampon (1x PBT) her doku örneği aktarmakfiksatif çözüm içine tampon diseksiyon transferini zing. Dengeli bir şekilde tespit edici damlacık içinde birbirinden aralıklı olacak şekilde doku örnekleri yerleştirin. Oda sıcaklığında 4 dakika süreyle tespit sıvısı içerisinde dokuların inkübe edin. </li><li> Dikkatli bir şekilde, doku ve kapak slip üzerinde bir poli-lisin-kaplanmış slayt yüzü koyun. Bu noktada aşağı bastırın ancak bunun yerine kapak kayma slayt alt üzerine yapışır, böylece iki hafifçe temas etmesine izin vermeyin. Kapak kayma üstünde olacak şekilde slayt ters çevirin. </li><li> Filtre kağıdı katlanmış parçası içinde slayt / doku / kapak kayma sandviç. Sabit bir yüzeye, çok sıkıca düz aşağı doğrudan kapak kayma üzerinde pozisyon üzerine başparmak, basın kullanarak. (Bu doku, leke neden olur) kapak kayma kayma yanal önlemek için dikkatli olun. </li><li> Sıvı azot içine slayt / doku / kapak kayma Batmak (Şekil 1E, F cihazı bakınız), ve Azot kaynar durana kadar bekletin (uzun fine). Slayt çıkarın ve hemen (jilet ile sabit doku çizilmesini önlemek) yukarı yönde kapak kayma bir köşesini iterek taze jilet ile kapak kayma koparmak. <ol><li> Kuru buz bloğu slayt / doku / kapak kayma Ön soğutma, kapak önce çatlama slaytlar önlemeye yardımcı olur sıvı azot içinde daldırarak 1-2 dakika kadar slip. </li></ol></li><li> Hemen oda sıcaklığında% 100 etanol ile dolu bir kavanozun içine Coplin doku ile slayt yerleştirin ve (gerekirse bu sefer daha uzun olabilir) en az 5 dakika bekletin. Not: Soğuk% 100 etanol de kullanılabilir. </li><li> Doku ile slayt çıkarın (sabit doku dokunmadan) bir Kimwipe ile aşırı etanol uzak fitil ve 1 saat kuru hava slayt bırakın. <ol><li> 2. adıma veya hafta için hibridizasyon yapmadan önce bile aylar için düşük nem havada veya bir kuruma odasında kuru slaytlar tutmak için doğrudan devam edin. </li></ol></li></ol> Şekil 1: (A) 3 instar Drosophila larva (sağda), ağız kanca kapmak için nereye belirtilen pozisyonlara ile (ile gösterilir *) ve beyinleri incelemek için larva aşağı yol 2/3; (Solda) larva kafa içinde beyin göreli konumunu gösteren, aynı gelişim aşamasında bir larva şematik. (B) beyin ve 3 instar Drosophila larva (sağda) ve bu bir şematik disseke ventral ganglionlar doku (solda). Sarı vücut kırmızı göz aşamasında (C) 3-günlük-eski Nasonia pupa. (D) pupa kapmak için gösteren pozisyonlarda (sağ) 3 günlük Nasonia erkek pupa disseke bir testis çifti Karın posterior (* ile gösterilen) ve vücut üzerinde yarıda; (Solda) şematik tasvir erkek ve dişi oldup pupa; erkek pupa profili geçmiş uzatmak kanatları var kadın, aksine, saggital profili (siyah ok) geçmiş uzatmak değil kanatları ile ayırt edilebilir; Testis çiftinin göreli konumu erkek pupa gösterilmektedir., sıvı azot içinde bir kap içinde slaytlar sokmak için kullanılan ataç-ve (F) yöntemi (E) aparat bir dizge. Birden ataş dizeleri birden çok slayt aynı anda daldırma için kullanılabilir. In situ hibridizasyon 2. (1 gün, 30 dakika, uzun 1 saat-2.5 saat probları-günde 2) <ol><li> 1.1x hibritleme tampon maddesi 20 ul, her bir prob 1 ul (100 ng) ekleyin. Pipet Sonda / sabit kağıdın sathına hibridizasyon tamponu (doku dokunmaktan kaçının). </li><li> Dikkatlice kapak kayma doku üzerinde doğrudan merkezli emin, prob / hibridizasyon tamponu üzerine doğrudan bir kapak kayma yerleştirin. tampon inci geçirmelisinizhava kabarcıkları bırakarak, kapak kayma dış kenarını e. NOT: prosedüre herhangi bir sorun teşkil etmez doku temas etmemesine Küçük kabarcıklar. Dikkatle slayt üzerine geri bırakarak dikkatlice kapak kayma bir köşesini kaldırarak tarafından büyük kabarcıklar çıkarın. </li><li> Bir blok (kapak yukarı kayma), 95 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış yüzey üzerinde kayma / doku / kapak kayma yerleştirin. Işık maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo büyük bir parça ile kaplayın. Sürgü 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: tüpler için delikler ile tipik bir ısı bloğu slayt / doku / kapak kayma yerleştirmek için düz bir yüzey sağlamak için devrildiğinde olabilir. </li><li> Dokunmak sıcak kadar biraz soğumasını icar, slayt çıkarın. Dikkatle altındaki sıvı mühür kapak kayma etrafında gergin Parafilm bir parça sarın. </li><li> Bir nemlilik bölmesi içinde yalıtılmış ve slayt yerleştirin ve 30 ° C&#39;ye ısıtılmış bir inkübatör içine bölmenin. 4 saat gece boyunca için 30 ° C&#39;de inkübe edilir.<ol><li> Altına yerleştirilen nemlendirilmiş Kimwipes veya kağıt havlu ile boş bir ipucu kutusundan nem odası veya kapaklı Tupperware konteyner oluşturun. Not: Tek şeritli DNA oligo probları 45-47 ° C&#39;lik bir teorik bir erime sıcaklığına (Tm) elde etmek için 28-33 baz olarak tasarlanmıştır. Bu uzunluk ve Tm aralıkları incelenen birçok tekrarlanan diziler AT-zengin ve bu nedenle çok düşük GC içeriği gerçeğini yansıtmaktadır. Daha uzun sondalar olasılıkla yüksek Tm değerleri olacaktır; bu, 30 ° C&#39;de standart melezleştirme sıcaklığında yüksek bir arka plan hibridizasyon neden olabilir. Dolayısı ile de hibridizasyon sıcaklıklarda bir sorun, en iyi sonuçları elde etmek için gerekli olabilir. Adım adım, en iyi melezleme sıcaklığı, artış (veya azalış) 5 ° C sıcaklık bulmak için. </li></ol></li><li> Dikkatle slayt Parafilm çıkarın ve sonra dikkatlice yavaş yavaş bir köşesini kaldırarak kapak kayma çıkarın. Wa15 dakika 0.1x SSC tamponu her yıkama için üç kez kaydırın sh. Işık maruziyeti en aza indirmek için yıkama sırasında alüminyum folyo ile örtün Coplin kavanoz. </li><li> Uzun bir biyotinile prob kullanılarak değilse, 2.8 adıma geçin. <ol><li> Uzun biyotinillenmiş prob kullanılıyorsa, doku kendisi dokunmamaya dikkat ederek, bir Kimwipe ile dokuya çevresini kurulayın. Doku üzerinde çözüm engelleme 100 ul yerleştirin ve bindirme kabarcıklarını önlemek için özen, bir lamel ile hafifçe örtün. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de Parafilm ile lamel ve yerde slayt sarın. </li><li> Dikkatlice lamel kaldırmak ve bir Kimwipe ile doku etrafında kurulayın. Pipetleyin rodamin-avidin 1 seyreltilmiş 100 ul: doku üzerinde SBT 1000 ve yavaşça bir lamel ile kaplayın alarak bakım kabarcıkları yakalama önlemek için. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de Parafilm ile lamel ve yerde slayt sarın. </li><li> Dikkatlice lamel kaldırmak ve daha sonra 4x SSCT ve 5 dakika slayt, her 3 kere yıkayın0,1 x SSC içinde 5 dakika her biri için 3 kere yıkanır. NOT: Slaytlar uzun süreler için yıkanabilir. </li></ol></li><li> Slayt çıkarın ve (doku dokunmaktan kaçının) aşırı tampon kaldırmak için kuru bir Kimwipe dokusu etrafında kurulayın. 10-15 dakika veya nem tamamen çözülene kadar karanlık bir yerde slayt doku tarafı yukarı yerleştirin. </li><li> Vectashield montaj ortamı pipetle 11 ul (4 &#39;ile birlikte, 6-diamidino-2-fenilindol-DAPI) dokunun üzerine. Dikkatle doğrudan montaj orta ve doku merkezi üzerinde (değil Sigmacote ile tedavi), temiz bir kapak kayma yerleştirin. montaj orta kapak kayma kenarlarına doğru dışa yavaş göç gerekir. NOT: montaj orta her tarafta kapak kayma kenarına ulaşmak için başarısız olursa, o zaman montaj orta bir ek 1-2 ul gerekli hacme doldurmak için kapak kayma kenarında bir pozisyonda uygulanabilir. Bu durumda, önce slayt yüzeyinden herhangi bir aşırı orta silip emin olunSızdırmazlık. </li><li> Oje ile kapak kayma kenarları mühür. Doku numunesi üzerinde oje boyama kaçının. </li><li> Karanlık bir yerde dik slayt yerleştirin ve tamamen sert (genellikle 30 dakika veya daha fazla) kadar oje kurumaya bırakın. Bu noktada, görüntü daha sonra görüntüleme için, 1 hafta boyunca 20 ° C&#39;de doku ya da saklayın. </li></ol> Tampon / Çözüm Tarifler 10x PBS <ul><li> 80 gr NaCl </li><li> 2.0 g KCI </li><li> 14.4 gr Na 2 HPO 4 </li><li> 2.4 gr KH 2 PO 4 </li><li> 7.4 pH, H2O, 1 L&#39; </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 mi 10x PBS </li><li> 45 mi H2O </li><li> % 0.1 Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175.3 gr NaCl </li><li> 88.2 gr Na Sitrat </li><li> 800 mi, H2O içinde </li><li> 7 pH, H2O, 1 L&#39; </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 mi 20x SSC </li><li> 799 mi &#39;H 2 </sub&gt; O </li><li> % 0.1 Tween 20 </li></ul> 0.1X SSC <ul><li> 5 mi 20x SSC </li><li> 995 mi H2O </li></ul> Hibridizasyon karışımı (20 ul; 11 ile değiştirilmiş) <ul><li> 10 ul formamid </li><li> 4 ul% 50 dekstran sülfat </li><li> 2 ul 20x SSC </li><li> 4 ul H2O </li></ul> SBT 8 (10 mi) <ul><li> 2 mi 20x SSC </li><li> 0.01 gr Sığır Serum Albumin (BSA) </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 7.9 mi H2O </li></ul> Engelleme 8 çözeltisine (10 mi) <ul><li> 0.3 gr BSA </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 2 mi 20x SSC </li><li> 8 mi H2O </li></ul> Paraformaldehit ile Sabitleme çözeltisi (1 mi) <ul><li> 2 O (ilk su ekleyin) 393,75 ul H </li><li> 450 ul saf asetik asit </li><li> 156,25 ul% 16 paraformaldehit </li></ul>

<ol>
	<li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li><li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila.">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li><li>Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+polytene+chromosomes+in+Drosophila+using+digoxigenin-labeled+probes.">In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).</li><li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatic+sequences+in+a+Drosophila+whole-genome+shotgun+assembly.">Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly.</a> Genome Biology. 3 (12), (2002).</li><li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+finishing+and+mapping+of+Drosophila+melanogaster+heterochromatin.">Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin.</a> Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).</li><li>Treangen, T. J., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+DNA+and+next-generation+sequencing:+computational+challenges+and+solutions.">Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+pericentric+heterochromatin+by+comparative+genomic+hybridization+analysis+and+chromosome+deletions+in+Drosophila+melanogaster.">Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).</li><li>Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+of+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+larval+brain.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+Y-linked+genes+to+the+dot+chromosome+in+Drosophila+pseudoobscura.">Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura.</a> Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).</li><li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila.">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234 (2009).</li><li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+l(1)zw10+gene+product,+required+for+accurate+mitotic+chromosome+segregation,+is+redistributed+at+anaphase+onset.">The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset.</a> The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).</li><li>Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+Drosophila+Mitotic+Chromosomes.">Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).</li><li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSR+(paternal+sex+ratio)+chromosomes:+the+ultimate+selfish+genetic+elements.">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

DNA, ISH sık kromozomlara özgü dizileri eşlemek için kullanılır. Bu yüksek kopya sayısında heterokromatik dizileri için optimize edilmiş DNA ISH için basit bir yöntem tarif edilmiştir. Aksine diğer mevcut DNA ISH protokolleri bir gerekliliktir bir formamıd çözelti içinde yıkar kullanmak yerine, biz DNA denatüre doğrudan önceden ısıtılmış blok üzerinde doku monte slaytlar yerleştirin. Bu yöntem, formamid yüksek miktarda kullanılmasına aşılmaktadır. Net melezleme sinyalleri üretmek i...

In situ hibridizasyon (ISH DNA) DNA spesifik kromozom bölgelerine haritalama dizileri için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ökromatin olan tek kopyalı bölgelere problar çeşitli ile nik-çevirisi ya da büyük DNA ürünleri 1,2 uç-etiketleme ve deoxygenin (DIG) dahil edilmesi de dahil olmak üzere yaklaşımlar, -attached edilmiş nükleotitler ve bunların tanınma bir avuç yoluyla oluşturulabilir grup konjüge antikorlar 1-3. Az ya da tek bir kopya sayısında ökromatik dizilerin Görselleştirme yüksek spesifik aktiviteye veya birlikte sinyali artırmak çok küçük prob bir kokteyli ile tek bir büyük problar ya da kullanılmasını gerektirir. Normalde on blok olarak da bilinen tek bir kromozom bölgelerinde kümelenmiş tekrarların binlerce olarak mevcut çünkü aksine, uydu DNAlar gibi heterokromatin bulunan çok tekrar eden diziler, DNA ISH için daha kolay hedeflerdir. Transpoze edilebilir elemanları da olabilirfarklı kromozom anomalisi 2 yüksek kopya sayılarında bulundu. Bu durumda, düşük özgül etkinliği olan bir sonda etkili bir nedeniyle çok sayıda yerde bunların hibridizasyona heterokromatik dizileri etiketleyebilir. Tekrar eden dizilere Problar ticari olarak kısa oligonükleotitler (30-50 bp), sentezlenmiş ve kimyasal olarak çok sayıda farklı floresan gruplarının biri ile birleşebilir. Genom-sıralama teknolojileri kullanarak heterokromatindir içinde tekrarlayan dizileri Haritalama nedeniyle oldukça tekrarlayıcı uydu blokları 4-6,7 içinde bina iskeleleri karşılaşılan zorluklar zordur. Şu anda, ISH alt-kromozom düzeyinde bu dizileri haritalama en etkili yol olarak duruyor. Bu strateji, devam etmekte olan genom ve transcriptome sıralama çalışmaları ile ortaya olan tekrar eden dizilerin büyük sayıda haritalanması için önemlidir. slayt monte kromozomlar üzerinde haritalama tekrarlayan dizilerin verimlilik ve kullanım kolaylığı gre olacakatlı DNA ISH için basitleştirilmiş bir protokol tarafından geliştirilmiş. Örneğin, DNA, ISH mevcut protokoller, böylece eşleme dizileri için gerekli süre büyük ölçüde eklenmesi ve aynı zamanda bu pahalı reaktifin kimyasal atık büyük miktarlarda üretilmesi, formamid çözeltisi 2,8 hibridize dokuların birden fazla yıkama içerir. Burada formamıd yıkar ihtiyacını circumvents ve temel laboratuvar ekipmanları ve reaktifler kullanan bir revize DNA ISH yöntemi tarif. Bu yöntem, ilk olarak floresan boyalar ile konjuge edilmiş ticari olarak sentezlenir oligolar kullanılarak, Drosophila larva neuroblasts heterokromatik bölgelerinde yüksek olan tekrar eden DNA dizilerinin hızlı eşleme için tasarlanmıştır. Ancak, bu yöntem, aynı zamanda, diğer yollarla 9,10 ile ve birden fazla farklı doku ve kromozom türleri arasında sentezlendi büyük probları kullanılarak çok tekrarlanan diziyi eşleştirmek için de kullanılabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, daha uzun ya da multip kullanılarak ökromatik dizileri eşlemek için kullanılabilirle, ilgi euchromatic dizisi içinde kısa sondalar.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafine tweezers (5 gauge)</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm cover slips</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr><td>Paraffin wax paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block with thermometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidity chamber</td><td></td><td></td><td>empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td></td><td></td><td>with slide grooves</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microfuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td>clear or colored</td></tr><tr><td>P20 micropipette and plastic tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paperclips</td><td></td><td></td><td>20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>16% EM grade paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Reagents</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol, chemical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td></tr><tr><td>Long biotinylated probe</td><td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>for detection of long biotinylated probe</td></tr><tr><td>Hybridization buffer</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate + Tween</td></tr><tr><td>0.1x SSC</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>SSC, bovine serum albumin, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>phosphate-buffered saline + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>Hypotonic solution</td><td></td><td></td><td>0.5% sodium citrate in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

In situ hibridizasyon (ISH DNA) DNA spesifik kromozom bölgelerine haritalama dizileri için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu yaklaşım, hesaplama yaklaşımlar engelleyici zorluklarla karşı karşıya heterokromatik bölgelere haritalama derece tekrarlayan dizileri özellikle etkilidir. Burada başka DNA ISH protokolleri standart adımlar formamiddir yıkar circumvents DNA ISH için bir aerodinamik protokol açıklar. Bizim protokol de farklı böcek doku tiplerinin bir dizi boyunca heterokromatik kromozomal bölgeleri içinde olan tekrar eden DNA dizilerinin işaretlemek floresan boyalar, taşımak kısa tek sarmallı DNA probları ile hibridizasyon için optimize edilmiştir. Ancak, uygulamalar daha büyük prob ve tek kopya (non-tekrarlayan) DNA dizilerinin görselleştirme ile kullanmak için uzatılabilir. Biz sinir hücreleri ve Nasonia melanogaster Drosophila gelen ezilmiş kromozomlar için birkaç farklı tekrarlayan dizileri haritalama bu yöntemi göstermektedirvitripennis spermatosit. Biz de, küçük ticari olarak sentezlenir problar için ve karşılaştırma için daha büyük bir sonda için hibridizasyon desen göstermektedir. Bu prosedür, basit laboratuvar malzemeleri ve ayıraçları kullanır, ve DNA ISH performans ile çok az deneyime sahip araştırmacılar için idealdir.

Birkaç farklı doku kromozomlara, (Şekil 2B, bir PCR ürününün çentik translasyonu vasıtasıyla yapılan) bu yöntem göstermek için, kimyasal olarak, floresan konjugatları (Şekil 2) ve daha uzun bir biyotinlenmiş prob ile değiştirilmiş küçük ticari olarak sentezlenir oligo kümesi hibridize türleri (Tablo 1 e bakınız). Hedef dizileri D. mitotik kromozom perisentromerik (heterokromatik) bölgelerinde bulunan uydu tekrarlar dahil pupa N</...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes at JoVE.com

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

simple-method-for-fluorescence-dna-situ-hybridization-to-squashed

Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

18.0K Görüntüleme.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Video: Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Genetik

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Biyoloji

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Gelişim Biyolojisi

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.

Tüm Kromozomları, Telomerleri ve Gen Locilerini Ortaya Çıkarmak için DNA Halo Preparatlarında Floresan In Situ Hibridizasyon

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

HCR-DNA FISH: A Fluorescence In Situ Hybridization Technique to Detect Viral DNA in Infected Cells

Source: Wei Liu&#160;et al., <a href="https://www.jove.com/v/58950"> Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection</a>, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions were subjected to in situ hybridization chain reaction to detect MCPyV specific genomes. Further, the DNA-HCR technique was combined with FISH to visualize the MCPyV DNA in infected human skin cells.

HCR-DNA FISH: Enfekte Hücrelerde Viral DNA'yı Tespit Etmek için Bir Floresan In Situ Hibridizasyon Tekniği

Source: Wei Liu&#160;et al.,  Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions ...

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler