We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. Doku Diseksiyon ve Fiksasyon (60 dk) <ol><li> Drosophila beyinleri için, 1 x PBS (fosfat tamponlu tuzlu su), bir damla 3. instar larvaları yerleştirin. Aktif kalabalık olmayan flakon ya da şişe tarama olan büyük 3. instar larvaları seçin. <ol><li> Ağız kanca tutmak ve vücudun (Şekil 1A, B) uzunluğu aşağı 2/3 kapmak için başka bir cımbız çifti kapmak için bir ultra ince cımbız çifti kullanın. Larva sindirim sistemi beyin, ventral ganglionlar, tükürük bezleri ve bir kısmını ortaya çıkarmak için ağız kanca yavaşça çekin. Beyin ve ventral ganglionlar ayırmak için cımbız kullanarak (Şekil 1A, B), bir plastik Petri plakası üzerinde 1x PBT (Tween ile fosfat tamponlu tuzlu su) bir damlacık Diğer doku ve yerden. </li></ol></li><li> Nasonia testis disseksiyonlarıyla için, erkek 3 günlük eski pupa (kırmızı gözlü sarı organları) seçin. Erkek Nasonia f göreceli küçük kanat ped uzunlukları varpupa aşamada (Şekil 1C) sırasında emales. <ol><li> Bir cımbız çifti ve diğer cımbız çifti kullanarak göğüs bölgesinde yakın karın üstündeki pupa tutun, karın çok uzak ucu kapmak ve gözyaşı bırak şeklinde testisler çekin (onlar yağ ile çevrili olacak nazikçe sarsılmış olabilir gövdesi; Şekil 1D). Bir plastik Petri plaka üzerinde 1x PBT bir damlacık uygun Ezici, ve yer önleyecek testis, herhangi bir dış vücut parçaları ayırın. </li></ol></li><li> Her slayt için, dört ya da beş doku örneklerinde (yani., Drosophila larva beyinleri veya Nasonia testisler) toplam teşrih. NOT: Daha fazla beş numune kalabalık çekirdekleri ve kromozomların yol açacaktır. </li><li> İsteğe bağlı olarak, mitotik kromozom euchromatic bölgelerinde kardeş kromozomlardalerde bir ayrılmanın elde edilmesi için bir hipotonik çözelti ile dokuyu tedavi etmek: (5-10% 0.5 sodyum sitrat bir damla 1x PBT&#39;den beyinleri aktarmaken fazla 10) dakika. NOT: Kolşisin (bir mitoz inhibitörü) metafaz 11 de mitoz sayısının artırılması için yararlı olabilir. Olumsuz kromozom çözünürlüğü etkileyebilir çünkü çok büyük sağlıklı larva yayılması ve morfolojisi, kullanılan ve hatta istenmeyen doğruya, kullanımı gereksizdir. </li><li> Temiz Sigmacote ile tedavi edilen kapak kayma yüzeyi üzerine tespit edici çözeltisi (% 45, asetik asit içinde% 2.5 paraformaldehit) bir damlacık (~ 20 ul) yerleştirin. NOT: Kullanım her gün için sabitleştirici çözüm taze olun. % 45 asetik asit içinde 1.8-3.7% paraformaldehid kadar Sabitleme çözeltiler FISH için en iyi sonuçları vermektedir. Immün-FISH için bu protokolü beyinleri veya testis dışındaki dokuları kullanarak, ya da uyarlama farklı fiksatif ile deneme gerekebilir (farklı fiksatif listesi için, 12 bakınız). </li><li> Dikkatle ultra ince cımbız, minimide ile sabitleştirici damlacık içine diseksiyon tampon (1x PBT) her doku örneği aktarmakfiksatif çözüm içine tampon diseksiyon transferini zing. Dengeli bir şekilde tespit edici damlacık içinde birbirinden aralıklı olacak şekilde doku örnekleri yerleştirin. Oda sıcaklığında 4 dakika süreyle tespit sıvısı içerisinde dokuların inkübe edin. </li><li> Dikkatli bir şekilde, doku ve kapak slip üzerinde bir poli-lisin-kaplanmış slayt yüzü koyun. Bu noktada aşağı bastırın ancak bunun yerine kapak kayma slayt alt üzerine yapışır, böylece iki hafifçe temas etmesine izin vermeyin. Kapak kayma üstünde olacak şekilde slayt ters çevirin. </li><li> Filtre kağıdı katlanmış parçası içinde slayt / doku / kapak kayma sandviç. Sabit bir yüzeye, çok sıkıca düz aşağı doğrudan kapak kayma üzerinde pozisyon üzerine başparmak, basın kullanarak. (Bu doku, leke neden olur) kapak kayma kayma yanal önlemek için dikkatli olun. </li><li> Sıvı azot içine slayt / doku / kapak kayma Batmak (Şekil 1E, F cihazı bakınız), ve Azot kaynar durana kadar bekletin (uzun fine). Slayt çıkarın ve hemen (jilet ile sabit doku çizilmesini önlemek) yukarı yönde kapak kayma bir köşesini iterek taze jilet ile kapak kayma koparmak. <ol><li> Kuru buz bloğu slayt / doku / kapak kayma Ön soğutma, kapak önce çatlama slaytlar önlemeye yardımcı olur sıvı azot içinde daldırarak 1-2 dakika kadar slip. </li></ol></li><li> Hemen oda sıcaklığında% 100 etanol ile dolu bir kavanozun içine Coplin doku ile slayt yerleştirin ve (gerekirse bu sefer daha uzun olabilir) en az 5 dakika bekletin. Not: Soğuk% 100 etanol de kullanılabilir. </li><li> Doku ile slayt çıkarın (sabit doku dokunmadan) bir Kimwipe ile aşırı etanol uzak fitil ve 1 saat kuru hava slayt bırakın. <ol><li> 2. adıma veya hafta için hibridizasyon yapmadan önce bile aylar için düşük nem havada veya bir kuruma odasında kuru slaytlar tutmak için doğrudan devam edin. </li></ol></li></ol> Şekil 1: (A) 3 instar Drosophila larva (sağda), ağız kanca kapmak için nereye belirtilen pozisyonlara ile (ile gösterilir *) ve beyinleri incelemek için larva aşağı yol 2/3; (Solda) larva kafa içinde beyin göreli konumunu gösteren, aynı gelişim aşamasında bir larva şematik. (B) beyin ve 3 instar Drosophila larva (sağda) ve bu bir şematik disseke ventral ganglionlar doku (solda). Sarı vücut kırmızı göz aşamasında (C) 3-günlük-eski Nasonia pupa. (D) pupa kapmak için gösteren pozisyonlarda (sağ) 3 günlük Nasonia erkek pupa disseke bir testis çifti Karın posterior (* ile gösterilen) ve vücut üzerinde yarıda; (Solda) şematik tasvir erkek ve dişi oldup pupa; erkek pupa profili geçmiş uzatmak kanatları var kadın, aksine, saggital profili (siyah ok) geçmiş uzatmak değil kanatları ile ayırt edilebilir; Testis çiftinin göreli konumu erkek pupa gösterilmektedir., sıvı azot içinde bir kap içinde slaytlar sokmak için kullanılan ataç-ve (F) yöntemi (E) aparat bir dizge. Birden ataş dizeleri birden çok slayt aynı anda daldırma için kullanılabilir. In situ hibridizasyon 2. (1 gün, 30 dakika, uzun 1 saat-2.5 saat probları-günde 2) <ol><li> 1.1x hibritleme tampon maddesi 20 ul, her bir prob 1 ul (100 ng) ekleyin. Pipet Sonda / sabit kağıdın sathına hibridizasyon tamponu (doku dokunmaktan kaçının). </li><li> Dikkatlice kapak kayma doku üzerinde doğrudan merkezli emin, prob / hibridizasyon tamponu üzerine doğrudan bir kapak kayma yerleştirin. tampon inci geçirmelisinizhava kabarcıkları bırakarak, kapak kayma dış kenarını e. NOT: prosedüre herhangi bir sorun teşkil etmez doku temas etmemesine Küçük kabarcıklar. Dikkatle slayt üzerine geri bırakarak dikkatlice kapak kayma bir köşesini kaldırarak tarafından büyük kabarcıklar çıkarın. </li><li> Bir blok (kapak yukarı kayma), 95 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış yüzey üzerinde kayma / doku / kapak kayma yerleştirin. Işık maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo büyük bir parça ile kaplayın. Sürgü 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: tüpler için delikler ile tipik bir ısı bloğu slayt / doku / kapak kayma yerleştirmek için düz bir yüzey sağlamak için devrildiğinde olabilir. </li><li> Dokunmak sıcak kadar biraz soğumasını icar, slayt çıkarın. Dikkatle altındaki sıvı mühür kapak kayma etrafında gergin Parafilm bir parça sarın. </li><li> Bir nemlilik bölmesi içinde yalıtılmış ve slayt yerleştirin ve 30 ° C&#39;ye ısıtılmış bir inkübatör içine bölmenin. 4 saat gece boyunca için 30 ° C&#39;de inkübe edilir.<ol><li> Altına yerleştirilen nemlendirilmiş Kimwipes veya kağıt havlu ile boş bir ipucu kutusundan nem odası veya kapaklı Tupperware konteyner oluşturun. Not: Tek şeritli DNA oligo probları 45-47 ° C&#39;lik bir teorik bir erime sıcaklığına (Tm) elde etmek için 28-33 baz olarak tasarlanmıştır. Bu uzunluk ve Tm aralıkları incelenen birçok tekrarlanan diziler AT-zengin ve bu nedenle çok düşük GC içeriği gerçeğini yansıtmaktadır. Daha uzun sondalar olasılıkla yüksek Tm değerleri olacaktır; bu, 30 ° C&#39;de standart melezleştirme sıcaklığında yüksek bir arka plan hibridizasyon neden olabilir. Dolayısı ile de hibridizasyon sıcaklıklarda bir sorun, en iyi sonuçları elde etmek için gerekli olabilir. Adım adım, en iyi melezleme sıcaklığı, artış (veya azalış) 5 ° C sıcaklık bulmak için. </li></ol></li><li> Dikkatle slayt Parafilm çıkarın ve sonra dikkatlice yavaş yavaş bir köşesini kaldırarak kapak kayma çıkarın. Wa15 dakika 0.1x SSC tamponu her yıkama için üç kez kaydırın sh. Işık maruziyeti en aza indirmek için yıkama sırasında alüminyum folyo ile örtün Coplin kavanoz. </li><li> Uzun bir biyotinile prob kullanılarak değilse, 2.8 adıma geçin. <ol><li> Uzun biyotinillenmiş prob kullanılıyorsa, doku kendisi dokunmamaya dikkat ederek, bir Kimwipe ile dokuya çevresini kurulayın. Doku üzerinde çözüm engelleme 100 ul yerleştirin ve bindirme kabarcıklarını önlemek için özen, bir lamel ile hafifçe örtün. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de Parafilm ile lamel ve yerde slayt sarın. </li><li> Dikkatlice lamel kaldırmak ve bir Kimwipe ile doku etrafında kurulayın. Pipetleyin rodamin-avidin 1 seyreltilmiş 100 ul: doku üzerinde SBT 1000 ve yavaşça bir lamel ile kaplayın alarak bakım kabarcıkları yakalama önlemek için. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de Parafilm ile lamel ve yerde slayt sarın. </li><li> Dikkatlice lamel kaldırmak ve daha sonra 4x SSCT ve 5 dakika slayt, her 3 kere yıkayın0,1 x SSC içinde 5 dakika her biri için 3 kere yıkanır. NOT: Slaytlar uzun süreler için yıkanabilir. </li></ol></li><li> Slayt çıkarın ve (doku dokunmaktan kaçının) aşırı tampon kaldırmak için kuru bir Kimwipe dokusu etrafında kurulayın. 10-15 dakika veya nem tamamen çözülene kadar karanlık bir yerde slayt doku tarafı yukarı yerleştirin. </li><li> Vectashield montaj ortamı pipetle 11 ul (4 &#39;ile birlikte, 6-diamidino-2-fenilindol-DAPI) dokunun üzerine. Dikkatle doğrudan montaj orta ve doku merkezi üzerinde (değil Sigmacote ile tedavi), temiz bir kapak kayma yerleştirin. montaj orta kapak kayma kenarlarına doğru dışa yavaş göç gerekir. NOT: montaj orta her tarafta kapak kayma kenarına ulaşmak için başarısız olursa, o zaman montaj orta bir ek 1-2 ul gerekli hacme doldurmak için kapak kayma kenarında bir pozisyonda uygulanabilir. Bu durumda, önce slayt yüzeyinden herhangi bir aşırı orta silip emin olunSızdırmazlık. </li><li> Oje ile kapak kayma kenarları mühür. Doku numunesi üzerinde oje boyama kaçının. </li><li> Karanlık bir yerde dik slayt yerleştirin ve tamamen sert (genellikle 30 dakika veya daha fazla) kadar oje kurumaya bırakın. Bu noktada, görüntü daha sonra görüntüleme için, 1 hafta boyunca 20 ° C&#39;de doku ya da saklayın. </li></ol> Tampon / Çözüm Tarifler 10x PBS <ul><li> 80 gr NaCl </li><li> 2.0 g KCI </li><li> 14.4 gr Na 2 HPO 4 </li><li> 2.4 gr KH 2 PO 4 </li><li> 7.4 pH, H2O, 1 L&#39; </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 mi 10x PBS </li><li> 45 mi H2O </li><li> % 0.1 Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175.3 gr NaCl </li><li> 88.2 gr Na Sitrat </li><li> 800 mi, H2O içinde </li><li> 7 pH, H2O, 1 L&#39; </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 mi 20x SSC </li><li> 799 mi &#39;H 2 </sub&gt; O </li><li> % 0.1 Tween 20 </li></ul> 0.1X SSC <ul><li> 5 mi 20x SSC </li><li> 995 mi H2O </li></ul> Hibridizasyon karışımı (20 ul; 11 ile değiştirilmiş) <ul><li> 10 ul formamid </li><li> 4 ul% 50 dekstran sülfat </li><li> 2 ul 20x SSC </li><li> 4 ul H2O </li></ul> SBT 8 (10 mi) <ul><li> 2 mi 20x SSC </li><li> 0.01 gr Sığır Serum Albumin (BSA) </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 7.9 mi H2O </li></ul> Engelleme 8 çözeltisine (10 mi) <ul><li> 0.3 gr BSA </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 2 mi 20x SSC </li><li> 8 mi H2O </li></ul> Paraformaldehit ile Sabitleme çözeltisi (1 mi) <ul><li> 2 O (ilk su ekleyin) 393,75 ul H </li><li> 450 ul saf asetik asit </li><li> 156,25 ul% 16 paraformaldehit </li></ul>

<ol>
	<li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li><li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila.">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li><li>Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+polytene+chromosomes+in+Drosophila+using+digoxigenin-labeled+probes.">In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).</li><li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatic+sequences+in+a+Drosophila+whole-genome+shotgun+assembly.">Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly.</a> Genome Biology. 3 (12), (2002).</li><li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+finishing+and+mapping+of+Drosophila+melanogaster+heterochromatin.">Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin.</a> Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).</li><li>Treangen, T. J., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+DNA+and+next-generation+sequencing:+computational+challenges+and+solutions.">Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+pericentric+heterochromatin+by+comparative+genomic+hybridization+analysis+and+chromosome+deletions+in+Drosophila+melanogaster.">Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).</li><li>Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+of+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+larval+brain.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+Y-linked+genes+to+the+dot+chromosome+in+Drosophila+pseudoobscura.">Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura.</a> Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).</li><li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila.">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234 (2009).</li><li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+l(1)zw10+gene+product,+required+for+accurate+mitotic+chromosome+segregation,+is+redistributed+at+anaphase+onset.">The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset.</a> The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).</li><li>Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+Drosophila+Mitotic+Chromosomes.">Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).</li><li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSR+(paternal+sex+ratio)+chromosomes:+the+ultimate+selfish+genetic+elements.">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

DNA, ISH sık kromozomlara özgü dizileri eşlemek için kullanılır. Bu yüksek kopya sayısında heterokromatik dizileri için optimize edilmiş DNA ISH için basit bir yöntem tarif edilmiştir. Aksine diğer mevcut DNA ISH protokolleri bir gerekliliktir bir formamıd çözelti içinde yıkar kullanmak yerine, biz DNA denatüre doğrudan önceden ısıtılmış blok üzerinde doku monte slaytlar yerleştirin. Bu yöntem, formamid yüksek miktarda kullanılmasına aşılmaktadır. Net melezleme sinyalleri üretmek i...

In situ hibridizasyon (ISH DNA) DNA spesifik kromozom bölgelerine haritalama dizileri için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ökromatin olan tek kopyalı bölgelere problar çeşitli ile nik-çevirisi ya da büyük DNA ürünleri 1,2 uç-etiketleme ve deoxygenin (DIG) dahil edilmesi de dahil olmak üzere yaklaşımlar, -attached edilmiş nükleotitler ve bunların tanınma bir avuç yoluyla oluşturulabilir grup konjüge antikorlar 1-3. Az ya da tek bir kopya sayısında ökromatik dizilerin Görselleştirme yüksek spesifik aktiviteye veya birlikte sinyali artırmak çok küçük prob bir kokteyli ile tek bir büyük problar ya da kullanılmasını gerektirir. Normalde on blok olarak da bilinen tek bir kromozom bölgelerinde kümelenmiş tekrarların binlerce olarak mevcut çünkü aksine, uydu DNAlar gibi heterokromatin bulunan çok tekrar eden diziler, DNA ISH için daha kolay hedeflerdir. Transpoze edilebilir elemanları da olabilirfarklı kromozom anomalisi 2 yüksek kopya sayılarında bulundu. Bu durumda, düşük özgül etkinliği olan bir sonda etkili bir nedeniyle çok sayıda yerde bunların hibridizasyona heterokromatik dizileri etiketleyebilir. Tekrar eden dizilere Problar ticari olarak kısa oligonükleotitler (30-50 bp), sentezlenmiş ve kimyasal olarak çok sayıda farklı floresan gruplarının biri ile birleşebilir. Genom-sıralama teknolojileri kullanarak heterokromatindir içinde tekrarlayan dizileri Haritalama nedeniyle oldukça tekrarlayıcı uydu blokları 4-6,7 içinde bina iskeleleri karşılaşılan zorluklar zordur. Şu anda, ISH alt-kromozom düzeyinde bu dizileri haritalama en etkili yol olarak duruyor. Bu strateji, devam etmekte olan genom ve transcriptome sıralama çalışmaları ile ortaya olan tekrar eden dizilerin büyük sayıda haritalanması için önemlidir. slayt monte kromozomlar üzerinde haritalama tekrarlayan dizilerin verimlilik ve kullanım kolaylığı gre olacakatlı DNA ISH için basitleştirilmiş bir protokol tarafından geliştirilmiş. Örneğin, DNA, ISH mevcut protokoller, böylece eşleme dizileri için gerekli süre büyük ölçüde eklenmesi ve aynı zamanda bu pahalı reaktifin kimyasal atık büyük miktarlarda üretilmesi, formamid çözeltisi 2,8 hibridize dokuların birden fazla yıkama içerir. Burada formamıd yıkar ihtiyacını circumvents ve temel laboratuvar ekipmanları ve reaktifler kullanan bir revize DNA ISH yöntemi tarif. Bu yöntem, ilk olarak floresan boyalar ile konjuge edilmiş ticari olarak sentezlenir oligolar kullanılarak, Drosophila larva neuroblasts heterokromatik bölgelerinde yüksek olan tekrar eden DNA dizilerinin hızlı eşleme için tasarlanmıştır. Ancak, bu yöntem, aynı zamanda, diğer yollarla 9,10 ile ve birden fazla farklı doku ve kromozom türleri arasında sentezlendi büyük probları kullanılarak çok tekrarlanan diziyi eşleştirmek için de kullanılabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, daha uzun ya da multip kullanılarak ökromatik dizileri eşlemek için kullanılabilirle, ilgi euchromatic dizisi içinde kısa sondalar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:285px;"></td>
			<td style="width:257px;">Company</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Materials&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ultrafine tweezers (5 gauge)</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sigmacote</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Filter paper (75-150mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraffin wax paper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat block with thermometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dry incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Razor blades</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coplin jars (with slide grooves)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Aluminum foil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nail polish (clear or colored)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-20 &#956;L micropipette and plastic tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">20-25 standard metal paperclips linked to form a chain</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td>Company/Notes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">16% EM grade paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">100% Ethanol, chemical grade</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen)</td>
			<td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe)</td>
			<td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hybridization buffer</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">0.1X SSC (Saline-sodium citrate)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Blocking solution</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

In situ hibridizasyon (ISH DNA) DNA spesifik kromozom bölgelerine haritalama dizileri için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu yaklaşım, hesaplama yaklaşımlar engelleyici zorluklarla karşı karşıya heterokromatik bölgelere haritalama derece tekrarlayan dizileri özellikle etkilidir. Burada başka DNA ISH protokolleri standart adımlar formamiddir yıkar circumvents DNA ISH için bir aerodinamik protokol açıklar. Bizim protokol de farklı böcek doku tiplerinin bir dizi boyunca heterokromatik kromozomal bölgeleri içinde olan tekrar eden DNA dizilerinin işaretlemek floresan boyalar, taşımak kısa tek sarmallı DNA probları ile hibridizasyon için optimize edilmiştir. Ancak, uygulamalar daha büyük prob ve tek kopya (non-tekrarlayan) DNA dizilerinin görselleştirme ile kullanmak için uzatılabilir. Biz sinir hücreleri ve Nasonia melanogaster Drosophila gelen ezilmiş kromozomlar için birkaç farklı tekrarlayan dizileri haritalama bu yöntemi göstermektedirvitripennis spermatosit. Biz de, küçük ticari olarak sentezlenir problar için ve karşılaştırma için daha büyük bir sonda için hibridizasyon desen göstermektedir. Bu prosedür, basit laboratuvar malzemeleri ve ayıraçları kullanır, ve DNA ISH performans ile çok az deneyime sahip araştırmacılar için idealdir.

Birkaç farklı doku kromozomlara, (Şekil 2B, bir PCR ürününün çentik translasyonu vasıtasıyla yapılan) bu yöntem göstermek için, kimyasal olarak, floresan konjugatları (Şekil 2) ve daha uzun bir biyotinlenmiş prob ile değiştirilmiş küçük ticari olarak sentezlenir oligo kümesi hibridize türleri (Tablo 1 e bakınız). Hedef dizileri D. mitotik kromozom perisentromerik (heterokromatik) bölgelerinde bulunan uydu tekrarlar dahil pupa N</...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes at JoVE.com

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

simple-method-for-fluorescence-dna-situ-hybridization-to-squashed

Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

17.9K Görüntüleme.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Video: Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Biyoloji

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

Yüksek Verimli In situ</emFetal Fare Alt Ürogenital Yolu mRNA İfade Desenler Karakterize> Hibridizasyon Yöntemi

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Formalin Sabit Böbrek Dokular Hibridizasyon

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

Kombine DNA-RNA Floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A Whole Dağı<em&gt; In Situ</emGastropoda yumuşakça için&gt; Hibridizasyon Yöntemi<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...