Yazarlar Mona Herold destek Paaqua Grant ve GWU Luther Rice Fellowship destek GWU Harlan Kardeşliği kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı hibe MCB-1121711 tarafından desteklenmiştir.

1. Aletler, Kültür, Medya ve Yemekleri hazırlanması <ol><li> Alümina aşındırıcı film kullanarak dört forseps Sharpen. Ucu boyutunu izlemek için bir diseksiyon mikroskobu altında yapın. Forseps Bir çift bir back-up durumda bir ipucu işlem sırasında hasarlı olarak hizmet vermektedir. Dört forseps otoklav ve steril bir kap içinde saklayın. </li><li> Ve filtre sterilize; 500 ml 0,1 X ve 1.0X kültür ortamı her (15 tarifler ya Marc Modifiye Zil [MMR] veya Modifiye Barth&#39;ın Salin [MBS]) olun. Biz rutin MBS (; 1 mM KCl, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO 3 1X = 88 mM NaCI) kullanın. Ay boyunca 14-18 ° C&#39;de depolayın. </li><li> Kültür ortamı (bir vidalı kapak cam şişede 100 ml 1X besiyerine 2 g elektroforez dereceli agaroz)% 2&#39;lik agaroz çözüm olun. Agaroz çözmek için otoklav. Bu ay için 4 ° C sıcaklıkta saklanır ve sonraki gerektiğinde agaroz sıvılaştırmak için mikro dalgada edilebilir. </li><li> Agaroz sıvı iken, bir steril 24 oyuklu kültür plakanın her alt üzerine yaklaşık 0.5 ml dökün. Bu plastik yapışmasını eksplantlar engeller. </li><li> Agaroz sıvı iken, 02:58 60 mm Petri kapları alt üzerine yaklaşık 2-3 ml dökün ve girdap yavaşça alt kapalı olduğundan emin olun. Bu diseksiyon yemekleri olarak hizmet verecek ve onların membranlar kaldırıldıktan sonra agaroz plastik yapışmasını embriyolar önler. </li><li> Agaroz soğutuldu ve sertleştikten sonra, alev 6 &quot;Pasteur pipet ucu bir top haline erir ve hafifçe kültür plakasının her bir kuyu içinde agaroz bir yüzey üzerine temas edene dek. Bu sığ bir oyuk oluşturur içine eksplant alınacaktır. </li><li> 1X steril besiyeri ile kültür plakanın her doldurun. </li><li> Agaroz soğutulur ve sertleşmiş olduğunda, blastomer ayrılmasını kolaylaştırmak için seyreltilmiş kültür ortamı (0,1 X 0,1 X MMR veya MBS) ile diseksiyon çanak doldurun. </li&gt; </ol> 2. Embriyolar Seçimi <ol><li> Döllenmiş yumurta elde edilir ve standart protokoller 15&#39;e göre jöle kat çıkarın. 100 mm Petri kabındaki 0.5x kültür ortamına aktarabilirsiniz. </li><li> Embriyoların 2-hücreli aşamaya ulaşmak zaman, ilk bölünme karık ayrı bir çanak içine hayvan yarımkürede hafifçe pigmentli alanı (Şekil 1) bisects o hangi sıralayabilirsiniz. Bu eksplantlar için donör olacaktır. Eksplantlar sahnelemeye kardeş denetimleri olarak hizmet prosedür boyunca donör embriyolar yanında ayrı bir çanak içinde kalan 2 hücreli embriyolar tutun. </li></ol> 3. Eksplant Hazırlanması <ol><li> Bir diseksiyon çanak 5-10 embriyolar yerleştirin, ancak bir kerede yalnızca tek bir embriyo üzerinde çalışmak. </li><li> Şeffaf zar vitellin görülebilir, böylece ilk embriyo yerleştirin; o embriyonun hayvan kutup yüzeyi üzerinde bir açıklık (boşluk perivitelline) ile ayrılır. Bilenmiş bir kuvvet kullanmaKişinin subdominant taraftan (biri sağ elini ise sol) ps, perivitelline alanın üstünde vitellin membran kavramak. Öte yandan bir bilenmiş forseps kullanarak, ilk forseps ucu yakın membran tutup, yavaşça uzakta membran soyma ters yönde çekin. Hedef hücre zarı çıkarılması sırasında hasar görmesini şekilde kesilerek edilecek olan hücre belli bir mesafede ilk kavrama edin. Bir embriyo dümdüz olacak, çünkü membran kaldırıldı söyleyebilirim. </li><li> Subdominant el forseps ile bir komşu hücre tut ve disseke edilecek hücrenin doğrudan temas etmeyecek şekilde bir &quot;kol&quot; olarak bu hücre kullanın. Diğer yandan da forseps ile hafifçe istenen blastomerli uzak kalan komşu hücreler çekin. Aynı kaderi paylaşıyoruz midline hücreleri, hedef varsa, onlar bir çift olarak birlikte çıkartılabilir. Son olarak, &quot;sap&quot; hücreyi teşrih. </li><li> Steril olan blastomer (veya blastomer çifti), Pick up, Cam Pasteur pipeti, hava kabarcıkları ve aşırı emme kaçınarak. Pipet hücrenin zarar verebilir keskin kenarları kaldırmak için yangın cilalanmış olabilir, ama rutin olarak bunu yapmayın. Eksplant kültürünü çanak bir çukurda kültür ortamı yüzeyinin altında Pasteur pipet ucu yerleştirin, yavaşça blastomerli çıkarmak. Bu yerçekimi tarafından sığ bir depresyon içine girmelidir. Birden fazla embriyo aynı blastomerli tek bir eksplant olarak kombine edilebilir. </li><li> Diseksiyon çanak, tek-tek kalan embriyolar ile bu işlemi tekrarlayın. 10 embriyolar hakkında sonra, diseksiyon çanak hücresel enkaz dolu olacak. Bu durumda, yeni bir diseksiyon çanak değiştirin. </li><li> Tüm diseksiyonlar yapıldıktan sonra eksplantlar sığ çöküntü olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, yavaşça% 70 etanol ile kurutuldu ve hava içinde sterilize edilmiş bir saç döngü ile depresyon içine itilebilir. </li><li> Son diseksiyonu yaklaşık bir saat sonra, enkaz kaldırma surrousteril, cam Pasteur pipeti ile iyileşti eksplantlar nding. </li><li> 14-20, Kültür eksplant plaka ° C kardeş, kontrol embriyoları içeren Petri kabı yanında. Kardeş embriyoların blastomer eksplant gelişme aşamasında gösterecektir. </li></ol> 4. Analiz için Hasat eksplantlar <ol><li> Kardeşler istenilen gelişim aşaması ulaştığınızda eksplantlar Hasat. Bazı hücreler parçalanır bile bu eksplantlar oldukça iyi hayatta. Kültür bulutlu bir kitle de var ise, bu nedenle, sağlıklı bir eksplant içinde gömülü olup olmadığını belirlemek için bir saç döngüsü veya forseps ile keşfedebilirsiniz. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti ile kültür çözeltisi küçük bir hacimde eksplantlar Pick up ve hafifçe yapılacak test için uygun bir sabitleştirici veya lizis tamponu içine atmak. </li></ol>

<ol><li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li>
<li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth%2C+Diff%22%5BJournal%5D)">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+%28Xenopus+laevis%29+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).</li>
<li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth%2C+Diff%22%5BJournal%5D)">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li>
<li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+SA+%22Cell+Fate+and+Lineage+Determination%22">Cell Fate and Lineage Determination</a>. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).</li>
<li>Moore, K. B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li>
<li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li>
<li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li>
<li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li>
<li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li>
<li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li>
<li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22A+Laboratory+Manual%22">A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((foxD5a%2C+a+Xenopus+winged+helix+gene%2C+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li>
<li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li>
<li>Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs%3A+an+early+step+in+embryonic+axis+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li>
<li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendix+A%3A+Solutions+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li>
<li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li>
<li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Diff%22%5BJournal%5D)">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bireysel blastomer başarılı yetiştiricilik için en kritik adımlar şunlardır: 1) doğru ilgi blastomer belirlemek; gerekli manuel geliştirilmesi ve 4), steril, sağlıklı kültürü koruyarak 2), 3) hücre döngüsünün doğru kısmında diseksiyon hücreleri Diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemek ve iyi kültürünü aktarmak becerisi. Belirli blastomer işlemek için, kardinal eksenler tespit edebilmek için gereklidir. Xenopus embriyolarda, sırt tarafında ü...

Xenopus laevis embriyoların yumurta mikrocerrahi yaklaşımları izin verecek kadar büyük olduğundan embriyonik hücreler kendilerine özgü kaderi elde hangi mekanizma tanımlamak için yaygın faydalanılmıştır. Her bir hücre, bir iç enerji deposu sağlayan sarısı trombosit açısından zengin hücre içi kaynağı ihtiva eder çünkü Ek olarak, kültür ortamı besin takviyesi için gerek kalmadan dıştan gelişir. 1, 2, 3, 4, 5, 6 - kaderin hücre belirlenir hangi mekanizma ile çalışılması için önemli bir varlık (32-hücre aşamaları den 2) bölünme aşama blastomerlerin kader haritaları kapsamlı bir kümesidir. Bu haritalar, tek bir tanımlanabilir blastomer içine saptanabilir molekülü microinjecting ve dokuların etiketli soyu tarafından doldurulur hangi sonraki gelişimi izlenerek inşa edilmiştir. Embriyoların kardinal eksenleri güvenilir birçok Embry tespit edilebilir, çünkü tutarlı kaderi haritalar mümkündüros. Bitkisel yarımkürede değil iken Öncelikle, tüm yabani tip embriyolar hayvan yarımkürede, pigmentli olduğunu. İkincisi, döllenme de sperm girişini geleceğe ventral tarafta doğru hayvan yarımkürede pigmentasyon bir kasılma neden olur; birçok embriyo bir pigmentasyon farklılığı dolayısıyla dorsal ve ventral taraf arasında ayırımcılık kullanılabilir. Üçüncüsü, ilk bölünme karık böylece orta sagital en embriyolarında düzlem ve embriyonun sağ ve sol taraf tanımlamak için kullanılabilir yaklaşır. Kaderi haritaları da doğal embriyo büyük bir nüfus üzerinde her blastomer tanımlanabilir yapmak düzenli desenler yumurtaları sık çatlatma döllenmiş gerçeğine dayanmaktadır. Içinde tarif ve seçim yöntemleri kullanarak, pigmentasyon ve yarılma desen ile ilgili olarak yumurta kavramalar arasında değişkenlik olsa da, burada belirtilen akibetlerini hücrelerin yaklaşık% 90 doğruluk ile tespit edilmesini sağlar. Hücre kaderi caydırmak olabilirçeşitli mekanizmalarla embriyogenez sırasında mayınlı. Böyle ayirt kalıtsal sitoplazmik mRNA veya protein gibi içsel faktörler, erken desenlendirme çeşitli yönleri katkıda bulunur. Örneğin, belli mRNA&#39;ların anne hücreleri, mikrop hattı katkı endoderm olmak, ya da vücut dorsal eksen (7 te gözden geçirilmiştir) katkı olduğu. Embriyonik bir sinyalizasyon merkezine daha uzak komşu hücreler veya yerel olarak sağlanan dış faktörler, spesifik doku tipleri ve desenlendirme hemen her organ sistemini indükleyen sorumludur. Sinyalizasyon merkezleri örnekleri nöral ektoderm ve desenler mezoderm indükler gastrula içinde organizatör / düğüm ve aktivite kutuplaştırıcı bölgesini içeren ekstremite tomurcuğu modellerini ön-arka eksen. Kader haritalar farklı organların öncüleri belirlemek ve normal embriyo onların torunları tarafından alınan gelişimsel yolu açığa karşın, intrinsik ayırt edemezve bu hücreler üzerinde dışsal etkiler. Onlar da soyundan embriyonun karmaşık sinyal ortamında farklılaştırmak bir hücre, tam gelişim potansiyelini açığa vurmam. Kültür ardından embriyodan hücre alınması ya da 2), yeni bir embriyo konuma) 1 hücre transplantasyonu: İki deneysel yaklaşımlar, hücrenin kaderini intrensek faktörler tarafından belirlenir veya sonradan dış faktörden etkilenen olup olmadığını test edebilirsiniz eksojen sinyallerin yokluğunda. Hücreler elle ayrılması için yeterince büyük olduğundan hem deneysel yaklaşımlar Xenopus uygulanabilir olmuştur. Örneğin, çok sayıda çalışmalar (7 yorumlanan 8, 9) kader değişiklikleri test etmek için ana embriyolarda romanı yerlere embriyolar (hücre-hücre etkileşimleri değiştirmek için) veya nakledilen hücrelerin tek hücre sildiniz. Buna ek olarak, embriyonun farklı bölgelerinde hücreleri az sayıda eksplante yılının ikinci yaklaşımı iXenopus embriyo hücrelerinin hücre içi bir besin deposu, yumurta sarısı trombosit ile doldurulmaktadır çünkü dış faktörler yokluğunda indüktif doku etkileşimlerinin aydınlatmak için nto kültür mümkündür. Bu nedenle, kültür ortamının veya besin takviyesi büyüme faktörü olmadan belirli bir tuz ortam içinde bir kaç gün kültive edilebilir. Biz dorsal hayvan blastomer maternal kalıtım mRNA&#39;ların 10, 11 bağlı sinir ve dorsal mezodermal dokular üretmek için özerk bir yeteneği var, ve diğerleri 32-hücreli blastomer bu mezoderm özellikleri içsel ve dışsal bilgiler 12 hem dayanmaktadır gösterdi göstermek için bu yaklaşımı kullanmış . Eksplant olarak kültür hücrelerinin bir avantajı da orta eksplante hücre 12, 13, 14 kaderi etkileyebilecek olan hücre-hücre iletişim yolu belirlemek için tanımlanmış sinyal faktörleri ile takviye edilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, bir tane blastomerli pr enjekteendojen mRNA&#39;ların çevirisi önlemek için aşırı ekspres bir gen veya anti-sense oligonükleotidlerle için mRNA ile kültür IOR. Bunlar, kazanç ve kayıp fonksiyon-analizler molekülleri özerk ifade kaderi için gerekli olan belirleyebilirsiniz. Eksplant kaderini analiz etmek için, spesifik hücre tipleri kimlik standart gen ifadesi (örneğin, in situ hibridizasyon, RT-PCR) ve immünohistokimyasal analizleri ile gerçekleştirilebilir. Bu protokol bir embriyonik hücre spesifik dokularda gelişir nasıl düzenleyen içsel ve dışsal mekanizmalar arasındaki ayrım basit ama güçlü bir yol sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Alümina aşındırıcı filmi </td><td> Thomas Bilimsel </td><td> # 6775E-38 </td><td> Forseps ipuçları büyük tamiratlar Kursu (12 mikron), </td></tr><tr><td> Alümina aşındırıcı filmi </td><td> Thomas Bilimsel </td><td> # 6775E-46 </td><td> Forseps ipuçları keskinleşmesi ince için Orta (3 mikron), </td></tr><tr><td> Alümina aşındırıcı filmi </td><td> Thomas Bilimsel </td><td> # 6775E-54 </td><td> Forseps ipuçları parlatma için Güzel (0.3 mikron), </td></tr><tr><td> Forseps: Dumont, Dumoxel Biologie # 5 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> # 11252-30 </td><td> Bu ilk satın aldığınız bilenen gerekmez ince ipuçları var. Korozif dayanıklı onlar öylesineotoklavlanabilir. </td></tr><tr><td> Gentamisin çözümü </td><td> Sigma </td><td> G1397 </td><td> Kullanımı gibi aynı gün orta ekle </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

Embriyonun hücrelerinin tüm takip soyundan inşa Kader haritalar, dokuların embriyonun her hücre soyundan olduğunu ortaya. Kader haritaları bir organın öncüleri belirlenmesi için ve alt hücrelerinin, normal olarak embriyo bu organ doldurmak hangi gelişim yol ortaya çıkması için çok faydalı olmasına rağmen, bir öncü hücre tüm gelişim potansiyelinin veya göstermektedir mekanizmaları tespit olmayan hangi onun kaderi belirlenir. Hücre kaderinin bağlılığı test etmek için, tek bir deneysel manipülasyon sonrasında ifade olanlarla sağlam embriyonun (kaderi harita) in soyundan bir hücrenin normal repertuarı karşılaştırır. Hücrenin kaderini çevreleyen hücresel ortamı ne olursa olsun (kararlı) sabittir, ya da komşuları tarafından sağlanan dış faktörler tarafından etkilenir? Xenopus embriyosunun kapsamlı kaderi haritaları kullanarak, biz nasıl belirleneceği açıklanmaktadır, izole ve kültür tek klivaj dönemi öncüllerinin blasto denirMeres. Bu yaklaşım bir bu erken hücreler onların komşu hücreleri ile etkileşim gerektiren, sağlam embriyonun normal ortamda elde kaderi kararlıyız, veya sinyaller diğer türlerine maruz kalırsa alternatif kaderi ifade etkilemiş olup olmadığını değerlendirmenizi sağlar.

Doğru bir hücre gelişme potansiyelinin değerlendirmek için bu tahlil yeteneği kaderi haritalar 1, 2, 3, 4, 5, 6 göre dışarı doğru blastomerli kesme dayanır. Bu nedenle, daha sonra, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, normal bölünme desen ile uyumlu Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, 2 hücreli aşamada doğru pigmentasyon deseni ile embriyolar seçmek çok önemlidir. Kimse onlar gerekli bölünme aşamasına ulaşıncaya kadar kriteri embriyolar gözlemler ...

Watch this Scientific Journal Video about Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development at JoVE.com

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Tek bir embriyonik hücre kaderi, kalıtsal molekülleri ve / ya da hücrede gelen sinyalleri tarafından etkilenebilir. Klivaj dönemi Xenopus embriyosunun kaderi haritaları kullanarak, tek blastomer hücre-hücre etkileşimleri karşı kalıtsal molekül katkıları değerlendirmek için izole kültür için tespit edilebilir.

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

blastomere-explants-to-test-for-cell-fate-commitment-during-embryonic

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

15.2K Görüntüleme.  The George Washington University. Tek bir embriyonik hücre kaderi, kalıtsal molekülleri ve / ya da hücrede gelen sinyalleri tarafından etkilenebilir. Klivaj dönemi Xenopus embriyosunun kaderi haritaları kullanarak, tek blastomer hücre-hücre etkileşimleri karşı kalıtsal molekül katkıları değerlendirmek için izole kültür için tespit edilebilir.

Video: Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Gelişim Biyolojisi

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biyoloji

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Zebra Balığı Embriyolarından Naïve Blastoderm Explants Üretimi

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Islatılmış Boncuk Tahlili Kullanılarak Tavuk Embriyogenezi Sırasında Hücre Farklılaşması, Morfogenez ve Desenleme Analizi

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular prepatterns determine the initial length-scale of somites, mechanical processes have been implicated in setting their final size and shape. To better understand the intrinsic material properties of somites, a method is developed to culture single-somite explant from zebrafish embryos. Single somites are isolated by first removing the skin of embryos, followed by yolk removal and sequential excision of neighboring tissues. Using transgenic embryos, the distribution of various sub-cellular structures can be observed by fluorescent time-lapse microscopy. Dynamics of explanted somites can be followed for several hours, thus providing an experimental framework for studying tissue-scale shape changes at single-cell resolution. This approach enables direct mechanical manipulation of somites, allowing for dissection of the material properties of the tissue. Finally, the technique outlined here can be readily extended for explanting other tissues such as the notochord, neural plate, and lateral plate mesoderm.

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı Embriyolarından Tek Somit Eksplantlarının Hazırlanması

We present a protocol for isolating single somites from zebrafish embryos, the dynamics of which can be followed in culture for several hours by fluorescence time-lapse microscopy, thus providing a methodology to quantify tissue-scale shape changes at single-cell resolution.

Zebra Balığı Embriyolarından Tek Somit Eksplantlarının Hazırlanması

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Kök hücre benzeri

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Zebra Balığı Embriyolarından Naïve Blastoderm Explants Üretimi

Islatılmış Boncuk Tahlili Kullanılarak Tavuk Embriyogenezi Sırasında Hücre Farklılaşması, Morfogenez ve Desenleme Analizi

Zebra Balığı Embriyolarından Tek Somit Eksplantlarının Hazırlanması

Zebra Balığı Embriyolarından Tek Somit Eksplantlarının Hazırlanması

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay