The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne H&#233;l&#232;ne Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

Deneyler bilimsel amaçlarla ve yedek, azaltılması ve arıtma uluslararası kurulan ilkeleri ile kullanılan hayvanların korunması konusunda ulusal ve Avrupa yönetmelik ile uyumlu. Xenopus 1. Düz montaj sonrası Tadpoles Anterior Sinir Tube laevis in Situ Hibridizasyon Tüm montaj <ol><li> X edinin standart prosedürler 4 ve 26 ve üzeri (Nieuwkoop ve Faber gelişimsel tabloya göre 17 neurula sahne ulaşana kadar onları yaş göre embriyolar laevis. </li><li> Fix X. % 4 paraformaldehit (PFA) içindeki bir çözeltisi içinde inkübe edilerek kurbağa yavrularını laevis. 38 embriyolar, daha sonraki aşamalarda embriyolar için oda sıcaklığında 2 saat sahne sahne 26 için, 1 saat oda sıcaklığında 1.5 Kaya ve 2 ml cam şişe embriyolar döndürün. DİKKAT: PFA temas ve şüpheli karsinojen tarafından toksiktir. Bir başlık altında manipüle edilmelidir. NOT: Bir X laevis damızlık olduğunugenellikle 2 ml&#39;lik bir cam şişe içinde sabit, ancak daha büyük bir cam şişe kullanılabilir. </li><li> Iki kez,% 0.1 Tween (PBT) ile 1x PBS kullanarak aynı şişe içinde embriyolar, oda sıcaklığında 3 dakika yıkayın. NOT: Aksi kullanılan PBS belirtmek sürece veya kalsiyum ve magnezyum olmadan. </li><li> Aynı şişe içinde oda sıcaklığında en az 12 saat süre ile 100% metanol (MeOH) içerisinde embriyolar kurutmak. Plastik mikropipet kullanarak başlık altında en az iki kez MeOH% 100 olarak değiştirin. NOT: MeOH içinde çözündürülmüş lipitlerin hafif sarı bir döner. MeOH Solunduğunda toksik ve bir başlık altında manipüle edilmelidir Dikkat. </li><li> PBS, MeOH PBS içinde% 50, iki kez PBS, PBS içinde% 25 MeOH, oda sıcaklığında her banyo 5-10 dakika içinde MeOH 75:% kademeli MeOH banyolarının dizi, aynı şişeyi kullanarak embriyolar rehidrate. MeOH çözümleri plastik mikropipet kullanarak başlık altında değiştirilir. </li><li> Plastik bir pipet kullanarak, embriyo PBT üstüne dolu bir 60 mm Petri kabındaki disseke transfer. İki ince forseps bakım kullanmaTamamen optik sapı düzeyinde, gözler ve nöral tüp arasındaki tek ince forseps takarak gözlerini çıkarın. Nöral tüp gözleri ayırın. Dikkatle nöral tüp örten ektoderm altında forseps tanıtmak. Bakım ile, başın arkasında başlayarak ektoderm soyulabilir ve atın. </li><li> Kullanarak bir çift veya tek ISH gerçekleştirme digoksigenin işaretli ya da daha önceden olarak fluoresan etiketli problar 18,19 tarif. </li><li> ISH PBT plastik pipet kullanarak üstüne dolu yeni bir 60 mm Petri kabındaki embriyoların transferi sonrasında. </li><li> Ince forseps kullanarak dikkatlice embriyo geri kalanından nöral tüp ayırın. Bu aşamada, ön nöral tüp posterior nöral tüp ayırır. Dikkatle nöral tüp, gevşek nöral tüp, otik veziküller ve mezodermin kalan parçaları aşağıda bağlı olduğu Notokordun örten ektoderm kalan kısımlarını ayırın. Nöral tüp herhangi ekler yoksun olduğundan emin olunbu aşamada. NOT: Gerekirse ucunda bir uç kesim ile plastik transfer pipet yardımıyla tüm nöral tüp / embriyo transferi veya bir mikropipet gerçekleştirmek nöral tüp zarar görmesini önlemek için. Burun ucunun çapı nöral tüpün büyüklüğü ayarlanır. </li><li> Parçalara nöral tüp transfer PBS içinde seyreltilmiş 50% gliserol ile doldurulmuş, 1.5 ml bir tüp içinde (not adım 1.9). Nöral borular gliserol çözeltisi altına düşene kadar 4 ° C &#39;de, genellikle O / N, dur. </li><li> % 50 gliserol çözeltisi kaldır / PBS mikropipet P1000 ile aynı 1.5 ml tüp içinde bir mikropipet P1000 olarak% 90 gliserol / PBS çözeltisi ilave edilir. Nöral tüpler 4 ° C&#39;de, genellikle,% 90 gliserol / PBS çözeltisi altına O / N düşene kadar bekleyin. NOT: Uzun süreli depolama için, bakteri gelişimini önlemek için% 90 gliserol / PBS artı antibiyotik kullanımı. </li><li> Bir cam plaka, ya da bir plastik transfer pipet yardımıyla bir mikroskop lamı üzerinde sinir tüpleri aktarın. </li><li> Disdorsal ve tungsten iğneler kullanılarak ventral midlines boyunca sinir tüpleri mezhep. Bu adım sırasında sinir tüpleri% 90 gliserol / PBS tutulur. </li><li> Bir cam lamel ile kaplı takviye halkaları kullanılarak% 90 gliserol / PBS nöral tüpün iki tarafını monte edin. </li><li> Vernikle lamelleri düzeltmek ve 4 ° C&#39;de tutun. </li></ol> Anyon Değişim Reçine Boncuk kullanma 2. Hayvan Cap Eksplantlar İndüksiyon <ol><li> Mikropipet P1000 kullanılarak 2 ml tüp içine anyon değiştirici reçine boncuk 100 ul aktarın. Steril damıtılmış su ile boncuk en az beş ardışık kez yıkayın. Boncuk tüpün dibinde tortu ve mikropipet P1000 kullanılarak steril distile su yerine izin verin. Boncuk dokunmayın. </li><li> Boncuklar, 4 ° C&#39;de Sığır Serum Albumin (BSA) (10 mg / ml) ile steril damıtılmış su ile dolu bir 2 ml tüp içinde, O / N ıslatın. </li><li> İki saat yeni bir 1.5 ml komisyonlarda, boncuk yeri yarısını toplayarak öncemikropipet P1000 kullanılarak tüp. Molekülünü içeren bir maddenin 500 ul de endüktif potansiyeli için test ya da belirli bir kaderi indüklediği bilinen steril damıtılmış su değiştirin. Bir negatif kontrol olarak kullanılmak gibi, boncukların diğer yarısını tutun. </li><li> En az 2 saat süreyle 4 ° C&#39;de inkübe edin boncuklar. </li><li> Stereomicroscope altında sonraki tüm adımları uygulayın ve bir mikropipet ile tüm AC transferini gerçekleştirmek. </li><li> Plastik bir transfer pipeti kullanılarak% 0.2 BSA ile tamamlanmaktadır kalsiyum ve magnezyum ile PBS içine Blastula ya da çok erken gastrula embriyolar aktarın. NOT: Embriyolar 20 ila 24 saat içinde 12 ° C ulaşmak blastula ve gastrula aşamalarında geliştirilmesi. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi 20 forseps kullanarak embriyonun vitellin membran çıkarın. Tek forseps ile embriyo sabitleyin. Diğer forseps tarafı vitellin membran sıkıştırın. Zarının Holding, yavaş yavaş embriyo onu sıyırın. Ven bu yordamı gerçekleştirmekEmbriyonun tral (bitkisel) taraf. Embriyonun hayvan tarafını zarar vermeyin. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi 21 küçük komisyonlarda izole edin. Hayvan kutup embriyonun pigmentli bir parçasıdır. Kullanımı ince forseps hayvan kutup dışarı doku küçük bir kare kesip. AC dokusu sadece ektodermal hücreler içerir. Doku muntazam kalınlıkta olduğundan emin olun. Değilse, analize AC kaldırın. </li><li> Barth&#39;ın Salin (MBS) 4 Değiştirilmiş 0.5x bir Terasaki multiwell plakalarda her ac yerleştirin. Iyi yuvarlak alt ile temas halinde, aşağı pigmentli hayvan tarafı ile kuyunun içine ac yerleştirin. NOT: Bir% 0.1 BSA çözeltisi ile kaplama pipetler plastik yapışkan doku küçük parçalara yapışmasını önler. </li><li> Mikropipet P20 kullanarak her kapakta tek boncuk yerleştirin. Gerekirse, dikkatle kapağın ortasına boncuk yerleştirmek için forseps kullanabilir. NOT: klimalı ortamda batırılmış zaman boncuk pembe renklidir. En co Seçinlored boncuklar. </li><li> Terasaki oyuklu bir plaka hareket RT&#39;de 6 saat boyunca (18 22 ° C) inkübe edin. Boncuk az 2 saat ac yapışıyor. </li><li> Su ile ıslatılmış kağıt üstünde Terasaki çukurlu bir levha yerleştirin. Plastik bir kap ile plaka örtün. NOT: Bu &#39;nem odası&#39; kuyuların erken buharlaşmasını önler. </li><li> Kardeş embriyolar senin faktörün etkisini test etmek doğru aşamaya kadar Kültür 0.5x MBS veya 3/4 NAM ACs 15-20 ° C&#39;de nem odasında (adım 4.1). </li><li> Taze hazırlanmış% 4 PFA 1 saat komisyonlarda düzelt. Daha önce (Adım 1.4) açıklandığı gibi% 100 MeOH içinde komisyonlarda kurutmak. </li></ol> 3. Hayvan Cap Hücre Ayrılma ve reaggregation bir Xenopus laevis neurula içinde Aşılama önce <ol><li> Kaplama petri kaplarına (60 mm) ya da kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS, steril su içinde ya da% 3 agaroz ile 12 kuyucuklu plak. B karşılamak için yeterli agaroz eklepetri veya kuyunun ottom. RT (18-22 ° C) plakaları ön ısıtmak. İsteğe bağlı olarak, su kaybını önlemek için 4 ° C&#39;de birkaç gün için tabak saklı. </li><li> Hazırlama kalsiyum içermeyen Holtfreter tuz (60 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 4.6 mM HEPES,% 0.1 BSA (A-7888 Sigma pH 7.6)) ile Holtfreter tuzlu su (60 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 0.9 mM CaCl2, 4.6 mM HEPES,% 0.1 BSA, pH 7.6) 5. Not: CaCI2 çözeltisi Otoklava. </li><li> Agarozun kaplı Kalsiyum içermeyen Holtfreter tuzlu su ile üstüne de doldurun. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi kendi komisyonlarda izole etmek blastula veya çok erken gastrula embriyolar hazırlayın (2.7 2.5 adımları). </li><li> En az 15 ya da 30, küçük bir ACs 21 kadar izole edin. Kullanımı ince forseps hayvan kutup dışarı doku küçük bir kare kesip. AC dokusunun sadece ektodermal hücreler içerir ve bu nedenle aynı kalınlığa sahip olan. Değilse, analize AC kaldırın. NOT: Hayvan kutup Embry olduğunuo&#39;in en pigmentli kısmı. </li><li> Bir içine komisyonlarda aktarın iyi Kalsiyum içermeyen Holtfreter tuzlu su ile üst dolu agaroz kaplı. Onların pigmentli tarafı yukarı bakacak şekilde komisyonlarda yerleştirin. NOT: ayrışma süreci kalsiyum ücretsiz Holtfreter tuzlu su içinde hızla başlar. </li><li> Hücreler dissociating başlamak için birkaç dakika bekleyin. Dokuların ayrıştırma ile bu gözlemleyin. Ince forseps kullanarak, AC geri kalanından pigmentli tabakayı ayırmak ve bir mikropipet P20 ile atın. Tam hücre ayrışma işlemi birbirinden hücrelerinin ayrılmasını belirtir. NOT: Bir veya iki pigmentli katmanları aşılama sırasında görselleştirme yardımcı olmak için yeniden toplanmış eksplant içinde bırakılabilir. </li><li> Plaka dairesel hareketler kullanarak hücreleri merkezi. Bir mikropipet kullanarak dikkatle mümkün olduğunca orta kaldırmak P1000. Hücreleri dokunmamaya özen gösterin. </li><li> Çukuruna kalsiyum ile Holtfreter tuzlu su 1 ml ilave edilir. Ayrışmış komisyonlarda aktarın1.5 ml tüp içine. NOT: 2 ml tüpler da yuvarlak tabanlı nedeniyle kullanılamaz. </li><li> Bir tezgah santrifüj (500 xg) için 2000 rpm maksimum hızda santrifüj, 5 dakika ile pelet hücreleri. Mikropipet P1000 ile dikkatlice süpernatantı. </li><li> Ayrışmış hücrelere kalsiyum ile Holtfreter tuzlu su (60 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 0.9 mM CaCI2, 4.6 mM HEPES 20 ul ekle,% 0.1 BSA (Sigma A-7888 pH 7.6) 5. </li><li> Ayrışmış komisyonlarda, 3 (18-22 ° C) oda sıcaklığında saat 6 tutun. NOT: Bu hücreler yeniden agrega için gerekli zamandır. Hücreler tüpün dibinde küçük bir top form olarak yeniden toplanma görülebilir. </li><li> 0.5x MBS ya da 3/4 NAM 1 ml 1 ml ekleyerek tüp alt dikkatle ayırın eksplant (adım 4.1). Plastik transfer pipet kullanarak bir un kaplı levhada eksplant aktarın. </li><li> Kendi kontrol kardeşleri ile eksplantlar Sahne. Uzun süreli kültür kullanımı antibiyotik: kanamycin (50 ug / ml), ampisilin (50 ug / ml) ve gentamisin (50 ug / ml). </li></ol> Animal 4. Tırnak X&#39;in Sinir Plate eksplantlar Caps laevis Embriyo <ol><li> 3/4 NAM hazırlanması (110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0.2x PBS, 50 ug / ml gentamisin). 4 ° C&#39;de diseksiyon ve mağaza için fazla 1 hafta tutmayın. Yaşlı NAM agaroz kaplı diseksiyon yemekler (aşağıda) hazırlanması için kullanılabilir. </li><li> Coat petri küçük delikler silikon kalıp veya bir masa tenisi raketi kapağını kullanarak yapılmış içine 3/4 NAM% 3 agaroz ile (60 mm). NOT: Agaroz petri alt kapsar. Petri 3/4 NAM ile doldurmak, böylece biraz boşluk bırakın. Alternatif kurutmayan modelleme kil ile diseksiyon yemekleri yapmak. Kil içinde diseksiyon işlemi sırasında hafifçe embriyolar sıkın. Küçük delik kazmakagaroz yuvarlak forseps Bu &#39;diseksiyon çanak&#39; kullanarak diseksiyon işlemi sırasında embriyoların tutmak için yardımcı olur. </li><li> Diseksiyon araçları toplayın: plastik transferi pipetler, 22, iki ince diseksiyon forseps, P1000 mikropipet ve ipuçları, büyütme 8-40X bir stereosmicroscope (cam Pasteur pipeti ucundaki parafin gömülü kaş saç ile yapılan) bir &#39;kaş bıçak&#39;, fiber optik kılavuzları ile parlak bir ışık kaynağı. Temiz bütün kesme aletleri tutun; Her deneyden sonra, bir kez% 100 etanol ile, distile su ile iki kez yıkayın ve kurumaya bırakın. Metal kesme aletleri tozdan ve gerekli otoklav eğer uzakta saklayın. </li><li> Let ayrışmış ve yeniden toplanan Klimalar (protokol 3) ve onların kardeşleri X. Onlar sahne 13 (neurula) ulaşana kadar laevis embriyoların Nieuwkoop ve Faber gelişimsel tabloya göre 17 gelişir. 15 embriyolar sahne nöral plak aşamasında 13 içinde nakil için kullanılır. </li><li> Tüm yürütmekstereomicroscope altında sonraki adımlar. </li><li> Plastik bir transfer pipeti kullanarak,% 0.2 BSA ile tamamlanmaktadır kalsiyum ve magnezyumlu PBS içine embriyo aktarımı. Daha önce açıklandığı gibi 20 embriyonun vitellin membran çıkarın. Tek forseps ile embriyo sabitleyin. Diğer forseps tarafı vitellin membran sıkıştırın. Sıkıca zarı Holding, yavaş yavaş embriyo onu sıyırın. NOT: Embriyonun ventral (bitkisel) tarafında bu yordamı yapın. Embriyolar nöral plakayı zarar vermeyin. Embriyolar Vitellin zar çıkarma aşaması sırasında zarar görmüş ise, plastik bir transfer pipet kullanarak 3/4 NAM içeren 60 mm petri kabına embriyo transferine ve 15 dakika, iyileşme süreci gerçekleşmesi için yeterli bir süre bekleyin. </li><li> Taze 3/4 NAM üstüne diseksiyon çanak doldurun. </li><li> Plastik bir transfer pipet kullanarak, diseksiyon çanak içine kendi vitellin membran olmadan embriyo transferi. Içine embriyolar dorsal yüzü koyunkuyular. Transfer işlemi sırasında embriyo X beri hava-sıvı arayüzü ile temas girmesine izin yok laevis yüzey gerilimi ile lize edilmiştir. </li><li> AC eksplant aktarın plastik transfer pipet veya mikropipet P1000 kullanılarak diseksiyon plaka içine aşılı olması. Pipet sıvı içinde sonra, eksplantlar yavaş yavaş yerçekimi tarafından aşağı lavabo, ya da çok hafifçe itin izin verir. </li><li> Yuvarlak forseps ile embriyolar koruyun. Kaş bıçak ile size eksplant taşının greft niyetinde sinir tabak içine bir kesi yapmak. NOT: Nöral plakasının ön bükme bir dönüm noktası olarak kullanmak olabilir aşamada 14 anda, diencephalon toprakları (Şekil 4) işaretler. </li><li> , Neuroepithelium küçük bir parça kesip yuvarlak forseps ve bir kaş knive kullanarak. Kaş bıçakla eksplant küçük bir parça kesin. NOT: eksplant parçası neuroepithelium ablasyon alanı olarak aynı boyut ve şekil konusunda olmalıdır. </li&gt; <li> Kaş bıçak ve ince forseps kullanarak neuroepithelium kesi içine eksplant parçası yerleştirin. Eksplant hızla embriyo verdiği emin olun. </li><li> Alternatif yerinde greft korumak için aşılı embriyo üzerine cam lamel bir parça yerleştirin. Bunu yapmak için, kaba forseps kullanarak çok küçük parçalar halinde ince bir cam lamel kesti. Boyutu yaklaşık 1,5 mm 2 olduğundan emin olun. 3/4 NAM veya PBS kullanarak forseps içeren bir Petri kabı içine parçaları bırakın. Hasar görmesini önlemek için embriyo daha büyük bir cam parçası seçin. Embriyo biraz basık olacaktır. </li><li> Taşımadan en az 30 dakika bekleyin, ya da sadece hafifçe diseksiyon plakasını taşıyın. Embriyo 2 saat 30 dakika için kurtarmak ve gerekirse yavaşça lamel kaldırmak edelim. Dikkatle plastik transfer pipet kullanarak, 3/4 NAM dolu temiz bir çanak içine aşılı embriyolar pipetle. NOT: Aşılı embriyolar bakteri veya mantar kontaminasyonu geliştirmek eğilimindedir. Uzun vadeli ckanamisin (50 ug / ml), ampisilin (50 ug / ml) ve gentamisin (50 ug / ml ug): ulture antibiyotik kullanır. </li></ol>

<ol>
	<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IIB,+Pattern+formation+in+the+developing+central+nervous+system+(CNS)+of+the+amphibians+and+birds+(English).">IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English).</a> Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).</li><li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+induction+process;+its+morphogenetic+aspects.">The neural induction process; its morphogenetic aspects.</a> Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).</li><li>Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction.">Neural induction.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).</li><li>Hoppler, S., Vize, P. D., Hoppler, S., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xenopus protocols : post-genomic approaches. , (2012).</li><li>Franklin Hughes, W., La Velle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+early+tectal+lesions+on+development+in+the+retinal+gonglion+cell+layer+of+chick+embryos.">The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos.</a> J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beads+on+the+run:+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays.">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+barH-like+homeobox-2+gene+barhl2+acts+downstream+of+orthodentricle-2+and+together+with+iroquois-3+in+establishment+of+the+caudal+forebrain+signaling+center+induced+by+Sonic+Hedgehog.">The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog.</a> Dev Biol. 396, 107-120 (2014).</li><li>Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+embryonic+Xenopus+cells+to+activin+and+FGF+are+separated+by+multiple+dose+thresholds+and+correspond+to+distinct+axes+of+the+mesoderm.">Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm.</a> Cell. 71, 731-739 (1992).</li><li>Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+during+convergent+extension+in+Xenopus.">Calcium signaling during convergent extension in Xenopus.</a> Curr Biol. 11, 652-661 (2001).</li><li>Kiecker, C., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphogen+gradient+of+Wnt/beta-catenin+signalling+regulates+anteroposterior+neural+patterning+in+Xenopus.">A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus.</a> DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).</li><li>Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+epidermis+and+inhibition+of+neural+fate+by+Bmp-4.">Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4.</a> Nature. 376, 331-333 (1995).</li><li>Afouda, B. A., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+explants+as+an+experimental+model+system+for+studying+heart+development.">Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development.</a> Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).</li><li>Afouda, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-like+embryonic+explants+to+study+cardiac+development.">Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development.</a> Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).</li><li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent,+migratory,+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos.">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+the+Vitelline+Membrane+from+Xenopus+laevis+Embryos.">Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Cap+Isolation+from+Xenopus+laevis.">Animal Cap Isolation from Xenopus laevis.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Early+Steps+in+the+Development+of+the+Forebrain.">Review: Early Steps in the Development of the Forebrain.</a> Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+neural+plate:+new+roles+for+apoptosis+and+for+one+of+its+main+effectors+caspase-3.">Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3.</a> Genesis. 53, 203-224 (2015).</li><li>Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+early+Xenopus+embryo.">Patterning the early Xenopus embryo.</a> Development. 133, 1205-1217 (2006).</li><li>Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+vertebrate+forebrain:+the+prosomeric+model.">The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model.</a> Science. 266, 578-580 (1994).</li><li>Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+gene+expression+domains+and+the+evolving+prosomeric+model.">Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model.</a> Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).</li><li>Martinez-Ferre, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regionalization+of+the+diencephalon.">Molecular regionalization of the diencephalon.</a> Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).</li><li>Scholpp, S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Building+a+bridal+chamber:+development+of+the+thalamus.">Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus.</a> Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).</li><li>Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xotch,+the+Xenopus+homolog+of+Drosophila+notch.">Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch.</a> Science. 249, 1438-1441 (1990).</li><li>Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+signals,+gradient+formation+and+regional+specificity+in+neural+induction.">Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction.</a> Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction:+old+problem,+new+findings,+yet+more+questions.">Neural induction: old problem, new findings, yet more questions.</a> Development. 132, 2007-2021 (2005).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barhl2+limits+growth+of+the+diencephalic+primordium+through+Caspase3+inhibition+of+beta-catenin+activation.">Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+and+Reaggregation+of+Xenopus+laevis+Animal+Caps.">Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+research:+metamorphosed+by+genetics+and+genomics.">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li><li>Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+logic+of+gene+regulatory+networks+in+early+vertebrate+forebrain+patterning.">The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning.</a> Mech Dev. 130, 95-111 (2013).</li><li>Pani, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+deuterostome+origins+of+vertebrate+brain+signalling+centres.">Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres.</a> Nature. 483, 289-294 (2012).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+bilaterian+central+nervous+systems:+a+single+origin?.">Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?.</a> Evodevo. 4, 27 (2013).</li><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease models &amp; mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).</li><li>Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+gap+from+frog+research+to+human+therapy:+a+tale+of+neural+differentiation+in+Xenopus+animal+caps+and+human+pluripotent+cells.">Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells.</a> Development, growth &amp; differentiation. 50, s47-s55 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nöral gelişim (3,31,32 yılında yorum) çevre dokulardan hücresel gelişim programları ve sinyaller arasındaki karmaşık bir etkileşim tarafından orkestra edildiği. Burada X kullanılabilecek protokoller kümesini tarif dışsal ve sinirsel kader tayini ve in vitro ve in vivo nöral morfogenez katılan içsel faktörlerin keşfetmek için embriyolar laevis. Bu protokoller, X&#39;te gibi kullanılabilir tropicalis embriyolar, ancak X. tropical...

Omurgalı sinir sistemi nöroepitelyal homojen bir hücreler katmanı olarak nöral plaka ortaya çıkar. Gelişimsel programlar nöral plaka bölgeselleşme sırasında, uyarılan kodlanmış, ve kurulan nasıl anlamak, şu anda, gelişim biyolojisi önemli bir hedeftir. Diğer sistemlere göre, deneysel müsait Xenopus embriyo sinir gelişim 1,2 erken adımları analiz için tercih edilen bir modeldir. Bu embriyoların çok sayıda elde etmek kolaydır ve dış gelişme nörülasyon 3 ilk adımlar erişim sağlar. Birçok araç deneysel Xenopus laevis (X. laevis) embriyonik gelişim işlemek için kullanılabilir. Mikro enjeksiyon birlikte biyokimyasal ve farmakolojik araçlar ile indüklenebilir MOS dahil mRNA veya morpholinos (MO), bir, fonksiyon kazanç (GOF) ve fonksiyon (LOF) kaybı ve yolları 4,5 sinyal belirli değişiklik kontrollü verir. Blastocoel çatı ektoderm, bir blastulanın veya çok erken gastrula embriyo hayvan kutup etrafında yer alan ve &quot;Hayvan Cap &#39;(AC) olarak adlandırılır, gen ekspresyonunun önce manipülasyonu ile programlanabilir pluripotent hücreler kaynağıdır hazırlık eksplant. Bu yazıda X. kullanmak için ayrıntılı protokoller laevis AC eksplantları vitro ve in vivo moleküler mekanizmalar ve hücresel süreçleri altta yatan nöral gelişim test etmek. Bir teknik Xenopus iribaş nöral tüp içinde gen ekspresyonu ince gözlem, kader tayini ipuçları belirlenmesinde bir ön adımı izin sunulmuştur. Düz monte dokuların gözlenmesi yaygın piliç embriyoları 6 çalışmada kullanılan Oysa, düzgün Xenopus tarif edilmemiştir. 2 veya 4 hücreli dönem embriyoların blastomer içine sentetik mRNA veya MO enjekte ederek gen ifadesinin Manipülasyon AC programlanmasına olanak tanır4 eksplant. Anti-BMP faktörü Noggin sentezlenmesiyle Kemik Morfogenetik Proteini (BMP) yolunun, örneğin inhibisyonu için, AC hücreleri 3 için bir sinir kimlik vermektedir. Protokol bir anyon değiştirme reçinesi boncuk ile doğrudan temas yoluyla dışsal uyaranlara AC eksplant yerel ve zaman kontrollü pozlama gerçekleştirmek için ayrıntılı. Son olarak bir teknik ayrılmış ve yeniden ilişkili programlanan farklı hücrelerden hazırlanan karışık eksplant nakli in vivo sinir progenitörlerin gelişim özelliklerini test etmek için bir işlem açıklanmaktadır. Kurbağa embriyo erken omurgalı nöral gelişimini incelemek için güçlü bir modeldir. Gen ifadesinin manipülasyonu birleştiren in vitro kültürleri eksplantasyona için neuroepithelium bölgeselleşme, çoğalması ve morfojenezinin 7-12 çalışmada önemli bilgiler sağlar. AC eksplant programlama ex vivo 13,14 fonksiyonel kalp gelişimini izin verdi. Kullanımaşılama eksplant 15 nöral tepe farklılaşma programı 16 indükleyici az transkripsiyonel anahtarın tanımlamasına yol açmıştır. Zona limitans intrathalamica (ZLI) kaudal ön beyin gelişimini ve bölgeselleşme kontrol sonik kirpi (Sus) salgılar bir sinyal merkezidir. Sürekli Shh maruz kaldığında, üç transkripsiyon faktör genleri coexpressing nöroepitelyal hücreler - barH benzeri homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) ve Iroquois-3 (irx3) - ZLI bölmenin iki özelliklerini kazanmak: yeterliğinin şşş ifade ve ön nöral plak hücrelerden ayırmak yeteneği. Bir model sistem olarak, nöroepitelyal hücrelere bir ZLI kaderin indüksiyonu 8 sunulacaktır. Bu protokoller temel mec keşfetmek için gelişimsel biyologlar ve diğer araştırmacılar için basit, ucuz ve verimli araçlar sağlamayı amaçlıyorAnahtar nöral hücre davranışları hanisms. Bu protokoller çok yönlü ve dışsal ve içsel nöral belirleme ipuçları geniş bir ürün yelpazesi soruşturma izin verir. Bu sinir soy bağlılığı, endüktif etkileşimleri ve hücre davranışlarının in vivo analizlerde uzun vadeli izin verir.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;20909.290</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>anion exchange resin beads</td><td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>For culture of animal cappH 7.6</td></tr><tr><td>Gentamycine&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&amp;nbsp;</td><td>antibiotic</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&amp;nbsp;for bead preparation</td></tr></tbody></table>

stem cell-like xenopus embryonic explants to study early neural developmental features in vitro and in vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Farklı türler, embriyolojik manipülasyonları ve düzenleyici genlerin ifade deseninde morfolojik değerlendirmeler dayanarak, bir kavramsal model nöral plak farklı histogenez alanları üreten bir gelişimsel ızgara tanımlayan enine ve boyuna parçalara bölünür savunur. Nöral plaka olarak, ön beyin, orta beyin, Beyin ve omurilik taslakları tüm zaten (23-25 ​​gözden) gastrulasyon sırasında ön-arka (AP) ekseni boyunca kurulmuştur. Nörülasyon sırasında...

Watch this Scientific Journal Video about Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

stem-cell-like-xenopus-embryonic-explants-to-study-early-neural

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

7.9K Görüntüleme.  Institut Curie. In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. 

Video: Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Gelişim Biyolojisi

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Nörobilim

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Dan Sinir Eksplantasyon Kültürleri<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Zebra Balığı Embriyolarından Naïve Blastoderm Explants Üretimi

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

İlköğretim nöron değerlendirilmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyolar kullanarak immün

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Kök hücre benzeri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez

Manipülasyon ve

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme

Dan Sinir Eksplantasyon Kültürleri

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Zebra Balığı Embriyolarından Naïve Blastoderm Explants Üretimi

İlköğretim nöron değerlendirilmesi

Diseksiyonu