Yazarlar cömertçe FOXG1 antikor sağlamak için Dr Y. Sasai teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Connecticut Kök Hücre Araştırma Hibeler (08-SCB-UCHC- 022 ve 11-SCB24) ve Spastik Parapleji Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. İnsan Pluripotent Kök Hücre Agrega Üretimi (D1-D4) <ol><li> İnsan pluripotent kök hücreleri temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / ml) ile desteklenmiş HESC orta varlığında, fare embriyo fibroblast (MEF) besleyiciler üzerinde kültürlenmiştir. Kültür 5-7 gün sonra, koloniler büyük ama yine de ayrışmamış olduğunda, bir sonraki adım için hazırsınız. </li><li> Enzim çözeltisi önce hazırlanmalıdır. Bir 50 ml tüp içinde, DMEM/F12 ortamı içine bir 1 mg / ml konsantrasyonda dispase (veya kollagenaz) çözülür. Isınmış iken bu çözümler en iyi şekilde karıştırmak için, 10-15 dakika için bir 37 ° C su banyosu içine orta ve enzim içeren tüp yerleştirmek ve sonra bir Steriflip filtre kullanarak sterilize edin. </li><li> Hücrelerin medyumuyla kapalı aspire DMEM/F12 ile durulayın, ve de bu kapalı aspire. HESC için 3-5 dk (iPSCs için en fazla 10 dakika) için inkübatör her iyi ve yere dispase 1 ml ekleyin. Alınan hücreleri mikroskobun altına bak; zamankenarları hafifçe kıvırın / biraz karanlık görünmesi, hücrelerin sonraki adım için hazırsınız. Bu 3 dakika sonra hücreler kontrol ve gerektiğinde geri koymak en iyisidir. Ilk defa bu protokolü kullanıldığında, bunun mümkün olduğu kadar çabuk dispase gelen hücreleri çıkarmak için önemli olduğu gibi aynı anda hücre yalnızca tek bir plaka ile başlamak için en iyisidir. </li><li> Hücrelerinden dispase kapalı aspire. Yavaşça (hücreler bu aşamada çok hassas olan ve nispeten kolayca plaka kapalı gelecek) dispase durulayın amacıyla her bir kuyunun DMEM/F12 orta 1.5 ml ekleyin. DMEM/F12 kapalı aspire ve her bir kuyucuğa HESC orta 1.5 ml eklenir. </li><li> Hücreleri ayırmak ve parçalamak için, (dikey) sağ alt köşesine doğru bir 10 ml&#39;lik cam pipet ucu yerleştirin iyi (hücreler dokunmadan) ve pipet yukarı taşımak ve aşağı - yukarı stoke yakın olmalıdır Devam etmeden aşağı inme. Da diğer tarafında erişildikten sonra, yatay korkunç içinde tekrarction. </li><li> Bütün hücre süspansiyonu içinde olduğunda, 15 ml tüp yerleştirmek ve 2 dakika boyunca 200 x g santrifüj onları. Tüpün altına bir hücre pelet olmalıdır. Pelet yukarıda orta kapalı aspire. </li><li> Agregalar halinde tutmak için kullanılmalıdır hücre kültürü şişesi büyüklüğü hücre orijinal miktarının bağlıdır. HESC ortam 50 ml kullanılmalıdır ile hESC 6 kuyu (1 plaka olarak), bir non-T75 doku kültürü şişesi tedavi edildi. 37 adımda 1.6 şişeyi ve inkübe hücreleri aktarın ° C. </li><li> Hücre artıkları kurtulmak amacıyla, hücre orta ve şişeye yaklaşık 12 saat sonra değiştirilmesi gerekir. Bunu yapmak için, (2 dakika boyunca 200 x g) aşağı dönüş hücreler, bir 50 ml tüp içine orta / hücrelerin her yerleştirmek ve orta yaşlı kapalı aspire. Daha sonra, yeni T75 şişesi içine hücreleri ve yerine taze ortam HESC 50 ml eklenir. Hücreler daha sonra bu aynı prosedürü (günde 5 kadar) sonrasında günlük beslenebilir. </li></ol><ol><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe hücre / orta aktarın ve 200 x g&#39;de 2 dakika süre ile hücreler santrifüj. Sonraki, süpernatant kapalı aspire ve nöral indüksiyon orta (NIM) 50 ml T75 şişesi yeni (tedavi olmayan doku kültürü) için hücreleri aktarmak. </li><li> NIM hücreleri içinde olduğunda, orta yarısı iki günde bir değiştirilmesi gerekir. Agregalar bir kaç dakika sonra kendi üzerinde bir 50 ml konik tüp alt (hiçbir santrifüj gerekli) yatacaktır yere yeterince büyük olmalıdır. NIM (D7-D8 toplam) içinde 2-3 gün sonra, hücreler plaka için hazır olur. Laminin veya fetal sığır serumu (FBS) hücreleri levhaları tutturmak için yardımcı olmak için kullanılabilir. </li><li> Doku kültürü ve toplam sayısı, her diğer herhangi bir temas olmadan birkaç gün daha plaka üzerinde büyümeye gerekir olarak gerekli olan 6 oyuklu plakalar hücre yoğunluğuna bağlıdır tedavi edildi. Ortalama olarak, bir gelen hücreleriT75 şişesi hücrelerin değerinde 04-06 Haziran hakkında kuyucuğu verecektir. </li><li><ol class="ualpha"><li> Laminin kullanıyorsanız, ug / ml kat 6-plaka (~ 0.5 ml /) için 10-20 NIM içinde seyreltin. 6-kuyucuğu (kuyu başına ~ 20-30 agrega) üzerine 2-3 saat, plaka hücre agrega için kaplama sonra. Agrega eklenmiş sonra, NIM 1.5 ml ekleyin. </li><li> FBS kullanılması durumunda,% 90 NIM ve% 10 FBS (1.5 ml / çukur) oluşan bir karışım hazırlanır. Her kuyucuğa hücreleri ile orta 1.5 ml ekleyin, hafifçe agrega yaymak için ileri ve geri plaka sallamak ve hücreler küvözde O / N eklemenize izin verir. FBS kaldırmak için ertesi sabah, orta (2 ml / NIM arasında) değiştirmek için emin olun. </li></ol></li><li> Kaplama olmanın bir veya iki gün sonra, her agrega bir tek tabaka oluşturacak şekilde yayılır. Birkaç gün içinde, bu hücrelerin çoğunun merkezlerinin morfolojik kolumnar hücreleri (uzunlamasına) benzer görünecektir. Bu dönemde, her gün NIM değiştirin. Bazı PSC hatları (especially IPSC), daha az verimli kolumnar hücreleri oluşabilir. Bu durumda, 2. aĢama sırasında BMP ve TGF inhibitörleri (Dorsomorphin 29, 2 mcM az SB431542 19) ek yardımcı olabilir. </li><li> Gün 14-17 civarında, kolumnar hücreler daha kompakt görünecektir. Bazen bu hücreler içinde görünür lümen sırtlar veya halkalar oluşturabilirler. Kolumnar morfolojisi yanı sıra, bu aşamada hücreler gibi PAX6 ve SOX1 12,26 olarak nöroepitelyal belirteçleri, ifade eder. </li><li> Izolasyon başlamadan önce, bir ilk mevcut olmayan herhangi nöroepitelyal hücresi olup olmadığını belirlemek için hücreleri incelemek gerekir. Objektif bir işaretleyici olmayan nöroepitelyal koloniler belirtmek için kullanılabilir. Bunlar daha sonra bir pipet ucu ile kazıyarak ortadan kaldırılabiliyor. </li></ol> 3. Telencephalic progenitörlerinin Nesil (D17-D24) <ol><li> Kolonilerin merkezleri nöroepitelyal hücreleri içerir ve koloni geri kalanından izole edilmelidir. Bu kullanılarak yapılabilirBir mikropipet ve steril 1 ml filtrelenmiş pipet. Basınç küçük bir miktar koloni merkez kısmına uygulandığı zaman, bu genel olarak oldukça kolay kapalı kaldırır. Koloninin dış kısmı yanı ayırmak izin için dikkatli olun. Merkezlerinde inatçı olmak ve kendi Çıkmıyor, onlar steril kaput bir mikroskop altında bir iğne kullanarak onları eksize edilerek kaldırılabilir. 15 ml tüp kolonilerin merkezi kısımları aktarın ve 2 dakika boyunca 200 xg&#39;de döndürün. </li><li> Orta hücre dışı aspire edilmelidir. (A vitamini, 1:50 olmadan) B27 ilavesi ile NIM 10 ml T25 içeren şişenin tedavi edilen hücrelerin değerinde iki plaka sonra olmayan bir doku kültürü ile aktarılabilir. Hücrelerin bir plaka başına ortam yaklaşık 5-10 ml kullanımı. </li><li> Hücreler ertesi güne izlendi, bunlar görünüm gibi bir alan olmalıdır. Genellikle periferik hücreler olduğu gibi, yeni bir şişeye (NIM ve B27, 1:50 varlığında) bu hücrelerin aktarımı için gerekli olangizlice ve balonun altına eklemek hangi. </li><li> Neurospheres sonra B27 (1:50) ile desteklenmiş NIM kullanılarak bir hafta için süspansiyon içinde kültüre edilmesi gerekmektedir. Hücre dayanıklılık desteklemek ve proliferasyonu, siklik AMP (cAMP, 1 uM) birlikte insülin büyüme faktörü (IGF1, 10 ng / ml) için süspansiyon kültürü sırasında ortam içine ilave edilebilir. Bu noktada, neurospheres telencephalic ataları içeren (FOXG1 +) ve terminal farklılaşma için lamelleri üzerine kaplanacaktır hazırız. </li></ol> 4. Telencephalic Nöronlar (D25 +) içine ilave Farklılaşma <ol><li><ol class="ualpha"><li> Hücreler kaplama için poly-ornithine/laminin kaplanmış lamelleri (24 oyuklu plakalar) hazırlayın. Lameller ilk olarak temizlenir ve daha sonra manevra-ornitin ile kaplanmış (0.1 mg / ml, 37 ° C, O / N, ve dondurucuda saklanabilir) belirlenir. Poly-ornitin kaplama: <ol><li> Lamelleri sterilize edilmesi: Bir içinde lamelleri yerleştirinbeher nitrik asit içeren ve yavaşça bir saat davlumbaz sallayın. , Nitrik asit dökerek DI su ile birkaç kez yıkayın ve en az 15 dakika süreyle DI akan su altında lamelleri bırakın. % 95 etanol içinde lamelleri yerleştirin ve ya RT 30 dakika (hemen kullanıyorsanız) veya etanol içinde mağaza için sallayın. </li><li> Steril bir başlık, bir 6-kuyulu plakanın kapak içine steril lamelleri ihtiva eden 50 ml&#39;lik tüp içeriğini boşaltınız. Sterilize forseps kullanarak, bir defada bir lamel pick up ve tek bir iyi bir 24-plaka dik ayarlanır. Her bir oyuğa, bir lamel sahip olacak şekilde tekrar edin. </li><li> Onlar tamamen kurumasını sonra lamelleri her bir kuyunun içinde düz düşmüş kadar plakaları dokunun. Sonraki her bir lamel 100 ul poli-ornitin (0.1 mg / steril dH 2 O ml) eklenir ve plakalar 37 inkübe O / N ° C. </li><li> Ertesi gün, inkübatör plakaları kaldırmak ve onları RT soğumaya bırakın. (T kenarından itibaren her bir lamel kapalı poli-ornitin aspireO lamel) sürecinde lamelleri dokunmayın veya çizmemeye emin. Lamelleri yıkamadan önce yaklaşık 30 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> De her 1 ml steril dH 2 O ekleyin, 10 dakika bekletin, ve her kuyudan suyu aspire. Bu yıkama iki kez daha yineleyin. Plakaları tamamen kurumasını sonra (izinli kaputu kapalı kapsar) alüminyum folyo ile kapatın, üzerinde kapak yerleştirin ve -20 ° C&#39;de mağaza </li></ol></li><li><ol><li> Laminin ile ceket lamelleri için, sadece kendisi lamel (dokunma sıvı olması dikkat ederek her bir poli-ornitin tedavi lamel sinir farklılaşma orta ve laminin (20 ug / ml &#39;lik nihai konsantrasyon) karışımı 50 ul ekle ve dökülüp değil kapalı). Bağlanma için hücreler hazırlanması için 1-2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe. </li></ol></li></ol></li><li> Toplayın ve bir 15 ml tüp 2 dakika süreyle 200 xg&#39;de neurospheres santrifüj. Süpernatantı kapalı aspire. </li> &lt;li&gt; <ol class="ualpha"><li> DMEM-F12 hücreleri ile durulayın ve tekrar hücre santrifüjlenir. Neurospheres düzgün takmak için çok büyük iseler, bu aşamada Accutase ile ayrışmış olabilir. </li><li> Accutase kullanılıyorsa: DMEM-F12 hücreleri ile yıkama işleminden sonra, neurospheres Accutase (~ 2 mL) eklenerek ve 3 dakika için 37 ° C sıcaklıkta inkübe hücreleri tarafından küçük kümeleri için ayrılmış bulunmaktadır. Daha sonra, tripsin inhibitörü (~ 2 ml) ile aynı miktarda ekleyin ve 3 dakika boyunca 200 x g santrifüj hücreleri. Hücreler daha sonra NDM içerisinde yeniden asıltılanır ve bir P200 pipet kullanılarak ayrılmalıdır. Küçük kümeler daha sonra önceden kaplanmış lamelleri üzerine kaplama yapılabilir. </li></ol></li><li> Orta çoğunluğu kapalı aspire ve seçerek daha kolay hale gelir, böylece orta bir kaç damla içinde bir 6 santimetrelik bir petri tabağına üzerine hücreleri yerleştirin. Her ön kaplı lamel 4-5 neurospheres ekleyin. İlk laminin kapalı aspire etmek gerek yoktur. </li><li> Neurospheres en az 2-4 saat boyunca takmak edelim. Bir kez onlar varttached da daha fazla orta (0.5 ml / lamel) ilave edilmelidir. Bu sinir B27 (1:50) ile desteklenmiş farklılaşma, orta cAMP (1 uM) ve nörotrofik faktörler (BDNF, GDNF ve IGF Tüm ng / ml 10) oluşmalıdır. Bu noktada, ortamın yarısı her diğer gün değiştirilebilir ve bu hücrelerin birkaç ay boyunca muhafaza edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Tanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+specification+in+the+spinal+cord:+inductive+signals+and+transcriptional+codes.">Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes.</a> Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).</li><li>Wilson, S. I., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction:+toward+a+unifying+mechanism.">Neural induction: toward a unifying mechanism.</a> Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).</li><li>Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li><li>Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).</li><li>Singh Roy, N., Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer-specified+GFP-based+FACS+purification+of+human+spinal+motor+neurons+from+embryonic+stem+cells.">Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).</li><li>Lee, H., Shamy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+motoneurons.">Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons.</a> Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).</li><li>Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).</li><li>Li, X. J., Du, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li><li>Perrier, A. L., Tabar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Yan, Y., Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li><li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).</li><li>Osakada, F., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li><li>Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+neurons+and+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).</li><li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Chambers, S. M., Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).</li><li>Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li><li>Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+embryonic+forebrain.">Patterning of the embryonic forebrain.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).</li><li>Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+in+glutamatergic+neurogenesis:+conserved+programs+in+neocortex,+cerebellum,+and+adult+hippocampus.">Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus.</a> Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).</li><li>Watanabe, K., Kamiya, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li><li>Watanabe, K., Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage.">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li><li>Li, X. J., Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136, 4055-4063 (2009).</li><li>Zeng, H., Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5, e11853 (2010).</li><li>Kim, D. S., Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity.">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).</li><li>Zhang, X., Huang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6+is+a+human+neuroectoderm+cell+fate+determinant.">Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant.</a> Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+patterning+of+the+central+nervous+system:+how+many+organizers.">Initial patterning of the central nervous system: how many organizers.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).</li><li>Ma, L., Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+GABA+neurons+correct+locomotion+deficits+in+quinolinic+acid-lesioned+mice.">Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).</li><li>Li, W., Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Lowry, W. E., Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts.">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li><li>Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Ebert, A. D., Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li><li>Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li><li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li><li>Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+models+of+the+genomic+imprinting+disorders+Angelman+and+Prader-Willi+syndromes.">Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).</li><li>Kiskinis, E., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+the+clinical+application+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells.">Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).</li><li>Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+L166P+mutant+human+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+exhibit+partial+loss+of+gamma-secretase+activity+in+endogenous+amyloid-beta+generation.">Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation.</a> Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).</li><li>Walsh, R. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Rett+syndrome+with+stem+cells.">Modeling Rett syndrome with stem cells.</a> Cell. 143, 499-500 (2010).</li><li>Egawa, N., Kitaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Screening+for+ALS+Using+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates.">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Nöral farklılaşma sürecinde çok kritik adımlar vardır. Aksi takdirde hücrelerin önceden nöronal olmayan soy olma yolunda önyargılı olabilir, çünkü insan PSC&#39;ler pluripotent olduğundan emin olmak için önemlidir. Bu, bu tür Oct4, Sox2, Nanog, ve Tic-1-60 olarak 1-3 pluripotency belirteçler karşı antikorlar ile insan PSC&#39;ler lekeleme ile teyit edilebilir. İnsan PSC&#39;ler onları pasajlanmasını sonra çok iyi ekleyiniz yoksa, ROCK inhibitörü (Y27632) yardım eklenebilir. Sist...

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) de dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücreleri (PSC&#39;ler), nöronlar 1-3 dahil olmak üzere vücuttaki her hücre tipi, oluşturmak için kapasitesine sahiptir. Insan PSC&#39;ler çeşitli nöronal alt tipinin farklılaşması yönlendirilmiş rejeneratif tıpta bu hücrelerin uygulama için anahtar tutar. Geliştirme sırasında fonksiyonel nöronal subtiplerinin nesil nöral soyunun indüksiyon, rostro-kaudal ekseni boyunca bölgesel progenitörlerinin şartname ve 4,5 bölgesel öncü hücrelerden post-mitotik nöron tiplerinin farklılaşması içeren karmaşık bir süreçtir. 2001 yılında başlayarak, çeşitli sistemleri nöronal alt 6,7 sonraki nesil için bir platform sağladı hESC gelen nöral soy üretmek için kurulmuştur. Gelişimsel ilkeler, spinal motor nöronlar 8-12, orta beyin dop gibi birçok nöron tiplerinin dayanarakaminerjik nöronlar 13-15 ve nöral retina hücreleri 16,17 verimli insan PSC&#39;ler gelen belirtildi. Bu in vivo gelişimi sırasında bu tür nöron özellikleri için önemli olan kritik morphogens uygulanarak gerçekleştirilmiştir. Diğer protokoller de farklılaşma 21 tanıtmanıza yardımcı olacak gibi küçük moleküller veya diğer hücre türleri ile ortak kültür tarafından ek faktörler 18-20 kullanılarak nöron içine hESC farklılaşma teşvik etmek geliştirilmiştir. İnsan neokorteks derece gelişmiş ve öğrenme, bellek ve bilişsel işlev 22,23 önemli bir rol oynamaktadır glutamaterjik nöronlar da dahil olmak üzere pek çok hücre tipi içerir. Kültür glutamaterjik nöronlar üreten ilk adım telencephalic progenitör hücrelerin belirtmektir. Yoshiki Sasai grubunun ilk serumsuz suspensio kullanarak fare EKH (mESCs) den telencephalic öncüllerinin yönetti farklılaşma bildirdiDKK1 varlığında (Wnt sinyal inhibe eden) yanı sıra LeftyA (boğum sinyalleme inhibe eden) 24 n kültürü. Daha sonra, bizimki de dahil olmak üzere çeşitli gruplar da serum serbest orta 25-27 insan PSC&#39;ler gelen telencephalic öncüllerinin belirtimi bildirdin. Insan PSC&#39;ler dan telencephalic öncüleri kuşak eksojen morphogens ve bunların öncüleri üreten verim kullanımı mESCs 26,27 dan daha çok daha yüksek olduğu gerektirmez. Burada, iyi Zhang&#39;ın grubu 7 tarafından kurulmuştur nöral indüksiyonu için kimyasal olarak tanımlanmış sistem tarif edilmiştir. Ekzojen caudalizing faktörlerin yanı sıra, bu aynı protokol verimli bir şekilde insan PSC&#39;ler 27 telencephalic öncüleri oluşturur. Bunlar ataları sonra Wnt ve sonik kirpi (SHH) arasında sinyal düzenleyerek dorsal veya ventral ataları olarak ayrılabilirler. Dorsal öncüllerinden daha glutamaterjik nöronlar e farklılaşabilmektedirfficiently 27. Buna ek olarak, bu protokol, aynı zamanda hastalıkların büyük bir dizi eylem için aynı zamanda potansiyel tedavilerinin mekanizma keşfetmek için kullanılabilir hastaya özel nöron üretimi sağlayan insan iPSCs 28 den glutamaterjik nöronların üretimi için iyi sonuç . Bunun yanı sıra, sistem aynı zamanda telencephalon da farklı nöronal tiplerinin gelişimi ve özellikleri keşfetmek için bir platform sağlar.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td>Supplier</td>
			<td>Catalog #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (14.3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>116K5103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (human)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxg1 antibody</td>
			<td>Dr. Y. Sasai</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoxb4 antibody (1:50)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>I12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6 antibody (1:5000)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>PAX6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nkx2.1 antibody (1:200)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB5460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGLUT1 antibody (1:100)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>100-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-0260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic hedgehog (SHH)</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>1845-SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>352098</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>BD</td>
			<td>353004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9'' glass pipetes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip filters (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup filters 1,000 ml (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope (Observer A1)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood (Sterilgard III Advance)</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5702 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells

Burada, etkili bir şekilde insan pluripotent kök hücreleri (PSC&#39;ler) dan telencephalic glutamaterjik nöronlar üretmek için bir aşamalı prosedürü tarif edilmiştir. Farklılaştırma prosesi hücreler bir süspansiyon kültürü içinde yerleştirilmiş iken agregatlar oluşturması için yuvarlak kümeleri haline insan PSC&#39;ler kırılma tarafından başlatılır. Agregalar sonra spontan farklılaşma sağlamak için günde 1-4 hESC ortamda yetiştirilen. Bu süre boyunca, hücreler üç germ tabakasından herhangi haline kapasitesine sahiptir. Günde 5-8, hücrelerin nöral soy içine itmek için bir nöral indüksiyon ortamı olarak yerleştirilir. Günde 8 civarında, hücreler 6 kuyucuğu üzerine takın ve hangi zaman nöroepitelyal hücrelerin formu sırasında ayırt etmek için izin verilir. Bunlar, nöroepitelyal hücreler 17. günde de izole edilebilir. Onlar lamelleri üzerine kaplama için hazır olana kadar hücreler daha sonra neurospheres olarak muhafaza edilebilir. Herhangi caudalizing faktörü olmadan bir temel ortam kullanılarak, nöroepitelyal hücreler specifie olansonra daha verimli dorsal telencephalic ataları ve glutamaterjik nöronları içine ayrılabilirler telencephalic öncüleri, içine d. Genel olarak, bizim sistem bu nöronların gelişimi ve onları etkileyen hastalıklar çalışma araştırmacılar için insan glutamaterjik nöronlar oluşturmak için bir araç sağlar.

Burada, bir protokol çeşitli kritik adımlarda telencephalic glutamaterjik nöronlar içine insan PSC&#39;ler farklılaştırmak için: PSC agregatların oluşumuyla, nöroepitelyal hücrelerin indüksiyonu, telencephalic progenitörlerinin nesil ve telencephalic nöronlar içine bu progenitörlerinin terminal farklılaşma (Şekil 1) vardır tarif edilmiştir. Bu sistem telencephalic ataları ve glutamaterjik nöronları nesil güçlü ve verimlidir. Bir örnek (Şekil 2) gibi, cauda...

Watch this Scientific Journal Video about The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Bu işlem insan gelişimi sırasında gözlenen benzemektedir kontrol noktaları geçerek telencephalic nöronlar verir. Hücreler, kendiliğinden ayırt etmek için izin nöral soy doğru itip faktörlere maruz kalabilir, izole edilir, ve terminal farklılaşma ve olgunlaşma için izin lamelleri üzerine kaplanır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

the-specification-telencephalic-glutamatergic-neurons-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.9K Görüntüleme.  The University of Connecticut Health Center. Bu işlem insan gelişimi sırasında gözlenen benzemektedir kontrol noktaları geçerek telencephalic nöronlar verir. Hücreler, kendiliğinden ayırt etmek için izin nöral soy doğru itip faktörlere maruz kalabilir, izole edilir, ve terminal farklılaşma ve olgunlaşma için izin lamelleri üzerine kaplanır.

Video: The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Nörobilim

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

İnsan Nöral Agregalarının bir cGMP uygulanabilir Açılım Yöntemi kök hücrelerin pluripotent kök hücreleri veya Fetal Beyin dokusundan türetilen

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model system to explore disease mechanisms and carry out high content screening (HCS) to interrogate compound libraries or identify gene mutation phenotypes. However, with human cells the transition from NPC to functional, mature neuron requires several weeks. Synapses typically start to form after 3 weeks of differentiation in monolayer culture, and several neuron-specific proteins, for example the later expressing pan-neuronal marker NeuN, or the layer 5/6 cerebral cortical neuron marker CTIP2, begin to express around 4-5 weeks post-differentiation. This lengthy differentiation time can be incompatible with optimal culture conditions used for small volume, multi-well HCS platforms. Among the many challenges are the need for well-adhered, uniformly distributed cells with minimal cell clustering, and culture procedures that foster long-term viability and functional synapse maturation. One approach is to differentiate neurons in a large volume format, then replate them at a later time point in HCS-compatible multi-wells. Some main challenges when using this replating approach concern reproducibility and cell viability, due to the stressful disruption of the dendritic and axonal network. Here we demonstrate a detailed and reliable procedure for enzymatically resuspending human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons after their differentiation for 4-8 weeks in a large-volume format, transferring them to 384-well microtiter plates, and culturing them for a further 1-3 weeks with excellent cell survival. This replating of human neurons not only allows the study of synapse assembly and maturation within two weeks from replating, but also enables studies of neurite regeneration and growth cone characteristics. We provide examples of scalable assays for neuritogenesis and synaptogenesis using a 384-well platform.

This protocol describes a detailed procedure for resuspending and culturing human stem cell derived neurons that were previously differentiated from neural progenitors in vitro for multiple weeks. The procedure facilitates imaging-based assays of neurites, synapses, and late-expressing neuronal markers in a format compatible with light microscopy and high-content screening.

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...