Biz yazının eleştirel değerlendirilmesi ve yararlı tartışmalar için, IBS Dr Christophe Masselon (iRTV, CEA, Grenoble) ve Viral Enfeksiyon üyeleri ve Kanser Grubu teşekkür ederim. Biz proteinin Crm1 tür hediye Cyril Dian minnettarız. Bu bilimsel çalışma Grenoble talimat Merkezi&#39;nin (; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL&#39;de ISBG) ve kütle spektrometresi tesis yer aldı. Bu mali Entegre Yapısal Biyoloji Girişimi (FRISBI, ANR-10-InSb-05-02) için Fransız Altyapı tarafından desteklenen, GRAL (ANR-10-LabX-49-01) [Grenoble Ortaklığı bünyesinde Yapısal Biyoloji] ve Bilimsel Araştırma için Fransız Ulusal Merkezi (CNRS).

1.. Protein Numune Hazırlama: Tampon Borsası (İsteğe bağlı) Protein (1-20 uM) ve mikromolar konsantrasyonlar 5-25 ul gereklidir. Tampon değişimi, santrifüj, ultrafiltrasyon cihazları (örneğin Vivaspin, Sartorius) ya da mikro santrifüj jel süzme sütunu (örneğin, Mikro Bio-Spin 6 kromatografi sütun, Bio-Rad) 29,30 kullanılarak gerçekleştirilebilir. Tampon değişimi adımlar 2-3x tekrar edilebilir. Tampon değişimi ayrıntılı açıklaması, daha önce 29,30 sunuldu. Örneğin, 20 mM tris nihai tampon (hidroksimetil) aminometan (örneğin Tris) pH 8 kullanmaktadır. Not: Bu adım birçok durumda, iptal de edilebilir. Bir protein örneği güçlü MS tespiti engelleyebilir molekülleri veya tamponları içeren zaman yapılmalıdır [örneğin gliserol, 4 - (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit, HEPES]. Bu qu geliştirmek için de faydalıdırspektrumlarının ality. 2. Matris kristalleştirilmelerinden Onların Saflık (İsteğe bağlı) Geliştirmek Üzere <ol><li> Bir Pyrex şişeye% 40 etanol (EtOH) 10 ml dökün. </li><li> Bir matrisin 600 mg ekleyin. </li><li> , Bir su banyosu ve bir direnç ısıtıcı kullanarak, matris çözeltisi sıcak ve matris tamamen bir cam çubuk ya da manyetik bir karıştırıcı kullanılarak çözülür kadar karıştırın. </li><li> Eğer doymuş bir çözüm bulana kadar 2. adımı tekrarlayın. </li></ol> Not: çözücünün bir çok büyük hacimli ya da uzak çözeltinin kaynama noktasının altında matris tüm kristaller veya kristallerin zayıf verim neden olur çözülmesi. <ol start="5"><li> Çözelti yavaşça soğumaya bırakın. Bir gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta daha sonra birkaç saat boyunca oda sıcaklığında bırakın edebilir. Not: kristaller oluşmadığı takdirde, kristalizasyon, bir cam karıştırma çubuğu ile (sadece çözelti yüzeyinin altında) beherin içine kazınarak indüklenebilir. </li><li> Süzme ile matris kristalleri toplayın. </li><li> Buz soğukluğundaki bir çözücü minimum miktarı ile kristaller durulayıp süzün. </li><li> Kristalleri kurumasını bekleyin. Bu adım için vakum kullanabilirsiniz. </li></ol> 3. MALDI Paslanmaz Çelik Hedef temizliği <ol><li> Metanol (MeOH) ile MALDI plaka durulayın ve özel laboratuvar uygulamaları (örn. Kimwipe&#39;dan) için yapılan bir temizleme beziyle hafifçe silin. </li><li> H 2 O ile hedef durulayın ve bir temizleme beziyle silin. </li><li> Bir 600 ml çanak içinde plaka MALDI takın ve% 50 EtOH ile örtün. </li><li> Ultrasonik bir banyo içinde 10 dakika için EtOH çözelti içindeki hedef sonikasyon. </li><li> Plaka üzerinde kalan artıkları varsa, bir kez daha 1-4 adımları tekrarlayın. </li><li> Son olarak, (ya da su ile aşağıdaki nota bakın) MeOH ile hedef durulayın, tüm sıvı bir temizleme doku üzerinde toplanan bir şekilde eğin. Oda sıcaklığında veya kullanılarak azot-de hedef kurumasını bekleyingaz akışı. </li></ol> Not: Benzer bir prosedür daha önce 15 nitelendirildi. Not: hedef son durulanması için kullanılan çözücü (MeOH veya su) bir hedef özellikleri belirler. Hedef MeOH ile durulanır, numune su kullanırken çok daha fazla hedefe yayılır. 4. α-CHCA İnce Tabaka Çözüm: MALDI Hedef Hazırlama ve Biriktirme <ol><li> Doymuş bir çözelti elde etmek için aseton içinde α-CHCA çözülür. </li><li> El ile (bir pipetle olmadan) α-CHCA doymuş çözelti içinde 10 ul ucu (örneğin GELoader Tip, Eppendorf) daldırma: Çözeltinin küçük bir miktarı (nedeniyle kılcallık) uç akacaktır. </li><li> Pipet ile çok hızlı bir şekilde (yani 1 sn) MALDI hedefe dokunun ve MALDI hedef α-CHCA aseton çözüm yatırmak. Bu matris ince bir tabaka, protein oluşturacakörnek yatırılacaktır. Mümkün olduğunca küçük bir ince tabaka nokta oluşturmak için deneyin. </li></ol> Not: matris olarak SA kullanırken, aseton içinde SA doymuş bir çözeltisi kullanılarak ince bir tabaka hazırlanır. 5. SA, α-CHCA, DHB ve CHCA_DHB Karışım 25: Natrix Solutions hazırlanması <ol><li> , ACN içinde% 0.1 TFA (70:30, hac / hac), 20 mg / ml SA çözelti hazırlayın. </li><li> ACN içinde 20 mg / ml α-CHCA çözeltisi ve% 5 formik asit [&quot;α-CHCA solüsyon&quot; olarak adlandırılan] (70:30, hac / hac) hazırlayın. </li><li> Bir ACN içinde 20 mg / ml çözelti ve DHB [&quot;DHB solüsyon&quot; olarak adlandırılan]% 0.1 trifloroasetik asit (TFA) (70:30, hac / hac) hazırlayın. </li><li> &quot;CHCA_DHB çözüm&quot; elde etmek, 01:01 oranında (hacim / hacim) içinde &quot;α-CHCA çözüm&quot; ve &quot;DHB çözüm&quot; karıştırın. </li></ol> Not: Kütle az 100 kDa olan proteinleri analiz ederken biri de, farklı oranlarda &quot;α-CHCA çözüm&quot; ve &quot;DHB çözüm&quot; karıştırabilirsiniz. EXA içinmple α-CHCA ve DHB (hacim / hacim) arasında 40:60 &#39;lık bir oranı, daha iyi bir çözünürlük daha az duyarlılık (tartışmaya bakınız) elde edilir. 6. MALDI Hedef üzerinde örnek Biriktirme <ol><li> Önceden hazırlanmış α-CHCA ince bir tabaka üzerinde protein örneğinin Deposit 0.5 ul. Hemen bundan sonra, matris solüsyonu (örneğin, SA çözelti ya da α-CHCA çözelti ya da &quot;CHCA_DHB mix&quot;), 0.5 ul ekleyin. Bu durum, hedef numune ve karıştırma matrisi ifade eder. </li></ol> Not: Genellikle bir 1:1 oranında matris ile protein örnek karıştırır. Bu oran MALDI spektrumlarının kaliteli için çok önemlidir. Farklı örnek konsantrasyonları test etmek isterseniz, size örnek sulandırmak için ACN_formic asit çözeltisi (yukarıda açıklanan) kullanabilirsiniz. Not: Eğer tercih ederseniz, bir tüpün içinde örnek ve matris karıştırın ve daha sonra karışık &quot;sample_matrix çözüm yatırabilirsinizince bir tabaka ile ilgili bilgiler de &quot;. Not: Biz örnek seyreltilmesi size kirleticilerin paraziti azaltmak için izin verir, çünkü farklı örnek konsantrasyonları test öneririz. Numunesinin seyreltilmesi için, numunenin seyreltilmesi ACN_formic asit çözeltisi (yukarıda tarif edilen) kullanabilir. 7. Kalibrant Biriktirme <ol><li> Mevduat kalibrant standardının 0.5 ul (örneğin &quot;standart protein II&quot;, Bruker Daltonics, Bremen) sonra matris solüsyon 0.5 ul ekleyin. </li></ol> Not: Protein örnek noktalar yanında MALDI plakasının (tartışma) hakkında kalibrant yükleyin. 8. Kalibrant MALDI Spectra kazanılması ve Protein Örnekleri Örnekler ve kalibrant kurutulur sonra, mikroskop altında &quot;noktalar&quot; gözlemleyebilirsiniz. Bu gözlem, isteğe bağlıdır ve acemiler için özellikle ilginç olabilir. Örnek spektrumları elde etmek için, inci eklemeke MALDI-TOF aracı hedef ve ekipman her tür için farklı uygun enstrümantal parametreleri seçin. En uygun set-up almak için tek üretici önerileri takip etmeli. Sağlam proteinlerin analiz Genelde hususlar olarak, bir (analizleri peptidler için uygun değildir reflektör modunda), doğrusal modda aracı kullanmak gerekir. Normalde biz pozitif iyon modunda bizim aleti kullanmaktadır. Ayrıca, önemli bir parametre etkili çözünürlüğünü artırır 31 &quot;pulsed iyon çıkarma&quot; dir. Basitçe, &quot;pulsed iyon çıkarma&quot; örnek iyonlarının oluşturulması ve iyonlar, detektör doğru hızlandırılır ve zaman arasında bir duraklama olarak tanımlanabilir. Dokunulmamış proteinleri analiz ederken, bir peptid gözlem zaman daha büyük bir &quot;atımlı iyon çıkarma&quot; (örneğin 500 nsn) ile nano kullanılabilir (örneğin 80 nsn) ile nano. Olmalıdır Uygun m / z aralığı seçin, spektrumları o kazanırf kalibrant ve aleti kalibre edin. Eğer örneklerin spektrumları elde zaman, uygun lazer yoğunluğunu (tartışma) kullanın.

<ol>
	<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography : Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Cohen, S. L., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+tool+for+protein+crystallography.">Mass spectrometry as a tool for protein crystallography.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 30, 67-85 (2001).</li><li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry--a+useful+tool+for+the+protein+X-ray+crystallographer+and+NMR+spectroscopist.">Mass spectrometry--a useful tool for the protein X-ray crystallographer and NMR spectroscopist.</a> Structure. 2, 465-467 (1994).</li><li>Gans, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+isotopic+labeling+of+methyl+groups+for+NMR+spectroscopic+studies+of+high-molecular-weight+proteins.">Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic studies of high-molecular-weight proteins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49, 1958-1962 (2010).</li><li>Wilm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+electrospray+ionization.">Principles of electrospray ionization.</a> Molecular &amp; cellular proteomics : MCP. 10, M111 009407 (2011).</li><li>Urban, P. L., Amantonico, A., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-plate:+extending+the+functionality+of+MALDI-MS+and+LDI-MS+targets.">Lab-on-a-plate: extending the functionality of MALDI-MS and LDI-MS targets.</a> Mass spectrometry reviews. 30, 435-478 (2011).</li><li>De Hoffmann, E., Stroobant, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry: Principles and Applications. , (2007).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical chemistry. 60, 2299-2301 (1988).</li><li>Spengler, B., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+of+proteins+above+100,000+daltons+by+pulsed+ion+extraction+time-of-flight+analysis.">Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis.</a> Analytical chemistry. 62, 793-796 (1990).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+molecular+mass+determination+of+proteins+using+matrix-assisted+laser+desorption+mass+spectrometry.">High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry.</a> Analytical chemistry. 62, 1836-1840 (1990).</li><li>Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+of+biopolymers.">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers.</a> Analytical chemistry. 63, 1193A-1203A (1991).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass-spectrometry+of+proteins.">Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins.</a> Methods in enzymology. 270, 519-551 (1996).</li><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+increase+contaminant+tolerance+in+protein+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+by+the+fabrication+of+thin+protein-doped+polycrystalline+films.">A method to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization by the fabrication of thin protein-doped polycrystalline films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li><li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+detergent-friendly+method+for+mass+spectrometric+analysis+of+integral+membrane+proteins.">A robust, detergent-friendly method for mass spectrometric analysis of integral membrane proteins.</a> Analytical chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li><li>Fenyo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+sample+preparation:+the+ultra+thin+layer+method.">MALDI sample preparation: the ultra thin layer method.</a> J. Vis. Exp.. (3), e192 (2007).</li><li>Gabant, G., Cadene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+full-length+integral+membrane+proteins+to+define+functionally+relevant+structural+features.">Mass spectrometry of full-length integral membrane proteins to define functionally relevant structural features.</a> Methods. 46, 54-61 (2008).</li><li>Hook, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains.">Long range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 33045-33054 (2005).</li><li>Vorm, O., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+sequence+information+derived+by+partial+acid+hydrolysis+and+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry.">Peptide sequence information derived by partial acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> Biological mass spectrometry. 23, 734-740 (1994).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cinnamic+acid+derivatives+as+matrices+for+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+proteins.">Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 432-435 (1989).</li><li>Madler, S., Boeri Erba, ., E, R., Zenobi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+Studying+Noncovalent+Complexes+of+Biomolecules.">MALDI-ToF Mass Spectrometry for Studying Noncovalent Complexes of Biomolecules.</a> Topics in current chemistry. , (2012).</li><li>Wortmann, A., Pimenova, T., Alves, S., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+first+shot+phenomenon+in+MALDI+mass+spectrometry+of+protein+complexes.">Investigation of the first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry of protein complexes.</a> The Analyst. 132, 199-207 (2007).</li><li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-assisted+Laser+Desorption+Mass+Spectrometry.">Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry.</a> Organic Mass Spectrometry. 27, 156-158 (1992).</li><li>Liu, Z., Schey, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+MALDI+TOF-TOF+mass+spectrometer+for+intact+protein+analysis.">Optimization of a MALDI TOF-TOF mass spectrometer for intact protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16, 482-490 (2005).</li><li>Gorka, J., Bahr, U., Karas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphite+supported+preparation+(GSP)+of+alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+(CHCA)+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+(MALDI-MS)+for+peptides+and+proteins.">Graphite supported preparation (GSP) of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) for peptides and proteins.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1949-1954 (2012).</li><li>Laugesen, S., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+two+matrices+results+in+improved+performance+of+MALDI+MS+for+peptide+mass+mapping+and+protein+analysis.">Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14, 992-1002 (2003).</li><li>Sparkman, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Desk Reference. , (2000).</li><li>Kussmann, M., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+techniques+for+peptides+and+proteins+analyzed+by+MALDI-MS.">Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS.</a> Methods Mol Biol. 146, 405-424 (2000).</li><li>Wang, R., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+mass+measurement+as+a+tool+for+studying+proteins.">High-accuracy mass measurement as a tool for studying proteins.</a> Current opinion in biotechnology. 5, 77-84 (1994).</li><li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry.">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (40), e1954 (2010).</li><li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry.">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nature protocols. 2, 715-726 (2007).</li><li>Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+extraction+matrix-assisted+laser+desorption+time-of-flight+massspectrometry.">Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight massspectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, 1044-1050 (1995).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz, bir MALDI-TOF cihazı kullanılarak, 100 kDa&#39;dan daha büyük molekül ağırlıklarına sahip olan çok sağlam proteinlerin yüksek kaliteli kütle spektrumu elde etmek için bir ayrıntılı protokol sundu. Numune hazırlanmasına ilişkin kritik yönleri bir dizi dikkatle kütle spektrumları kalitesini artırmak amacıyla dikkate alınmalıdır. Matrisler ve çözücüler içinde mevcut tüm kirleticileri çözücü buharlaştırma sonra MALDI hedef üzerinde konsantre edilir, çünkü Matrisler ve yüksek saflıkta, çözücüler, kritik bir önem taşımaktadır. MALDI matrislerin saflığını arttırmak için (yukarıda bakınız) klasik tekrar kristalleştirme yöntemleri kullanarak bunları arındırmak mümkündür. Biz de taze matris kristalleşmesi iyileştirecek ve matris bozulmasını önlemek için (en azından haftada bir kez) matrisler çözümlerin hazırlanması için tavsiye. Matris yerleştirme yaklaşım spektrumlarının nihai kalitesi için çok önemlidir. Yukarıda tarif edildiği gibi, ince tabaka yöntem eden yöntem o olduğunuf seçim 12. Ayrıca, biz ilk tabakasının bırakılması için optimize edilmiş bir yaklaşım. Matris doymuş bir çözelti elde etmek için aseton içinde çözülür, propanon çözücünün hızla buharlaşmasına izin verir, fakat aynı zamanda kontrol etmek için birinci tabakanın boyutu çok zor hale getirir. Size hızlı bir şekilde hedefe yatırmak minimum hacim elde matrix_acetone çözüm daldırma küçük fırça gibi bir GELoader ucu kullanmanızı öneririz. Birinci tabakanın büyüklüğü şekilde MALDI nokta nihai boyutunu kontrol eder Bu durumda, numune konsantrasyonu geniş bir nokta durumunda daha yüksek olduğu için, küçük bir nokta (çapı örneğin 0.5-0.75 mm) tercih edilir. Küçük bir nokta elde etme önce bir JOVE videoda 15 önerilen ultra-ince tabaka yaklaşımı farklıdır. Fenyo ve ark. Ince tabaka çözelti, her bir pipet ucu yan kullanılarak MALDI hedef üzerinde yayılır. Bu yaklaşım, belirli kriterlere uygun olmalıdır ince bir tabaka test gerektirir(Çözücü buharlaşma örneğin hız). Kriteri karşılanmazsa, MALDI hedef yıkanmalı ve yeni bir ince tabaka hazırlanmalıdır. Bu, bir acemi için hazırlık oldukça zahmetli hale getirir. Ayrıca, plaka üzerinde örnek / matris karışımının çökelmesi Fenyo ve diğerleri. Müstahzar eden bir yaklaşım biraz daha zor hale, bir vakum hattı ve 15 TFA kullanarak bir yıkama aşaması kullanılarak fazla solventin ortadan aspirasyon gereklidir gerektirir. Matrisin ve örnek arasındaki hacim oranı MALDI-TOF ile sağlam proteinlerin bir başarılı bir analizi için oldukça önemlidir. Farklı oranlarını test sonra 1:1 oranı kullanmanızı öneririm. Farklı bir matris: örnek oranı nedeniyle muhtemelen homojen olmayan kristalinizasyona spektrumlarının kalitesini tehlikeye atabilir. Matris ve örnek tevdi edildiği sırası da önemlidir. Matris ince bir tabaka yatırma sonra, numune yatırılır ve hemen SAMP önce (sonrale spot) kuru olur CHCA_DHB karışımı ilave edilir. Bu işlem, tek başına iki örnek matris tabaka arasında yatırılır &quot;sandviç yöntemi&quot; 27 olarak ifade edilmiştir. Bir alternatif olarak, CHCA_DHB çözeltisi ve örnek 0.5 ml bir tüp içinde karıştırılabilir ve daha sonra ince bir tabaka CHCA 12 gördü. Bu, yüksek kalite spektrumlarında edilen kristallerin homojen tabakası ile bir nokta üretmektedir. Bu keskin tepe üretebilir, ancak ölçüm hassasiyeti (daha az şiddetli pikler) tehlikeye;: a kütle daha düşük 100 kDa, DHB &#39;nin konsantrasyonu ile proteinlerin analiz ederken (örn. 60:40 CHCA DHB) artırılabilir. Doğru alet kalibrasyonu için, daha iyi bir kitle doğruluğu elde etmek için izin, örnek noktalar çok yakındır kalibrant standartlarını yatırmak gereklidir. Bir &quot;sözde dahili kalibrasyon prosedürü&quot; Daha önce 15 önerildi: örnek bir spektrum, kalibrant nokta i kazanılmasından sonrakalibran s lazer atış ve sinyal örnek spektrum eklenir. Bu dahili kalibrant doruklarına kullanarak örnek spektrumu kalibre sağlar. Lazer enerjisi de dikkatle spektrumları elde edilmesi sırasında kontrol edilmelidir. Çoğu durumda, daha yüksek enerji duyarlılığını artırır ancak çözünürlüğü düşürür. Biz satın alma hassasiyeti ödün vermeden mümkün olan minimum lazer enerjisini kullanmanızı öneririz. Ayrıca, spektral kalitesini artırmak için, birer numune noktada daha fazla çekim edinebilirler. Normal olarak, daha fazla çekim size (1,000-2,000 çekim) kazanmak, sinyalin yoğunluğu artar. Lazer ile nokta isabet zaman, bir numune homojen olarak dağılmış olmadığından, doğru pozisyonda (yani &quot;sweet spot&quot;) bulmak gerekiyor. Sen sinyal arttıkça kadar aynı alanda ateş, ve sonra numuneyi içeren başka bir alan bulmak için deneyebilirsiniz. Matris ve SOLV bir sonuç, yüksek saflıktaveliler, örnek ve hedef matris birikimi için kullanılan yöntemler, kalibrasyon, lazer enerjisinin şiddeti, satın alma zamanında (çekim / nokta sayısı) için kullanılan standartların pozisyon biri dikkate almalıdır kritik faktörlerdir MALDI-TOF MS ile analiz sağlam proteinler. Yazar Katılımlar LS ve EBE, deneyler tasarlanmış kütle spektrometresi deneyler, verileri analiz ve el yazması yazdı.

Yapısal biyoloji, yüksek kaliteli protein 1 üretimine dayanır ve bu nedenle protein analiz 2,3 için etkin ve güvenilir bir teknikleri ile akuple edilmesi gerekmektedir. Yapısal biyoloji bir enstitü içinde bizim kütle spektrometresi (MS) laboratuvar biz proteinlerin primer dizisini teyit etmek gerekir, mutasyonlar ve sonrası tadilatların varlığını değerlendirmek, proteinlerin bozulması, örnek homojenlik ve izotopik etiketleme kalitesi (örneğin döteryumlu nükleer manyetik rezonans çalışmaları için protein 4). Yapısal biyologlar esnek parçalardan yapısal sert etki ayırt etmek için sınırlı proteolizini kullanabilirsiniz yana, biz güvenilir MS kullanarak bu tür kesik proteinleri karakterize etmek gerekir. Biomoleküller MS ile analiz edildiğinde, iki olası yaklaşım yumuşak, ağır ve kararsız molekülleri iyonize için kullanılmaktadır. Elektrosprey iyonizasyon (ESI) doğrudan moleküllerini iyonizeSıvı faz, 5, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) biyomoleküllerin ultraviyole emici organik moleküller (örneğin, matris moleküller) 6 ile birlikte kristalize gerektirir. O (ppm ≤ 50) yüksek doğruluk ile kütle kararlılık sağlar, çünkü ESI time-of-flight (TOF) MS sıvı kromatografisi bağlanmış, bozulmamış proteinlerin analizi için rutin bir teknik olmuştur. Bununla birlikte, (tuzları ve deterjanlara, özellikle) numune tampon bileşimine ve analit sinyalinin bastırılması neden bazen ortadan kaldırmak zordur kirletici maddelerin (örneğin, polimerler) oldukça hassastır. MALDI-TOF MS performansı daha az tampon bileşenleri, deterjan ve kirletici maddeler ile etkilenir, çünkü ESI-MS için etkili bir alternatif temsil eder, ve sekans doğrulama için (500 ppm ≤) yeterli bir hassasiyetle sağlam protein kütle belirlenmesini sağlar. Protei sonran sindirim, MALDI-TOF MS da adlandırılan &quot;peptit kütle parmak izi&quot; ile, bundan başka, primer sekans teyidi için elde edilen peptidleri analiz etmek için kullanılabilir. Elimizde olanlar, 100 kDa&#39;dan daha büyük ve (nedeniyle, modifikasyon veya kesikler için) heterojen sağlam proteinler, kütle tayini, ESI-MS ile daha MALDI-MS ile daha kolaydır. Bu ESI spektrumları mevcuttur örtüşen şarj durumu dağıtımların eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Ayrıca, MALDI işlem analit boyutu 7, bu tür bir yöntem, yüksek verimler duyarlılık bağlı olmadığı bir biyomolekül kütle 100 kDa&#39;lık üzerinde olduğunda. Sağlam proteinler Olağanüstü analizleri 1980&#39;li yılların sonu ve 1990&#39;lı 8-11 başlangıcı arasında ev yapımı enstrümanları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu numune hazırlama için daha az zaman gerektirir ve interferon karşı daha az hassas olduğu için MALDI-TOF, protein numunelerinin kalitesini değerlendirmek için bir tarama aracı olarak kullanılabilirOrtak yabancı madde (örneğin, tuzlar) nedeniyle ces. MALDI-MS ile bir birinci, hızlı değerlendirme sonra, numune daha yüksek bir doğruluk ile kendi kütlesinin belirlenmesi için ESI-TOF ile analiz edilebilir. Ayrıca, MALDI ESI daha az masraf içeren iyon üretir ve bu nedenle daha basit MALDI veri olduğunu edinme ve yorumlama. Bu yapısal biyoloji çalışan öğrenciler, sadece kısa bir eğitimden sonra kendi rekombinant proteinleri analiz etmeyi sağlar. Matris ve matris birikimi (örneğin, kurutuldu damlacık 8 ve ince tabaka 12-16,17,18) için yaygın olarak kullanılan teknik: Two önemli faktörler MALDI spektrumları kalitesini etkiler. Tek bir organik matris [örn sinapinik asit (SA), 19-21 ya da α-siyano-4-hidroksisinamik asit (α-CHCA) 14,22,23] genellikle sağlam proteinler ve çapraz bağlanmış protein komplekslerinin MS incelenmesi için kullanılır . Α-CHCA kullanarak, Chait grup daha önce p için ayrıntılı bir protokol sunduönce eriyebilir ve membran proteinlerinin 14,15 MALDI analizine ultra ince bir tabaka reparing. Son zamanlarda, Gorka et al. Matris 24 ile α-CHCA kullanılarak peptidlerin ve proteinlerin analizi MALDI geliştirmek için grafit bazlı hedef kaplama gösterilen. 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) ve α-CHCA 25: Burada, iki matris bir karışımının kullanılması ile, MALDI-TOF MS ile sağlam proteinlerin analizi için bir protokol mevcut. Sistematik olarak sağlam proteinlerin kontrolü için, SA ve α-CHCA matrisleri ile karşılaştırıldığında DHB-CHCA karışımı performansını değerlendirildi. Matris karışımı daha iyi bir çözünürlük (protein zirveleri çok daha nettir yani) sağlar. Ayrıca, birden fazla yoğun ücretleri iyonların varlığı (örneğin, M +2 H 2 +, M +3 H 3 +, vb) eksenel MALDI-TOF araçların çözünürlüğü ücret üzerinden daha düşük kütle daha yüksek olduğu için (daha doğru bir kütle belirlenmesini sağlarm / z) 26. Bu, 100 kDa&#39;dan daha büyük proteinlerin molekül ağırlığının belirlenmesi için özellikle yararlıdır. Yüksek hassasiyet de DHB-CHCA karışımı (MALDI hedef üzerinde lekeli protein 0.5 pmol) kullanılarak ulaşılır. Yukarıda belirtildiği gibi, alet kullanılarak MALDI dikkat edilmesi gereken önemli bir faktördür matris birikmesidir. Laugesen et al. Kurutuldu damlacık birikmesini kullanarak, ilk kez için 25 DHB-CHCA karışımının kullanımını önermiştir. Biz ilk tabaka, aseton içinde çözülmüş α-CHCA ile oluşturulur, ince tabaka yöntem kullanılmıştır, ancak, daha iyi sonuçlar (örneğin, daha yüksek hassasiyet) görülmektedir. İnce tabaka bir yöntem, daha önce 12,27, 15, bir video Jüpiter tanımlanmıştır MALDI hedef üzerinde matris kristaller homojen bir alt tabaka oluşmasını ifade eder. Daha sonra, numune son olarak, bu alt tabaka üzerine bırakılır, veEk matris (aşağıya bakınız) yatırılır. Bu makalede, aynı zamanda MALDI hedef örnek yatırmak için nasıl göstermek değil, aynı zamanda hedef 15 temizlemek için nasıl yeniden kristalize etmek ve matrisler hazırlar. Hepimiz (özellikle, yapısal biyologlar) bilim adamları, dokunulmamış proteinleri analiz için gerekli bilgileri hızlı ve basit bir şekilde üretilen proteinlerin kalitesini değerlendirmek gerekiyor ve kim sağlamayı hedefliyoruz sonuçlandırmak için MALDI-TOF MS ile çok aşina değil. 1990&#39;ların 28 olarak tahmin, MS biyologlar onun erişilebilirlik artmış gibi, biyolojik araştırma üzerinde artan bir etkisi oldu. Biz sağlanan bilgilerin kütle spektrometresi kullanarak başlamak istiyorum biyolog ve bilim adamlarına MALDI-TOF erişilebilir yapmak için yararlı olacağını umuyoruz.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizima</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin 6 chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0122</td>
			<td>various molecular weight cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>02860</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>05511</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>39319</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 001.222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09676</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Standard II</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>207234</td>
			<td>It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoglobulin G</td>
			<td>ABSciex</td>
			<td>GEN602151</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier PURELAB Ultra Analytic</td>
			<td>ELGA LabWater</td>
			<td>89204-052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (maldi-tof) mass spectrometric analysis of intact proteins larger than 100 kda

Etkili proteinlerin kitleleri belirleme (yapısal biyoloji araştırmaları için örneğin) birçok biyolojik çalışmalar için önemlidir. Doğru kütle tayini bir protein primer sekanslarının doğruluğunu değerlendirmek sağlar, mutasyonları ve / veya post-translasyonel modifikasyonlar, olası protein bozulması, örnek homojenliği ve etiketleme durumunda izotop dahil derecesine (ör. 13 ° C etiketleme varlığı .) Elektrosprey iyonizasyon (ESI) kütle spektrometresi (MS), yaygın olarak denatüre proteinlerin kütle tespiti için kullanılır, ancak verimliliği örnek tampon kompozisyonu tarafından etkilenmektedir. Özellikle de, tuzlar, deterjan ve kirleticilerin varlığı ciddi ESI-MS ile analiz protein etkinliğini zayıflatır. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) MS nedeniyle tuzu tolerans ve veri edinme ve yorumlanmış basitliği için çekici bir alternatiftirtion. Dahası, büyük heterojen bir protein (büyük 100 kDa) kütle spektrumları belirlenmesi nedeniyle ESI içinde mevcut olan yüksek şarj durumu dağılımlarının üst üste yokluğu için MALDI-MS ile daha kolaydır. Burada flight (TOF) MALDI-zaman 100 kDa&#39;dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşım sunuyoruz. İki matris (yani 2,5-dihidroksibenzoik asit ve α-siyano-4-hidroksisinamik asit) oluşan bir karışım ve örnek tevdi edilmesi için bir yaklaşım olarak, ince tabaka yöntemin kullanımını kullanmanın avantajları göstermektedir. Ayrıca lazer enerjisinin kalibrasyonu için kullanılan standartların matris ve çözücü saflığı önemli bir rol, tartışmak ve satın alma zaman. Genel olarak, MALDI-MS ile 100 kDa&#39;dan daha büyük proteinlerin analiz etmek için sağlam bir acemi için gerekli bilgileri sağlar.

Iki farklı matrisler, iki çökeltme yöntemleri ve aynı lazer yoğunluk (Şekil 1) kullanılarak,:, biz dokunulmamış protein (123.386 Da molekül ağırlığı kromozom bölgesi bakım 1 protein, Crm1) analiz edilmiştir. SA ve CHCA_DHB karışım matrisleri gibi kullanılmıştır. Karışım (Şekil 1A ve B) gürültü oranı sinyal-ve hassasiyet açısından yüksek kalitede kütle spektrumları elde edilmiştir. Özellikle, MALDI hedef (Şekil 1C) üzerinde biriken protein, 0.5 pmol saptayabildi. Proteinin aynı miktarda SA (Şekil 1D) kullanılarak sonrasında ancak dedekte edilebilmiştir. Ayrıca, matrisler karışımı kullanılarak, matris depozisyonu için tercih edilen bir yöntem olup, &quot;ince tabaka&quot; yaklaşımı (Şekil 1A) idi. &quot;Kuru damla&quot; yöntemi kullanarak, daha yüksek bir kütle 100 kDa (veriler gösterilmemiştir) sahip herhangi bir proteinin tespit etmedi. CHCA_DHB karışımı (Şekil 1A ve 1C) kullanarak, çarpma Protei iyon ücretn eksenel MALDI-TOF araçlar tepe çözünürlük, m / z 26 ile ters orantılı olduğundan, daha yüksek bir doğruluk ile kütle kararlılık sağlayan gözlenmiştir. Ayrıca monomerik beta-galaktosidaz (116.300 Da) (Şekil 2) ile analiz edilir. CHCA_DHB spektrumları hassasiyet ve çözünürlük açısından SA spektrumları daha iyi idi. Ayrıca, çok yüklü iyonların (M + 2, 3 M + ve M + 4) varlığının bize daha yüksek doğrulukla, proteinin kütlesini (Şekil 2A ve 2C) onaylamak için bırakıldı. Ince tabaka yaklaşımı kullanarak, bir immünoglobulinin, IgG analizi (148.500 Da) (Şekil 3) için CHCA_DHB karışım, SA ve tek başına α-CHCA performansını karşılaştırıldı. Biz farklı verileri ilişkili olduğunda, protein sinyalleri yüksekti ve CHCA_DHB spektrumları daha iyi çözünürlüğe sahip. Sonuç olarak, karışım CHCA_DHB ve ince tabaka yerleştirme yönteminin kullanılması<html> bir MALDI TOF aleti kullanılarak elde edilen çok sağlam protein kütle spektrumlarının kalitesinde önemli gelişmeler göstermiştir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" /> Şekil 1. 123.386 Da: dokunulmamış Kromozom bölgesi bakım 1 proteini, (Crm1), molekül ağırlığı, MALDI-TOF analizi. . Crm1 A) 1 pmole matris B) miktarı olarak DHB_CHCA karışımı kullanılarak analiz edildi: 1 pmole; matris:. SA C) miktarı: 0.5 pmol; matris:. DHB_CHCA D) miktarı: 0.5 pmol; matris: SA. Tepe sinyal, keyfi bir ölçek birim yoğunluk olarak ifade edilmiştir, her bir spektrum içinde en yüksek değer mevcut normalize edilir. pg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Sağlam beta-galaktosidaz (116.300 Da) MALDI-TOF analizi. A) miktarı: 20 pmol; matris DHB_CHCA B) miktarı:. 20 pmol; matris:. SA C) miktarı: 5 pmol; matris:. DHB_CHCA D) miktarı: 5 pmol; matrisi: SA. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" /> Şekil 3,. Bozulmamış bir immünoglobülin, IgG (148.500 Da) MALDI-TOF analizi, miktarı:. 1.7 pmol spektrumları CHCA_DHB karışımı ile elde edilen çok daha yoğun olan (maksimum: 8200 keyfi birim, au) SA spektrumları fazla (en fazla 1.200 au) ve α-CHCA spektrumları (maksimum: 4500 au)

Watch this Scientific Journal Video about Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa at JoVE.com

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Doğru kütle ölçüm proteinlerin soruşturma sırasında önemli bir adımı temsil etmektedir. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS) gibi tespiti için kullanılabilir ve önemli avantajı tuzları, deterjan ve kirleticilere karşı tolerans. Burada MALDI-MS ile 100 kDa&#39;dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşımı göstermektedir.

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

matrix-assisted-laser-desorptionionization-time-flight-maldi-tof-mass

Research

JoVE Journal

Chemistry

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

80.1K Görüntüleme.  Université J. Fourier.  Doğru kütle ölçüm proteinlerin soruşturma sırasında önemli bir adımı temsil etmektedir. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS) gibi tespiti için kullanılabilir ve önemli avantajı tuzları, deterjan ve kirleticilere karşı tolerans. Burada MALDI-MS ile 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşımı göstermektedir. 

Video: Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune system that is protective against pathogenic microbes. Abnormal sebum production and chemical composition are also a clinical symptom of specific skin diseases. Sebum contains a complex mixture of lipids, including triacylglycerides, which is species-specific. The broad chemical properties exhibited by diverse lipid classes hinder the specific determination of sebum composition. Analytical techniques for lipids typically require chemical derivatizations that are labor-intensive and increase sample preparation costs. This paper describes how to extract lipids from mammalian integument, separate broad lipid classes by thin-layer chromatography, and profile the triacylglyceride contents using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. This robust method enables a direct determination of the triacylglyceride profiles among species and individuals, and it can be readily applied to any taxonomic group of mammals.

Mammalian integument contains solvent-extractable lipids that can provide chemical compositions characteristic of individual species. This paper presents a routine method for separating broad lipid classes isolated from integumentary tissues using thin layer chromatography and determining the triacylglyceride profile by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.

Hazırlayıcı ince tabaka kromatografisi ve MALDI-TOF kütle spektrometresi ile Bat Örtü Lipidler triasilgliseridler İçeriği profil

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Kimya

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Kitle Spektrometrik Liyofilize Toz Protein Yapısı ve Etkileşimler Eğitim Yaklaşımları

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

İkincil Nanoelectrospray iyonlaşma kullanarak gerçek zamanlı nefes analiz için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group analysis as matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This tutorial demonstrates methods for optimization of the sample preparation, spectral acquisition, and data analysis of synthetic polymers using MALDI-TOF MS. Critical parameters during sample preparation include the selection of the matrix, identification of an appropriate cationization salt, and tuning the relative proportions of the matrix, cation, and analyte. The acquisition parameters, such as mode (linear or reflector), polarization (positive or negative), acceleration voltage, and delay time, are also important. Given some knowledge of the chemistry involved to synthesize the polymer and optimizing both the data acquisition parameters and the sample preparation conditions, spectra should be obtained with sufficient resolution and mass accuracy to enable the unambiguous determination of the end groups of most homopolymers (masses below 10,000) in addition to the repeat unit mass and the overall molecular weight distribution. Though demonstrated on a limited set of polymers, these general techniques are applicable to a much wider range of synthetic polymers for determining mass distributions, though end group determination is only possible for homopolymers with narrow dispersity.

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

A protocol for the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) characterization of synthetic polymers is described including the optimization of sample preparation, spectral acquisition, and data analysis.

Matris ile sentetik polimerler karakterizasyonu Lazer Desorpsiyon iyonlaşma zaman uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi destekli

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is the method of choice in carbohydrate analysis, poor ion signal and data reproducibility of carbohydrate samples continue to be severe problems. For quantitative analysis of carbohydrates, an effective analytical protocol providing superior data quality is necessary. This video demonstrates sample preparation protocols to improve signal intensity and minimize data variation of carbohydrates in MALDI-MS. After drying and crystallization of sample droplets, the crystal morphology is reformed by methanol before mass spectrometric analysis. The enhancement in carbohydrate signal is examined with MALDI imaging mass spectrometry (IMS). Experimental results show that crystal reformation adjusts crystalline structures and redistributes carbohydrate analytes. In comparison with the dried droplet preparation method in conventional MALDI-MS, reforming carbohydrate crystal morphologies with methanol shows significantly better signal intensity, ion image distribution, and data stability. Since the protocols demonstrated herein do not involve changes in sample composition, they are generally applicable to various carbohydrates and matrixes.

A protocol for enhancing carbohydrate ion signals in MALDI mass spectrometry by reforming crystalline structures during sample preparation processes is demonstrated.

Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi karbonhidrat iyon sinyalleri geliştirmek için bir verimli örnek hazırlama yöntemi

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

Uçuş süresi Ikincil Iyon kütle spektrometresi kullanılarak metal-Paint arayüzünde görüntüleme korozyon

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

Kümelenme Sonucu Desorpsiyon/İyonlaşma Kütle Spektrometresi Yoluyla Karmaşık Moleküllerin ve Yüzeylerdeki Reaksiyonlarının Analizi

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain using antibiotic induction, and identified by MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. The immunity protein of colicin E3 (Im3) and the immunity protein of bacteriocin (Im-Bac) were identified from prominent b- and/or y-type fragment ions generated by the polypeptide backbone cleavage (PBC) on the C-terminal side of aspartic acid, glutamic acid, and asparagine residues by the aspartic acid effect fragmentation mechanism. The software rapidly scans in silico protein sequences derived from the whole genome sequencing of the bacterial strain. The software also iteratively removes amino acid residues of a protein sequence in the event that the mature protein sequence is truncated. A single protein sequence possessed mass and fragment ions consistent with those detected for each immunity protein. The candidate sequence was then manually inspected to confirm that all detected fragment ions could be assigned. The N-terminal methionine of Im3 was post-translationally removed, whereas Im-Bac had the complete sequence. In addition, we found that only two or three non-complementary fragment ions formed by PBC are necessary to identify the correct protein sequence. Finally, a promoter (SOS box) was identified upstream of the antibacterial and immunity genes in a plasmid genome of the bacterial strain.

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Here we present a protocol for the rapid identification of proteins produced by genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. Metastable protein ions fragment because of the aspartic acid effect and this specificity is exploited for protein identification.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve Yukarıdan Aşağıya Proteomik Analiz kullanılarak Escherichia coli'de Antibakteriyel Bağışıklık Proteinlerinin Tanımlanması

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometrisi ile Proteinlerin Konformasyonel Karakterizasyonu için Kapiler Elektroforez Bazlı Hidrojen/Döteryum Değişimi

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and response to external stressors. Yet, the biochemical mechanisms and full complement of neuropeptides and their functional roles remain poorly understood. Characterization of these endogenous peptides is hindered by the immense diversity within this class of signaling molecules. Additionally, neuropeptides are bioactive at concentrations 100x - 1000x lower than that of neurotransmitters and are prone to enzymatic degradation after synaptic release. Mass spectrometry (MS) is a highly sensitive analytical tool that can identify, quantify, and localize analytes without comprehensive a priori knowledge. It is well-suited for globally profiling neuropeptides and aiding in the discovery of novel peptides. Due to the low abundance and high chemical diversity of this class of peptides, several sample preparation methods, MS acquisition parameters, and data analysis strategies have been adapted from proteomics techniques to allow optimal neuropeptide characterization. Here, methods are described for isolating neuropeptides from complex biological tissues for sequence characterization, quantitation, and localization using liquid chromatography (LC)-MS and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MS. A protocol for preparing a neuropeptide database from the blue crab, Callinectes sapidus, an organism without comprehensive genomic information, is included. These workflows can be adapted to study other classes of endogenous peptides in different species using a variety of instruments.

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Mass spectrometric characterization of neuropeptides provides sequence, quantitation, and localization information. This optimized workflow is not only useful for neuropeptide studies, but also other endogenous peptides. The protocols provided here describe sample preparation, MS acquisition, MS analysis, and database generation of neuropeptides using LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting, and MALDI-MS imaging.

Callinectes sapidus'ta Nöropeptitlerin Çok Yönlü Kütle Spektrometrik Araştırması

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...