Lazersiz hidroksil radikal protein ayak izi, protein etkileşim alanlarını ve onay değişim bölgelerini tanımlamayı çok daha kolay hale getirerek protein toplama, yapı ve stabilite çalışmalarındaki araştırmaları hızlandırır. Satır içi radikal dozimetri ile kullanıcılar etkili hidroksil radikal yükünü gerçek zamanlı olarak ayarlayabilir ve gerçek zamanlı radikal dozimetri ile etiketleme tekrarlanabilirliğini geliştirirken deneysel zamandan ve değerli numuneden tasarruf edebilirsiniz. Başlamak için, 250 mikrometre iç çaplı silika kılcal damarı bir silika sıkma taşı ile 27 inç'e bölün, kılcal damarın uçlarını temiz ve düz bir kesim için kontrol edin.
Kabaca 15 milimetre uzunluğunda iki pencere oluşturun. Kılcal damarın alt ucundan, fotoliz penceresini oluşturmak için poliimid kaplamayı 90 milimetre ve dozimetre penceresi için 225 milimetreyi yakın. Kılcal damarın alt ucunu bir somun ve yüksük konik ucunun hemen ötesine yerleştirin.
Kılcal damarı beş numaralı bağlantı noktasına ekleyin, parmağın hemen ötesinde bir anahtarla sıkın. Fotoliz modülünün fotoliz hücre kapağını doğrudan dışarı çekerek çıkarın, ardından kılcal damarı yerinde tutacak manyetik olarak monte edilmiş metal maskeyi çıkarın. Soldaki sekmeye basarak dozimetre hücresini açın ve dozimetre hücresini sağa doğru açın.
Kılcal damarı yerinde tutacak manyetik olarak monte edilmiş klipsleri çıkarın. Daha sonra kılcal damarı fotoliz hücresinin tabanındaki yivli kanala yerleştirin ve kılcal pencereyi fotoliz hücre penceresiyle ortala. Kılcal damarı yerinde tutun ve manyetik maskeyi ekleyin.
Fotoliz kapağını yerine yerleştirin. Kılcal damarı dozimetre hücresinin tabanındaki yivli kanala yerleştirin ve ikinci kılcal pencereyi dozimetre hücresinin ortasındaki küçük diyafram açıklığına ortala. Kılcal damarı bir elinizle yerinde tutarken, iki manyetik klipsi kılcal damarı yerinde tutacak şekilde yerleştirin.
Dozimetre hücresini kapalı tıklatana kadar kapatın. Son olarak, kılcal damarı ürün toplayıcının kılcal kaldırmasının üzerine tırtıklı düğmeden geçirin ve kılcal damarı şişenin tabanının hemen üstüne uzatın. Bir kesici kullanarak teflon borunun istenen uzunluğunu kesin ve uçlarını temiz bir düz kesim için kontrol edin.
Yeni enjeksiyon döngüsünün bir ucunun bir ucunun somunlardan birine yerleştirin ve tüpün ucuna yeni bir yüksük yerleştirin. Boruyu enjeksiyon vanasının altıncı portuna yerleştirirken somunu ve yükseği, dibe vurana kadar yerinde tutun. Somunu bir İngiliz anahtarı ile sıkın, ardından somun ve yüksüklerin güvenli bir şekilde yerinde olduğunu onaylayın.
Her iki ucu da bir somun ve sabit yüksük olduğunda, bir ucunu üç numaralı bağlantı noktasına ve diğer ucunu altı numaralı bağlantı noktasına gevşek bir şekilde vidalayın. Pozisyon aldıktan sonra, her iki tarafı da sıkıca parmakla sıkın, ardından çeyrek bir anahtarla parmağı sıkıca geçin. Akışkanlar modülini başlatarak lazersiz HRPF sistemini açın, ardından fotoliz modülü, dozimetre modülü, ürün toplayıcı ve sistem bilgisayarı.
Sistem yazılımını başlatın. Boruyu şırınna pompasının valf konumundan 10 mililitre tampona tamamen batırın. Boruyu atık konumundan ve boruyu şırınna limanındaki ikinci bağlantı noktasından boş bir kaba yönlendirerek atık toplayın.
Ürün toplayıcı atlıkarınca üzerinde HN6 işaretli konuma 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüp yerleştirin. Valf yük konumuna ayarlanmış 25 mikrolitre HPLC sınıfı su enjekte ederek enjeksiyon döngüsünü beş kez durulayın. Sistemin geri kalanını yıkamak için enjeksiyon vanasını manuel olarak çevirin.
Damlacık oluşana kadar akan suya başlamak için kontrol yazılımında İşlem'i seçin. İki milimoler adenin ve 10 mikromoler protein içeren bir çözelti yapın. Daha sonra mililitre katalaz başına 0,3 miligram ve 35 milimoler metianine amide kullanarak bir söndürme çözeltisi yapın.
Aliquot 25 mikrolitre söndürme çözeltisi 200 mikrolitre mikro tüp içine. Hidrojen peroksit 200 milimolar seyreltin ve buzda tutun. Flaş voltajını kontrol yazılımında sıfır voltta başlatın.
Bu sıfır volt kontrolü, ilgi proteini üzerindeki herhangi bir arka plan oksidasyonunu belirleyecektir. Verileri Otomatik Sıfırla'yı başlat'ı ve ardından İşlem'i ve ardından Hazır'ı seçin. Son olarak, enjeksiyon vanasını yük konumuna getirin.
Söndürme solüsyonunu ürün toplayıcı atlıkarıncasına yerleştirin, ardından ürün şişesini sistem kontrol yazılımında bire değiştirin. Enjeksiyondan hemen önce, adenin ve protein karışımının 12,5 mikrolitresini 12,5 mikrolitre hidrojen peroksit ile karıştırın. Karışımı karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin, sonra hızla aşağı çevirin.
Karıştırmadan sonraki 10 saniye içinde enjeksiyon portu kullanarak bu çözeltinin 25 mikrolitresini enjekte edin. Enjeksiyon vanasını enjeksiyon konumuna getirin ve numune işlenirken bekleyin. Flaş voltajını kontrol yazılımında 750 volta açın ve etiketleme adımlarını tekrarlayın.
Ardından her numunenin emiciliğini kaydedin. İlk olarak, Seç'i tıklatın, sonra tepe emiciliğinin başlangıcını ve sonunu el ile seçin. Kullanılabilir alana, örneğin bir açıklamasını yazın.
Elde edilen tüm veriler için bunu yineleyin. Her voltaj için adenin emiciliğindeki ortalama değişimi hesaplamak için verileri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın. Tüm numuneler toplandıktan sonra, enjeksiyon vanasını yük konumuna indirerek şırınga portunu ve numune döngüsünü boşaltın ve beş kez 25 mikrolitre HPLC suyu enjekte edin.
Sistemin geri kalanını HPLC suyuyla yıkamak için enjeksiyon vanasını enjeksiyon konumuna getirin. Temizlendikten sonra akışı durdurun, sistem kontrol yazılımından çıkın ve ürün toplayıcı, dozimetre modülü, fotoliz modülü ve son olarak akışkanlar modülü ile başlayarak modülleri kapatın. Oksidasyon üzerine, dozimetri için kullanılan adenin 265 nanometrede UV emiliminde azalır.
Buffer 2, Tampon 1'e kıyasla adenin absorbansındaki değişimi azaltan radikal bir çöpçü içerir. Apomyoglobin, hidrojen peroksit ve adenin varlığında dört artan plazma lamba geriliminde modifiye edildi. 265 nanometrede adenin emiliminin değişimine bağlı olarak oksidasyonda doğrusal bir artışla altı peptit tespit edildi.
Bu altı oksitlenmiş peptit miyoglobin kristal yapısı üzerinde etiketlenmiştir. Yüksek basınçlı plazma lambadan tespit edilen oksidasyonun boyutu lazer tabanlı yöntemden çok daha yüksektir. Bu artış, yüksek basınçlı plazma lambasının geniş spektrumlu UV emisyon spektrumundan kaynaklanmaktadır.
Geniş bir UV spektrumu üreterek, yüksek basınçlı plazma lambası hidrojen peroksitin absorbans alanıyla daha iyi örtüşür ve kr F Excimer Laser ve Nd YAG Laser ile karşılaştırıldığında hidrojen peroksitin fotolizi yoluyla hidroksil radikallerinin daha verimli bir şekilde üretilmesine neden olur. Yüksek basınçlı plazma lamba, hidroksil radikallerinin üretimini kr F Excimer Lazer kullanılarak tipik olarak gözlemlenenin ötesinde önemli ölçüde artırır. 100 milimoler peroksit kullanmak yüksek düzeyde arka plan oksidasyonuna neden olabilir.
Protein sistemi peroksit kaynaklı oksidasyona duyarlıysa, konsantrasyonu 10 milimolar kadar düşürür. HRPF'nin geri dönüşü olmayan etiketi, uzun proteaz sindirimi de dahil olmak üzere aşağı akış numune işlemeye izin verir, çoklama için birlikte kütle etiketi ekleyebilir ve 2D kromatografi yapabilirsiniz, hepsi peptit algılamasını iyileştirir ve yapısal bilgileri birleştirir.
