Bu çalışma (Dr. Moreau&#39;ya) La Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, Paris, Fransa hibe tarafından desteklenen, Sağlık Araştırma Kanada Enstitüleri (Dr Moreau&#39;ya PP2-99466 hibe) ve Dördüncü Boyut Omurga LLC , New York, ABD (Dr Moreau&#39;ya Araştırma hibe).

Tüm prosedür steril biyolojik başlık altında gerçekleştirilir ve bütün solüsyonlar ve ekipmanlar hücreleri ile temas haline geliyor steril olması gerekmektedir. 1.. Temel Çözümleri hazırlanması <ol><li> Tablo 1&#39;e göre çözümler hazırlayın. </li><li> Kullanım zamanına kadar 4 ° C, oda sıcaklığı ve diğer tüm çözümlere dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) tutun. </li><li> Kullanılmadan önce bir kaç dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C sıcak soğuk ortam. </li></ol> 2. PBMC&#39;ler hazırlanması ve Depolama <ol><li> Her bir kısım için 5 ml &#39;si kullanılarak PBMC iki alikotları hazırlamak için EDTA ile muamele edilmiş toplama tüpleri içinde, tam kan 10 ml toplayın. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe EDTA ile muamele edilmiş toplama tüpünden Transfer, bütün haldeki kan 5 ml. </li><li> BSS eşit hacim eklemek ve yukarı ve aşağı yumuşak pipetleme örnek karıştırın. </li><li> Iki 15 ml Falcon tüpleri içinde 3 mL Ficoll yerleştirin. </li><li> Dikkatle 4.5 ml katmanHer bir tüp içinde Ficoll üzerinde kan karışımı seyreltilmiştir. </li><li> Tüpler kan ve Ficoll&#39;ün net bir ayrım lehine kadar 5 dakika bekletin. </li><li> Herhangi bir fren ile, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj tüpleri. </li><li> Katmanlarını rahatsız etmeyecek şekilde dikkatlice santrifüj tüpleri kaldırmak. PBMC&#39;ler BSS / Ficoll arayüzünde görebilir. </li><li> Bir pipet ile hem tüplerin arayüzünde PBMC&#39;lerin bulanık tabaka hasat ve yeni bir 50 ml&#39;lik tüpe transfer. </li><li> Tam ortam ile 20 ml ilave edilir. </li><li> Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 288 x g&#39;de santrifüje tüpü. </li><li> Aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> Ek medya 500 ul hücre pelletini. </li><li> Dondurma ortamının eşit bir hacim. </li><li> Kriyotüpe hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Izopropanol ile bir cryofreezing kap içine cryovial yerleştirin. </li><li> -80 ° C sıcaklıkta gece boyunca dondurucu konteyner saklayın. </li><li> Transfer dondurulmuş PBMC, uzun süreli saklama için sıvı nitrojen kısım. </li></ol> 3. İşlevsel Deneyi 1.. Gün 1 <ol><li> Bir dakika ya da çözülmüş kadar 37 ° C&#39;de su banyosu içerisinde sıvı azottan kısım yerleştirin. </li><li> Steril bir pipet ile bir 50 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Tam ortam 15 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> Aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> PHA yavaşça ortam 1 ml hücre pelletini askıya. </li><li> Aynı medya ile 20 ml hacmi tamamlayın. </li><li> Hava girmesine izin gevşek tüp kap. </li><li> Hareketsiz lenfositler hızla çoğalan lenfoblastların haline dönüştürmek için izin vermek için bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca tüp bırakın. </li></ol> 2. 2. Gün <ol><li> Kuluçka tüp almak, tamamen vidalı kapakları ve 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri aşağı spinoda sıcaklığında gerçekleştirilir. </li><li> Aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> Yavaşça tam ortam içinde 1 ml hücre pelletini askıya. </li><li> Aynı medya ile 20 ml hacmi tamamlayın. </li><li> Hava girmesine izin gevşek tüp kap. </li><li> Hücre sayıları genişletmek için bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca tüp bırakın. </li></ol> 3. 3. Gün <ol><li> Kuluçka tüp olsun, tamamen vidalı kapakları ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> Aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj ile RPMI-1640, 10 ml ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> Yavaşça RPMI-1640 içinde 600 ul hücre pelletini. </li><li> , Otomatik bir hücre sayacı ve canlılığı analiz cihazı kullanılarak, hücre canlılığı konsantrasyon ve ölçün. </li><li> 1.5 x 10 5 cells/20 ul bir hücre konsantrasyonu ayarlamak için RPMI-1640 uygun hacim. </li&gt; <li> Eppendorf tüpleri içinde, 1.5 ml rekombinan APN (rOPN) veya araç (PBS) hücreleri ile tedavi. <ol><li> Iki steril 1.5 ml Eppendorf tüplerine hücre süspansiyonu 100 ul aktarın. </li><li> 0.5 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar bir tüp içinde rOPN ekleyin. </li><li> Ikinci tüp içinde PBS eşit hacim. </li><li> Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iki kez 100 ul steril bir pipet seti kullanarak her koşul karıştırın. </li></ol></li><li> Küçük bir örnek, 96 oyuklu mikroplak hazırlayın. <ol><li> Her bir oyuğa RPMI-1640 içinde 5 ul ekle. </li><li> Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için 3 dakika boyunca 200 x g&#39;de plaka santrifüj. </li></ol></li><li> Muamele edilmemiş hücrelerin yanı sıra rOPN veya PBS ile tedavi edilen hücreler tohum. <ol><li> Mikroplakaya tüp hücreleri aktarmadan önce, hafifçe yukarı pipet ve aşağı bir zamanlar hücrelerin homojen bir süspansiyon sağlamak. </li><li> ROPN veya PBS için çift olarak, muamele edilmemiş hücreler için dört kez oyuk başına hücre süspansiyonu 40 ul muamele edilmiş hücreler. Retasarımı için Şekil 1 fer. Bu tasarım, 12 hasta ile aynı mikroplaka üzerinde test edilmesine olanak sağlar. </li><li> Hücreler inkübatör yerleştirmeden önce dinlenme ve kuyunun dibine eşit yerleşmek için izin vermek için 5 dakika için steril başlık altında hücre plaka bırakın. </li></ol></li><li> OPN etkisini optimize etmek için bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 18 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> 4. 4. Gün <ol><li> Bileşikleri ile plaka çalıştırın. <ol><li> Kuluçka plaka almak ve yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında bekletin. </li><li> RPMI-1640 içinde 990 ul stok çözeltisi (10 mM) 10 ul eklenmesi ile RPMI-1640 içinde ve somatostatin, izoproterenol, 100 uM, 1 ml hazırlayın. </li><li> Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi uygun kuyulara 20 ul tevzi ile bileşik plaka doldurun. </li><li> Önce buharlaşma nedeniyle bileşik konsantrasyonu değişimi önlemek için önceden kesilmiş bir delinebilir bir mühür ile bileşik Rozetveya CDS-tabanlı sistemde inkübasyon sırasında. </li><li> Yük hücresi plaka, pipet uçları ve CDS-tabanlı sistem içine levha bileşik. </li><li> CDS-tabanlı enstrüman yazılım plaka adlandırın. </li><li> Uygun protokolü seçin. PBMC&#39;Ier ile sınıflandırma için düzenlenen protokol &#39;Agonisti Yapışmayan hücreler Küçük örnek Plate RT 15 dk&#39; denir. Protokol kutusuna gitmek ve protokoller listesinde bu protokolü seçin </li><li> &#39;Başlat&#39; tıklayarak protokolünü başlatabilir. </li><li> Entegre akar bilimi sisteminin aynı anda 50 ul toplam hacim içinde 10 uM bir nihai konsantrasyon elde etmek için oyuk başına 5 ul enjekte edilerek tüm oyuklara bileşikleri ekler. </li><li> CDS-tabanlı sistemi otomatik bir bileşik ilave edildikten sonra 15 dakika için veri toplar. </li></ol></li><li> Veri analizi <ol><li> Olmayan için ekstrakt değerlerinin hesaplanmasında kullanılacak frekansların düşük ve yüksek aralıkları seçinyapışan hücreler. </li><li> Zamanla bazal empedans ölçümlerinde doğrusal değişiklik düzeltmek için sürüklenme düzeltmesini seçin. </li><li> Nedeniyle elektronik gürültü ve bileşik ilavesinden kinetik tepki ölçüm varyasyonları azaltmak için veri filtreleme seçin. </li><li> Tam analiz süre Max-Min yöntemini seçin. </li><li> Plaka biçimi seçeneği altında Excel&#39;e İhracat verileri. </li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak Gs stimülasyonu (RmGs) yanıt büyüklükte ortalama Gi stimülasyonu (RmGi) yanıt büyüklükte ortalama çıkarılarak delta G (ΔG) hesaplayınız: ΔG = RmGi - RmGs </li><li> (PBS varlığında uyarılması GI yanıt büyüklükte ortalama APN (RmGiOPN) mevcudiyetinde Gi uyarılmasına tepki büyüklüğü ortalamasını bölünmesiyle Gi-aracılı yanıt OPN kıvrım etki (Fe) yüzdesini hesaplayın RmGiPBS) aşağıdaki formül kullanılarak: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> T bakınızhastaları sınıflandırmak için 2 mümkün. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kane, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence:+a+call+for+a+statement+of+terms.">Prevalence: a call for a statement of terms.</a> Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).</li><li>Bunnell, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+screening+for+scoliosis.">Selective screening for scoliosis.</a> Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).</li><li>Asher, M. A., Burton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adolescent+idiopathic+scoliosis:+natural+history+and+long+term+treatment+effects.">Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects.</a> Scoliosis. 1 (1), 2 (2006).</li><li>Fong, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+the+clinical+effectiveness+of+school+scoliosis+screening.">A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening.</a> Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).</li><li>Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=School+screening+for+scoliosis:+can+surface+topography+replace+examination+with+scoliometer?.">School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer?.</a> Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoliosis+imaging:+what+radiologists+should+know.">Scoliosis imaging: what radiologists should know.</a> Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).</li><li>Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+scoliosis+in+Singapore+schoolchildren:+a+prevalence+study+15+years+into+the+screening+program.">Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program.</a> Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).</li><li>Nachemson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+term+follow-up+study+of+non-treated+scoliosis.">A long term follow-up study of non-treated scoliosis.</a> Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).</li><li>Enneking, W. F., Harrington, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+scoliosis.">Pathological changes in scoliosis.</a> J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).</li><li>Miller, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+natural+history+of+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis.</a> Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).</li><li>Nash, C. L., Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+of+exposure+to+X-rays+in+patients+undergoing+long-term+treatment+for+scoliosis.">Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+screening+test+for+idiopathic+scoliosis+using+cellular+dielectric+spectroscopy.">Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy.</a> Spine. 35 (13), 601-608 (2010).</li><li>Verdonk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dielectric+spectroscopy:+a+label-free+comprehensive+platform+for+functional+evaluation+of+endogenous+receptors.">Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors.</a> Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).</li><li>Peters, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cellular+dielectric+spectroscopy,+a+whole-cell,+label-free+technology+for+drug+discovery+on+Gi-coupled+GPCRs.">Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs.</a> J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).</li><li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity.">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+Gi-coupled+receptor+signaling+occurs+in+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis.</a> J. Clin. Invest. , (2013).</li></ol>

Birçok patent yol açtı Bu çalışma çeşitli ülkelerde askıda Sainte-Justine Üniversite Hastanesi ve diğerleri tarafından tutun. Dördüncü Boyut Omurga LLC Sainte-Justine Üniversite Hastanesi münhasır lisans sahibidir.

Bu taze olarak izole edilen veya sıvı azot içinde bir yıla kadar donmuş halde muhafaza edilmiş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri için de geçerlidir idiyopatik skolyoz için hücre bazlı bir prognostik testi (PBMC) ayrıntılı bir prosedür tarif eder. Bireylerin büyük sayıda test ederken taze olarak izole edilen PBMC&#39;ler kullanılarak ağır olduğu için, bu prosedür klinik ortamda daha pratik bir alternatif sunmaktadır dondurulmuş PBMC verildi. Dondurulmuş PBMCler başlangıçta arası tahlil değişkenliği bazen lider, kullanılan Ancak, çözüldükten sonra hücre topaklanma ile karşılaşılan sorunları. Tahlil tekrarlanabilirliğinin maksimize etmek için, biz donma-çözülme döngüsü kaçınarak ve sadece bir kez dondurulmuş örnek kullanmanızı öneririz. Prosedür kısa sürede kusurlu Gi protein fonksiyonunun doğru tespiti sağlayan, çok basittir. Bu prosedürü kullanarak, asemptomatik ve scoliotic çocukların kolaylıkla daha iyi sağlık için herhangi bir tehlike olmadan klinik sonucunu tahmin etmek sınıflandırılabilir. HoSağlıklı kontrol grubunda 12 Gi uyarım göreli maksimum yanıtın derecesine göre sınıflandırma yaparken wever, kontrol grubu için çeşitli gerekler yerine getirilmelidir. Gerçekten de, uygun bir karşılaştırma kohort amacıyla, kontrol grubu ilaç her türlü olabilir ve bu gibi geçmiş bireysel / ailesel tıbbi geçmişi gibi özel bilgi sağlamak değil, yaş ve cinsiyet uyumlu olmalıdır. Bu gereksinimler kontrol konuların alımı için önemli bir engel teşkil edebilir. Bu nedenle, aynı bireyde Gi ve Gs protein uyarılmasına tepki arasındaki dengesizlik derecesini inceleyerek sınıflandırma performans denetimi konuları kullanmanın gerekliliğini ortadan kaldırmak için idealdir. Bu testi gerçekleştirmek için prognostik CDS-dayalı bir sistemin kullanılması, aynı zamanda, aynı tahlilde Gi ve Gs-aracılı hücresel yanıtları sağlamak açısından önemlidir. Birçok hasta am ile sınıflandırılabilir rağmenbu raporun sonuçları ile gösterildiği gibi biguity Bu deney için sabit dinamik aralığı kullanılarak, hasta, az sayıda, aralıkları sınır çizgisine değerleri gösterirler. Bu bireyler ayrımcılık için, OPN üç fonksiyonel gruplar arasında Gi-aracılı hücresel cevap üzerinde bir etki fark neden olduğunu gösteren Gi tarafından uyarılmaya yanıt OPN etkisinin değerlendirilmesini girmiştik. Gerçekten de, OPN, FG1 Gi uyarım artışlara tepki varlığında bu FG2 daha yüksek bir oranda, FG2 ve FG3 de azalır bulundu. OPN maliyeti yüksek olmasına rağmen, bu kemokin kullanımı belirsiz durumlarda ayırt, ve bu nedenle sınıflandırma tahlil doğruluğunu geliştirmek için gereklidir. Bununla birlikte, bu deney, göz başına 1.5 x 10 5 hücre minimum deneysel koşullar altında CDS-tabanlı sistem ile hücresel cevabı gözlemlemek için gerekli olduğu bir dezavantajı vardır. Belirli hasta numuneleri, yeterli sayıda bir olmazTest edilecek olan hücreler. Bu durumda, medikal ve laboratuvar personeli için aileleri için endişe verici ve sinir bozucu olabilir ek kan toplama için hasta hatırlamak gerekir. Prospektif çalışmalar bu sorunu gidermek için laboratuarımızda planlanmaktadır. Bununla birlikte, mevcut protokol test hücrelerin karşılıklarının izlenmesi için geçerli bir etiket içermeyen bir sistem 13, 14 kullanılarak otomatik olarak ise hücrelerini hazırlamak için basit ve kanıtlanmış bir yöntemle gerçekleştirilir. Diğer hastalıkların prognozu için mevcut genetik platform ile karşılaştırıldığında test platformu nispeten ucuzdur. Ayrıca, kan toplama tüpleri, ipuçları, özel elektrot mikroplaklar, ve konik ve Eppendorf tüpleri dahil tüm tek kullanımlık malzemelerin maliyeti, çok pahalı değil ve yaklaşık bin hasta için bir test tamamlamak için en az 3000 $ olarak tahmin ediliyor. Bu tahmin örneklerinin hazırlanması için işçilik maliyetleri içermez rağmenve testi, bu test çok daha uygun yeni nesil dizileme platformlarda daha kalır. Dikkate değer, genetik platformlara maliyet karşılaştırma değil sadece, ama daha spesifik AIS alanı ile ilgili, radyolojik görüntüleme ile ilgili maliyetleridir. Bugün, ABD&#39;de bir milyondan fazla çocuk ve Kanada&#39;da yaklaşık 100.000 çocuk idiopatik skolyoz tanısı, ve X-ray maruz kalma tanı ve scoliotic çocukların izlenmesi toplam maliyeti Kuzey Amerika&#39;da yılda 2.5 milyar doların üzerinde olan. Böylece, hücre bazlı deney prosedürü rutin tarama ve sağlık riski olmaksızın ve daha düşük maliyetle idiyopatik skolyoz olan çocukların izlenmesi için uygun olması beklenecektir.

İdiopatik skolyoz genellikle vertebra rotasyon 1 eşliğinde 10 dereceden daha büyük bir yanal eğrilik olarak tanımlanan nedeni bilinmeyen bir omurga deformitesi olduğunu. Durum pediatrik nüfusun% 4 etkiler ve en sık 9 ila 13 yaşındaki 2,3,4 yaşları arasında teşhis edilir. Tanı öncelikle dışlanmanın ve sadece bu vertebra malformasyon, nöromüsküler veya sendromik bozukluklar gibi omurga deformitesi diğer nedenleri ekarte edildikten sonra yapılır. Geleneksel olarak, trunkal asimetri Adams öne eğilme testi ile saptandı ve fiziksel muayene sırasında 5 scoliometer ile ölçülür. Tanı sonra radyografik eğrinin gözlenmesi ve Cobb yöntem 6 kullanılarak açı ölçümü ile teyit edilebilir. Bir kez tanı, scoliotic çocukları yönetmek hekimler için birincil endişe eğrisi ilerleme olup olmadığıdır. Gerçekten de, eğri ilerleme genellikle önceden tahmin edilemez vedaha sık kızlar arasında görülen erkek 7 daha hızlıdır. Eğer tedavi edilmezse, eğri önemli fiziksel deformite ve hatta kardiyopulmoner sorunlar yaratarak, dramatik ilerleyebilir. Bu bulgular eğrisi 70 ° 8,9 aştığında hayatı tehdit haline gelir. Eğri ilerlemesini engellemek ya da durdurmak için mevcut tedavi seçenekleri canlandırıcı ve cerrahi içerir. Cerrahi eğrileri 45 ° den büyük ya da takviye yanıtsız için ayrılmış ise, genel olarak, takviye 25-40 ° arasında eğrileri için tavsiye edilir. Yaklaşık olarak, idiopatik skolyoz tanısı alan çocukların% 10 düzeltici cerrahi gerektiren 10 eğri ilerlemesini var. Şu anda, hiçbir kanıtlanmış bir yöntem ya da bu hasta kategorisini tanımlamak için kullanılabilir bir test yoktur. Sonuç olarak, tüm teşhis çocuklar iskelet olgunluğuna ulaşmak genellikle kadar, birkaç yıl içinde birden fazla radyograma tabi tutulur. Skolyoz ile tipik hastalarda olacağı tahmin edilmektedir3 yıllık süre 11 yılı yaklaşık 22 radyolojik tetkikler. Çünkü çoklu radyografik incelemelerin potansiyel risk, iyonize radyasyona maruz kalmadan çocuklar idiopatik skolyoz prognozu performans izin verebilecek alternatif yaklaşımlar şiddetle arzu edilir. Bu ihtiyacı karşılamak amacıyla, daha önce er idiopatik skolyoz gelişme riski asemptomatik çocukların belirlenmesi için bir prognostik test olarak bir hücre tabanlı tarama tahlili geliştirdi. Test Gi proteinlerinin fonksiyonel durumunu inceleyerek ve CDS ile ölçülen Gi protein uyarım 12 maksimum yanıtın derecesine göre üç fonksiyonel gruplar (FG1, FG2 ve FG3) içine çocuk sınıflandırarak hem asemptomatik ve etkilenen çocuklarda klinik sonucunu tahmin tabanlı sistem. Bu sistem, çok çeşitli hücre tipleri 13,14,15,16 G proteinleri yoluyla sinyal iletimini değerlendirmek için kullanılır. Bu, ilgili bilgi verirhücre yüzeyi reseptörlerinin aktivasyonu empedansı aşağıdaki değişiklikleri ölçerek dış uyarılara karşı hücrelerin toplam entegre cevabı. Hücreler, kuyuların altındaki elektrotlar içerir ve sistem, hücre dışı ve hücre üzerinden akımlarını hasıl küçük bir gerilim uygular bu mikro içine tohumlanır. Kuyuya bileşiği enjeksiyonundan sonra, hücre yüzeyi reseptörleri uyarılır ve sinyal transdüksiyon etkinlikleri hücre dışı ve hücre üzerinden akım akışını etkileyen hücresel değişikliklere yol açan, ortaya çıkar ve bu şekilde ölçülen büyüklüğünü etkiler. Bu yaklaşımla, skolyoz gelişme riski scoliotic hastalar ve çocuklar daha sağlıklı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında Gi protein stimülasyon daha az duyarlı ve sınıflandırma kontrol grubuna göre azalma göreceli derecesi yüzde dayanmaktadır. Sınıflandırma aralıkları FG3, 40 ve FG2 için% 60 ve 60 ve FG1 12 için% 90 10 ve% 40 arasında sabitlenir. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Daha yakın zamanlarda, biz üç fonksiyonel gruplar açıkça Gi ve Gs uyarılmasına tepki arasındaki dengesizlik profiline göre ayırt edilebilir olduğunu göstererek bu yaklaşımı değiştirdiniz. Gerçekten de, belirgin bir dengesizlik FG2 gözlenmiştir ise Gi uyarısına yanıt FG3 içinde hakim olduğu bulunmuştur. Bunun aksine, FG1 Gs uyarılmaya yanıt için baskın sergiledi. Buna ek olarak, biz FG2 ait hastalar ameliyat 17 ihtiyacı noktasına ilerliyor riski daha fazla olduğunu kanıtlar sağlamıştır. Bu sınıflandırma testin hassas başka fonksiyonel gruplar arasında Gi uyarılmasına yanıt osteopontin (OPN) bir diferansiyel etkisini gösteren ile iyileştirilmiştir. İşte biz şu anda bizim laboratuvarda yapılan bu fonksiyonel test deneysel ve analitik prosedürlerin ayrıntılı adımlar belgelemek.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

Bu protokol asemptomatik ve etkilenen çocuklarda idiopatik skolyoz prognozu tahmin etmek için fonksiyonel bir test olarak laboratuvarda geliştirilen bir hücre bazlı tahlil için deneysel ve analitik yordamı ayrıntıları. Deney üç fonksiyonel grup (FG1 içine bir otomatik CDS tabanlı alet, ve çocukların sınıflandırması kullanılarak, hücresel dielektrik spektroskopisi (CDS) periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) in Gi ve Gs proteinlerinin fonksiyonel durumunun değerlendirilmesi oluşmaktadır Gi ve Gs proteinleri uyarılmaya yanıt derecesi arasında dengesizlik profili ile ilgili olarak, FG2, FG3). Sınıflandırma ayrıca grupları ve hastalığın ciddi bir ilerleme FG2 tarafından başvurulan arasında Gi uyarılmasına yanıt osteopontin (OPN) ayırıcı etkisi ile teyit edilir. Yaklaşık olarak, kanın 10 ml &#39;lik bir hacim Ficoll-gradyanı sağlamakta ve hücreler tarafından PBMC elde etmek için gerekli olan daha sonra sıvı azot içinde saklanır. P yeterli sayıdaBMCS deneyi gerçekleştirmek için hücre kültür iki gün sonra elde edilir. Esasen, hücreler önce phytohemmaglutinin (PHA) ile inkübe edilir. 24 Saat inkübe edildikten sonra, ortam önce hücre tohumlama ve OPN tedavisine ilave bir 24 saat boyunca bir PHA-içermeyen kültür ortamı ile değiştirilir. Hücreler daha sonra, spektroskopik olarak, sırasıyla, aynı kökenli reseptörleri aracılığıyla Gi ve Gs proteinleri aktive somatostatin, izoproterenole yanıtları için taranır. Somatostatin isoproterenol ve her ikisi de eş zamanlı olarak entegre bir akar bilimi sistemine enjekte edilir ve hücrelerin tepkileri, 15 dakika süre ile izlenir. Deney, taze ya da dondurulmuş PBMC ile yapılabilir ve prosedür 4 gün içinde tamamlanır.

Hücre canlılığı, 86 ve% 96 aralığında değerleri ile tutarlı bir bütün örnekler arasında karşılaştırılabilir. Buna karşın, yüksek varyasyonları örnekleri (Tablo 3) arasında hücre sayıları kaydedildi. Kullanılan 32 örnekleri, iki hücrelerin yetersiz sayıda vardı ve sınıflandırılmış olmamıştır. Gi ve Gs sinyali arasındaki dengesizlik derecesine göre fonksiyonel sınıflandırma sonuçlarının bir örneği Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Bu rakamın dikey eksen FG2 için +10 ile -10 arasında, FG3 için&gt; 10 olarak kurulan dinamik aralıkları ile fonksiyonel gruplar tasvir üç bölüme ayrılır ve nihayet &lt;-10 FG1 içindir. Burada test 30 hastadan, 14, 6, ve 5 hasta açıkça FG2, FG3 sınıflandırılır ve sırasıyla FG1, beş hastada, özellikle 345, 353, 370, 371, ve 382, ​​aralıkları sınırda iken. Gi uyarısına yanıt OPN etkisinin değerlendirilmesi OPN pa yanıtını arttırdığını ortaya çıkmıştı353 ve 371 rın. Bunun aksine, hastanın tepki 345 ve 382 den fazla% 50 ve rOPN tedaviden sonra hastada 370 &#39;den daha az% 50 oranında azaltıldı. Yani, bizim sınıflandırma kriterleri (Tablo 2) göre, biz FG1 hasta 353 ve 371 kategorize başardık, hastalar 345 ve FG2 382 ve FG3 hasta 370. Buna paralel olarak, tüm hastalar Gi protein uyarılmasına tepki açısından tarandı ve kontrol grubu ile karşılaştırılmıştır. Beklendiği gibi, tüm hastalar kontrol grubuna göre daha az duyarlı olduğunu ve yeni prosedür ile aynı fonksiyonel grupta sınıflandırılan hastaların maksimum cevabı (Şekil 5) benzer düzeylerde sergiledi. Ayrıca, her fonksiyonel grubun hastalar arasında farklılık yeni prosedür doğrulayarak, sınıflandırma 12 bizim klasik dizi ile tutarlıdır. Düzenli Sainte-Justine Hastanesinin özel kliniğimizde takip scoliotic hastaların büyük bir kohort sınıflandırılması ortaya koyduğu üçFG2 hastalığın ciddi ilerlemesi riski daha olarak fonksiyonel bir grup halinde sınıflandırılır hastaların tespit edilmesi ve bu sınıflandırma testi de yararlı olabilir gösteren ciddi vakalarda arasında (Şekil 6) baskın ise, fonksiyonel gruplar aynı şekilde, orta vakalar arasında dağıtıldı idiopatik skolyoz prognoz. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Çözelti A </td><td> Susuz D-glukoz </td><td> % 0.1 </td></tr><tr><td> CaCl2 2H 2 O </td><td> 0.05 mM </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 0.98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5.4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Çözüm B </td><td> NaCl </td><td> 140 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Dengeli Tuz Çözeltisi (BSS) </td><td> Çözelti A </td><td> 1 hacim </td></tr><tr><td> Çözüm B </td><td> 9 hacmi </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; Komple ortam </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 mi </td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 10. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Tamamlayıcı medya </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 mi </td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 40 </td></tr><tr><td rowspan="4"> Donma medya </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 mi </td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 40 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> % 20 </td></tr><tr><td rowspan="4"> PHA medya </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 mi </td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 10. </td></tr><tr><td> Fitohemaglutinin </td><td> % 1 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Essentialçözümleri. <table border="1"><tbody><tr><td> ΔG ile dinamik aralıkları </td><td> Fonksiyonel Gruplar </td><td> Fe ile dinamik aralıkları </td></tr><tr><td> ΔG &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt;% 100 </td></tr><tr><td> -10 &lt;ΔG &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;% 50 </td></tr><tr><td> ΔG&gt; +10 </td><td> FG3 </td><td> % 50 &lt;Fe &lt;% 95 </td></tr></tbody></table> ΔG ve Fe ile kurulan dinamik aralıklara göre fonksiyonel grupların Tablo 2.. Kategorizasyonu. <table border="1"><tbody><tr><td> Hastalar </td><td> Canlılık (%) </td><td> Hücre konsantrasyonu (× 10 6 / ml) </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88.7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90.5</td><td> 13.6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94.4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94.3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94.6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91.2 </td><td> 0.82 </td><td> Hücrelerin yetersiz sayıda </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90.3 </td><td> 8.92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92.6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91.3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86.9 </td><td> 7.62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91.2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90.3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95.1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92.3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89.4 </td><td> 7.67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93.5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86.5 </td><td> 2.2 </td><td> Hücrelerin yetersiz sayıda </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92.6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93.4 </td><td> 10.9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92.5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88.8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93.9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92.9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93.1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93.6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92.6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91.1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93.9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92.1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92.9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89.1 </td><td> 7.73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3. , Otomatik bir hücre sayacı ve canlılığı analiz cihazı kullanılarak belirlenen yüzde canlılığı ve hücre konsantrasyonu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Hücre tohumlama için Şekil 1.. Tasarımı. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Şekil 2.Bileşikleri dağıtımı için tasarlayın. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Şekil 3. CDS-tabanlı bir sistem kullanarak fonksiyonel sınıflandırmanın Dinamik aralığı. Grafik Gi ve idiyopatik skolyoz hastalardan elde edilen PBMC&#39;ler Gs uyarılmasına yanıtları arasında dengesizlik derecesine değerlerini göstermektedir. Değerler somatostatin ve izoproterenol 10 uM tepki olarak CDS-bazlı sistemi ile ölçüldü. Her bir nokta iki kopya halinde her iki tepkilerinin ΔG temsil eder. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Şekil 4,. PBMC&#39;ler içinde Gi uyarılmasına yanıt rOPN etkisi. Hücreler varlığında ya da 0.5 ug / ml rOPN yokluğunda, 18 saat serumsuz ve daha sonra 10 ile uyarıldı<html> 56; somatostatin M Gi aracılı hücresel yanıtı başlatmak için. Grafikteki veri maksimum-minimum empedans oluşturulan ve iki kez yanıt ortalamasına karşılık gelir edilmiştir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Şekil 5. Kontrol ve scoliostic kişilerin PBMC&#39;lerinden Gi proteinin fonksiyonel durumu. Kontrol grubunda ve scoliotic hastaların PBMC endojen somatostatin reseptörü vasıtasıyla Gi proteinlerinin teşvik etmek için somatostatin artan konsantrasyonlarda maruz bırakılmıştır. Işlem bölümünde tarif edildiği gibi hücresel yanıt CDS-tabanlı bir sistem ile ölçülmüştür. Eğriler, maksimum-minimum empedans elde edilmiştir. Her eğri doğrusal olmayan regresyon temsil eder. Veri kontrol grubunda hücrelerde maksimum yanıta göre normalize ve her bir nokta her iki kez yanıt ortalamasına karşılık gelir edilmiştir./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük rakam görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Skolyoz farklı evreleri arasındaki fonksiyonel grupların Şekil 6.. Dağılımı. Düzenli Sainte-Justine Hastanesinin ardından 794 orta (10-44 ° arasında eğrilikler) ve 162 (fazla 45 ° eğrilik) ağır olguların scoliotic hastaların büyük bir kohort, Gi ve Gs yanıt arasındaki dengesizlik onların derecesine göre sınıflandırıldı uyarım. Yanıtlar somatostatin ve izoproterenol 10 uM tepki olarak CDS-bazlı sistemi ile ölçüldü.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Bir yapılandırılmış protokol hücresel dielektrik spektroskopi (CDS) kullanarak idiopatik skolyoz prognozu tahmin etmek için bir fonksiyonel test olarak bir hücre bazlı deney için sunulmuştur. Deney, taze ya da dondurulmuş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ile yapılabilir ve prosedür 4 gün içinde tamamlanır.

Hücresel Dielektrik Spektroskopisi kullanarak İdiopatik Skolyoz Prognostik Tahmininde Hücre-tabanlı Deney Protokolü

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

cell-based-assay-protocol-for-prognostic-prediction-idiopathic

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K Görüntüleme.  Sainte-Justine University Hospital Research Center.  Bir yapılandırılmış protokol hücresel dielektrik spektroskopi (CDS) kullanarak idiopatik skolyoz prognozu tahmin etmek için bir fonksiyonel test olarak bir hücre bazlı deney için sunulmuştur. Deney, taze ya da dondurulmuş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ile yapılabilir ve prosedür 4 gün içinde tamamlanır. 

Video: Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative short-term and long-term effects on the mother. Prior to women undergoing surgery, can we predict who is at risk for developing significant postoperative pain and potentially prevent or minimize its negative consequences? These are the fundamental questions that a team from the University of Washington, Stanford University, the Catholic University in Brussels, Belgium, Santa Joana Women's Hospital in S&atilde;o Paulo, Brazil, and Rambam Medical Center in Israel is currently evaluating in an international research collaboration. The ultimate goal of this project is to provide optimal pain relief during and after cesarean section by offering individualized anesthetic care to women who appear to be more 'susceptible' to pain after surgery.
A significant number of women experience moderate or severe acute post-partum pain after vaginal and cesarean deliveries. 1 Furthermore, 10-15% of women suffer chronic persistent pain after cesarean section. 2 With constant increase in cesarean rates in the US 3 and the already high rate in Brazil, this is bound to create a significant public health problem. When questioning women's fears and expectations from cesarean section, pain during and after it is their greatest concern. 4 Individual variability in severity of pain after vaginal or operative delivery is influenced by multiple factors including sensitivity to pain, psychological factors, age, and genetics. The unique birth experience leads to unpredictable requirements for analgesics, from 'none at all' to 'very high' doses of pain medication. Pain after cesarean section is an excellent model to study post-operative pain because it is performed on otherwise young and healthy women. Therefore, it is recommended to attenuate the pain during the acute phase because this may lead to chronic pain disorders. The impact of developing persistent pain is immense, since it may impair not only the ability of women to care for their child in the immediate postpartum period, but also their own well being for a long period of time.
In a series of projects, an international research network is currently investigating the effect of pregnancy on pain modulation and ways to predict who will suffer acute severe pain and potentially chronic pain, by using simple pain tests and questionnaires in combination with genetic analysis. A relatively recent approach to investigate pain modulation is via the psychophysical measure of Diffuse Noxious Inhibitory Control (DNIC). This pain-modulating process is the neurophysiological basis for the well-known phenomenon of 'pain inhibits pain' from remote areas of the body. The DNIC paradigm has evolved recently into a clinical tool and simple test and has been shown to be a predictor of post-operative pain.5 Since pregnancy is associated with decreased pain sensitivity and/or enhanced processes of pain modulation, using tests that investigate pain modulation should provide a better understanding of the pathways involved with pregnancy-induced analgesia and may help predict pain outcomes during labor and delivery. For those women delivering by cesarean section, a DNIC test performed prior to surgery along with psychosocial questionnaires and genetic tests should enable one to identify women prone to suffer severe post-cesarean pain and persistent pain. These clinical tests should allow anesthesiologists to offer not only personalized medicine to women with the promise to improve well-being and satisfaction, but also a reduction in the overall cost of perioperative and long term care due to pain and suffering. On a larger scale, these tests that explore pain modulation may become bedside screening tests to predict the development of pain disorders following surgery.

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

Diffuse noxious inhibitory control, temporal summation and wound hyperalgesia testing are demonstrated in the obstetric patient. These tests evaluate inhibitory and excitatory mechanisms of pain processing and are here utilized to evaluate endogenous analgesia at different time-points during pregnancy and the peripartum period to help reveal individual s risk for persistent pain.

Post-operatif ağrı Tahmininde Deneysel Bir Paradigma (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

Tıp

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

Bir fare Modeli Kullanılarak Akut Radyasyondan Bağlı Cilt zehirlilik Kantitatif Değerlendirme optik tayf Diffüz

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently inhibit viral replication, they have no direct effect on the expression of viral proteins transcribed from a viral covalently closed circular DNA (cccDNA). As high viral antigen load may play a role in this chronic and HBV-related carcinogenesis, the goal of HBV treatment is to eradicate viral proteins. HBV regulatory protein X (HBx) binds to the host DNA damage-binding protein 1 (DDB1) protein to degrade structural maintenance of chromosomes 5/6 (Smc5/6), resulting in activation of viral transcription from cccDNA. Here, using a split luciferase complementation assay system, we present a comprehensive compound screening system to identify inhibitors of the HBx-DDB1 interaction. Our protocol enables easy detection of interaction dynamics in real time within living cells. This technique may become a key assay to discover novel therapeutic agents for treatment of HBV infection.

Here, we present a method for screening anti-hepatitis B viral agents that inhibit the HBx-DDB1 interaction using a split luciferase assay system. This system allows easy detection of protein-protein interactions and is suitable for identifying inhibitors of such interactions.

Bölünmüş Luciferase Assay Sistemi Kullanarak HBx-DDB1 Etkileşiminin Inhibitörlerinin Belirlenmesi

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic nerve cross-sectional assessment and quantification using 3 T MRI for image acquisition and ImageJ's Fiji software for image processing quantification. Image acquisition was performed using 3 T MRI, with proper instructions for the patient to ensure straight fixation during imaging. A T2-weighted fat suppressed sequence was used. A coronal cut taken 3 mm behind the globe and perpendicular to the optic nerve axis should be uploaded to the software. Using the threshold function, the white matter area of the optic nerve is selected and quantified, thus, eliminating inter-individual measurement bias. We also described the normal limits for the optic nerve cross-sectional area according to age, based on previously published literature. We used the described protocol to assess optic nerve of a suspected glaucoma patient. The optic nerve cross-sectional area was found to be within the normal limits, a finding further confirmed via optical coherence tomography of the optic nerve.

We provided a detailed protocol for a standardized method of optic nerve assessment and quantification using MRI, utilizing a widely available imaging sequence, and open access software for image analysis. Following this standardized protocol would provide meaningful data for comparison between different patients and different studies.

MRG'de Optik Sinir Kesit Alanının Nicelemesi: Fiji Yazılımını Kullanan Yeni Bir Protokol

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...

A Real-World High-Intensity Interval Training Protocol for Cardiorespiratory Fitness Improvement

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, few studies have tested the efficiency of HIIT protocols in a &#34;real world&#34; setting, e.g., HIIT protocols designed for outdoor spaces without specialized equipment. This study presents a &#34;real world&#34; training protocol, named &#34;beep training&#34;, and compares the efficiency of a HIIT regiment versus a traditional long-duration Moderate-Intensity Continuous Training (MICT) regiment using this beep training protocol on VO2 max of overweight untrained men. Twenty-two subjects performed outdoor running with MICT (n = 11) or HIIT (n = 11). Cardiorespiratory fitness was assessed before and after training protocols using a metabolic analyzer. Both training protocols were performed 3 days a week for 8 weeks using the Beep Test results. The MICT group performed the exercise program at 60%-75% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax) and with a progression of the distance of 3,500-5,000 m. The HIIT group performed the interval exercise with 7-10 bouts of 200 m at 85%-100% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax), interspersed with 1 min of passive recovery. Although the HIIT group presented a significantly lower training volume than the MICT group (p &#60; 0.05) after 8 weeks of beep training, HIIT was superior to MICT in improving VO2 max (MICT: ~4.1%; HIIT: ~7.3%; p &#60; 0.05). The &#34;real world&#34; HIIT regiment based on beep training protocol is a time-efficient, low-cost, and easy-to-implement protocol for overweight untrained men.

This study presents a low-cost and easy-to-implement "real world" high-intensity interval training (HIIT) protocol for scientific research and discusses its efficiency for cardiorespiratory fitness.

Kardiyorespiratuar Fitness İyileştirme için Gerçek Dünyada Yüksek Yoğunluklu Aralıklı Antrenman Protokolü

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, ...

Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug against hyperlipidemia in Traditional Chinese Medicine (TCM) and Indian Medicine theories, however the potential mechanism requires further exploration. The present research aims to reveal the mechanism of FP against hyperlipidemia based on an integrated strategy combining network pharmacology prediction with metabolomics validation. A high-fat diet (HFD)-induced mice model was established by evaluating the plasma lipid levels, including total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). Network pharmacology was applied to find out the active ingredients of FP and potential targets against hyperlipidemia. Metabolomics of plasma and liver were performed to identify differential metabolites and their corresponding pathways among the normal group, model group, and intervention group. The relationship between network pharmacology and metabolomics was further constructed to obtain a comprehensive view of the process of FP against hyperlipidemia. The obtained key target proteins were verified by molecular docking. These results reflected that FP improved the plasma lipid levels and liver injury of hyperlipidemia induced by a HFD. Gallic acid, quercetin, and beta-sitosterol in FP were demonstrated as the key active compounds. A total of 16 and six potential differential metabolites in plasma and liver, respectively, were found to be involved in the therapeutic effects of FP against hyperlipidemia by metabolomics. Further, integration analysis indicated that the intervention effects were associated with CYP1A1, AChE, and MGAM, as well as the adjustment of L-kynurenine, corticosterone, acetylcholine, and raffinose, mainly involving tryptophan metabolism pathway. Molecular docking ensured that the above ingredients acting on hyperlipidemia-related protein targets played a key role in lowering lipids. In summary, this research provided a new possibility for preventing and treating hyperlipidemia.

The present protocol describes an integrated strategy for exploring the key targets and mechanisms of Fructus Phyllanthi against hyperlipidemia based on network pharmacology prediction and metabolomics verification.

Ağ Farmakolojisi Hiperlipidemiye Karşı Fructus Phyllanthi Mekanizmasının Tahmini ve Metabolomik Validasyonu

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug ...

LC-MS Kullanarak Gözyaşı Proteomikleri için İnvaziv Olmayan Biyobelirteç Keşfi

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

Yazar Spotlight: Proteomik Araştırma için Standartlaştırılmış Bir Protokol Kullanarak Gözyaşı Sıvısı Analizini Geliştirme 

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi ile Gözyaşı Proteomiği için Bir Protein Süspansiyonu-Tutucu Numune Hazırlama

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...