Bu, Şekil 1 &#39;de kullanılan grafik sağlamak için FortéBio ederiz. Bu çalışma TMD NIH hibe GM083088 tarafından desteklenen

<html> 1.. BLI Testi için Enstrüman Programlama Lamba ısınmak için izin önceden enstrümanın en az bir saat açın, bu gürültü en aza indirmek ve deney sırasında optik sinyal kayması gereklidir. Numune plaka tutucu prewarm için enstrüman sekmesi aracılığıyla İstediğiniz sıcaklığı ayarlayın. Sonra Veri Toplama yazılımı deney tasarımı kurmak. Deney Sihirbazı sekmesinde &quot;Yeni Kinetik Experiment&quot; seçeneğini seçin. Bu tanımlanmış olması gereken tüm adımları ile bir sekmeli menü sunuyor. 1.1. Plaka Tanımlama 96 oyuklu numune plakası üzerinde kullanılmak üzere sütunları tanımlar. Tampon hareketsizleştirilmiş protein ya da bağlanma partneri dahil etmek için sütun atama. Her oyuğa federasyonu için kullanılacak ortak bağlanma konsantrasyonunu girin. Not: Şekil 2&#39;de gösterilen plaka tanımı farklı deneyleri için seçenekler vardır. 1.2. Tahlil Tanımı ontent &quot;&gt; tahlili için gerekli tüm adımları tanımlamak için kullanılır. bunlar (i) Temeli (birkaç), (ii) yükleme, (iii) Association ve bağlanma partneri (iv) ayırma yer alır. Daha sonra, aşağıda tarif edildiği gibi, bireysel adımları deney bağlantı ilgili sütunda deney aşamasını ve daha sonra çift tıklayarak seçerek numune levha üzerindeki kuyu sütunlar. bu programlar, sensörler, tahlil sırasında sonraki kuyu bir sütundan taşınacak. <ol><li> Baseline 96 oyuklu bir plaka içerisinde, ilk BLI sinyalleri oluşturmak için, deney tamponu içerisinde sensör (Şekil 2, sütun 1) ile, bir kısa temel aşama (≥ 60 saniye) ile başlayın. </li><li> (Sensörler biyotinilatlı proteini hareketsizleştirir) Loading Biyotinile protein (Şekil 2, sütun 2) içerir çukurlara sensörleri atama. Bir bağlanma önceden belirlenmiş bir düzeye (bkz) elde etmek için eşik işlevini kullanın. Tüm sensörler hareket olacak şekilde eşik seçeneğini ayarlayınsensörlerden herhangi biri eşiğine ulaştığında kuyuların sonraki sütuna d. </li><li> Baseline Sensörlerin uzak sabitlenmemiş biyotinile edilmiş proteinler yıkama ve yeni, dengeli başlangıç ​​sinyalleri oluşturmak için tampon maddesi içinde bir başlangıç ​​adımı (tipik olarak&gt; 5 dakika Şekil 2, sütun 3) içerir. Sadece (Şekil 3&#39;te olduğu gibi) temel bağlanma / ayrılma tahlilleri için, Association aşamasından önce tampon yeni kuyu sensörlerle fazladan bir başlangıç ​​aşamasını (60 sn) (Şekil 2, sütun 4) içerir. </li><li> (Hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​bağlanma partnerinin) Association (Şekil 3&#39;te olduğu gibi) temel bir bağlayıcı / ayrılma deneyi için, farklı sensörler / kuyu için kullanılacak bağlanma partnerinin konsantrasyonları bir dizi (Şekil 2, sütun 5) seçin. Bağlanma partnerinin en az bir doyma konsantrasyonu, sinyal bağlama denge yaklaşım gerekir, böylece adım zaman ayarlayın. Bir için(Şekil 5 &#39;de olduğu gibi) protein-protein kompleksinin ayrışma küçük ligandlann allosterik etkilerini test etmek için deney, her bir ilişki kuyularda kullanım için (10-kat tahmini K D yukarıda ~) bağlanma partnerinin, tek bir yüksek konsantrasyonu seçin. </li><li> (Bağlanma partnerinin) Ayrışma Sadece (Şekil 3&#39;te olduğu gibi) temel bir bağlama / ayırma deneyi için, sütun 4 (Şekil 2), esas önce ilave taban için kullanılan ile aynı tampon oyuklara dönmek için algılayıcıları. Küçük ligandların allosterik etkilerini test etmek için bir deney için, bunun yerine, 6. sütun her bir oyuğa tamponu artı farklı allosterik ligandları ihtiva edebilir (Şekil 2), geçmek için algılayıcıları. </li></ol> 1.3. Sensör Atama Deney için önceden silinmiş sensörleri içerir sensör tepsisine yerleri gösterir. Deneme FAI beri herhangi bir boş pozisyonları tespitBen hiçbir sensörler aldı eğer. 1.4. İnceleme Deneme Hataları denetlemek ve bunları düzeltmek için geri gitmek için planlanan tüm adımları gözünüzde canlandırın. 1.5. Denemeyi çalıştırın Veri dosyalarının konumu da dahil olmak üzere gerekli ayrıntıları girin. Deney için istenilen sıcaklığa girin. Sensörleri hala Önnemlendirme gerektiriyorsa, deney başlamadan geciktirmek için seçeneği seçin. Son olarak, bir kez tüm numune hazırlama (adım 2) tamamlandı ve numune plaka ve sensör tepsi hem enstrüman yüklenir, tahlil çalıştırmak için Git düğmesini tıklatın. 2. Numune Hazırlama <ol><li> Uygun bir deney tamponu hazırlayın. (8.0 &#39;a pH değerinin ayarlanması için ilave edildi) - ((N-morfolino) propansülfonik asit 3), Tris (Tris (hidroksimetil) amino-metan), 50 mM KCI, 20 mM MOPS: Tampon, Şekil 3 ve 5&#39;te gösterilen deneyler için kullanılır. BSA (sığır serum albumin, yağlı asitsiz, 0.5 DahilTüm deney adımlar için ve biyotinile protein veya sensörlere proteinlerin spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için bağlanma partnerinin tüm seyreltileri için tampon maddesi içinde) son mg / ml. </li><li> (Bkz) uygun bir konsantrasyona kadar deney tamponu içerisinde biyotinile protein (ε) seyreltin. </li><li> Deney tamponu içinde bağlanma partner (F 1 (ε-)) (kullanmak için konsantrasyonlarının aralığı için tartışma bakınız) seyreltim dizileri hazırla. </li><li> Koruyucu kaplama sükroz çıkarmak için en az 10 dakika boyunca streptavidin kaplı sensörleri ön ıslatılmış. Sensör tepsiden sensör içeren raf çıkarın ve tepsinin üzerindeki yönlendirme çentiğe plakanın bir köşesini kayar, tepsinin dibinde bir 96-plaka takın. Sensörlerin kolon kullanılması için, 96 oyuklu plakanın bu sütunda oyuk başına deney tamponu içinde 200 ul ekleyin. (Yuvaları ile sekmeleri) doğru yönde tepsiye sensörlerin raf dönün. </li><li> Adım 1 programlama sırasında atanan, o kuyuları doldurmakŞekil 2&#39;de olduğu gibi, deney tamponu ya da uygun protein seyreltileri f numune plakası. Onlar optik sinyal gürültü neden olabilir, kabarcıkları tanıtan kaçının. (I) biyotinile protein ya da (ii) bağlanma partneri ya da ihmal bir veya daha fazla kuyu bir referans içerir. </li><li> Enstrümanın kapağını açın ve sahnenin yuvalarına takılı tepsinin sekmeleri ile, sahnede (sol) üzerine sensör tepsisini yerleştirin. Plaka tutucu (sağda) örnek plaka yerleştirin; plaka sahibi belirtildiği gibi plaka, düz ve doğru yönde oturduğundan emin olun. Kapıyı kapatın ve Veri Toplama programı (adım 1.5) den deneyi başlar. </li></ol> 3. Veri İşleme <ol><li> Tahlil çalıştırmak sonra, Veri Analizi yazılımı açın ve verileri içeren klasörü yükleyebilirsiniz. Her bir sensör ile, (solda) bir adım bilge İşleme menüsünü ve ham kinetik verileri görmek için &quot;İşleme&quot; sekmesine tıklayın (AH), farklı bir renk atanır (bkz.Şekil 3). </li><li> &quot;Veri Seçimi&quot; altında, &quot;Sensör Seçimi&quot; düğmesine tıklayın. &quot;Örnek Plate&quot; Harita üzerinde, referans kuyu gibi 1 ya da 2 kontrol sensör (G, Şekil 3&#39;ün deneyde H) için kuyu işaret etmektedir. İşleme menüsünde, &quot;Çıkarma&quot; kutusunu işaretleyin ve diğer her sensörün sinyal referans sinyalini (tek ya da ortalama) çıkarma &quot;Referans Wells&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Hizala Y Ekseni&quot; adımı kullanarak = 0 Y tüm izlerini hizalayın. Hizalama adım (bu Association adımdan önce son temel varlık) olarak &quot;Temeli&quot; seçeneğini seçin. &quot;Zaman Aralığı&quot; için, bu başlangıca (Şekil 3 gibi bir 60-saniye başlangıç ​​için, yani 50-60 sn) ve son 10 sn girin. </li><li> Derneği ve ayrışma adımlar arasında sinyal vardiya en aza indirmek için &quot;Inter-adım Düzeltme&quot; kutucuğunu işaretleyin. Baseline veya Ayrışma align seçin. </li><li> Çoğu durumda Savitzky-Golay filtreleme işlevini seçiniz ve tıklayınız &quot;Süreç Veri!&quot; devam etmek. Gözle kontrolson işlenen veriler (alt sağ panel). Sinyal izleri Derneği ve ayrışma adımlar arasında önemli bir değişim gösteriyorsa, (Şekil 4 gibi) global veri analizi için tasarlanan deneyleri ile, &quot;Inter-adım Düzeltme&quot; için Ayrışma veya Baseline seçimini değiştirmek ve Veri geçmeden önce veri işleyemeyiz Analiz. </li></ol> 4. Veri Analizi Başlamak için Veri Analizi &quot;Analiz&quot; sekmesini tıklayın. Not: Örnek birden fazla bağlayıcı / ayrılma eğrileri genel analizi için (Şekil 3 &#39;de olduğu gibi) aşağıda adımları tekrarlayın. <ol><li> &quot;Analiz Adım&quot; için, birleşme ve ayrılma seçin. &quot;Model&quot; için, 1:01 seçin. Not: diğer sınırlı seçenekleri mevcuttur. </li><li> &quot;Montaj&quot; için, (Full) Küresel seçin. &quot;By Group&quot; için (grafiğin yanı) Renk seçin. (R max bağımsız takılmasını sağlamak için &quot;Sensör tarafından Unlinked R max&quot; seçiniz par bağlayıcı doyurarak üzerine maksimum sinyal tepkisi) hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​tner. Not: sensörler hareketsiz protein miktarı biraz farklı olarak biz (Şekil 3, Yükleniyor bakınız), en deneyleri için bunu yapmak. </li><li> Gösterilen masanın üzerinde, analiz edilecek tüm sensör izleri aynı renk var, bu yüzden küresel olarak analiz edilecektir emin olun. Gerekirse, bir veya birden fazla sensör küresel uymasından atlarsanız izleri seçin: &quot;Dahil&quot; sütununda, istenen sensör pozisyonunda sağ tıklayın ve &quot;Wells dışla&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Fit Curves!&quot; Tıklayın doğrusal olmayan regresyon analizi başlatın. (Şekil 4 gibi) sensör veri izleri ile regresyon eğrileri (i) bindirme, montaj artıklar (ii) araziler ve kararlı bir parametre değerleri (oran sabitleri, R max ile (iii) bir tablo eklemek uydurma sonuçlarını incelemek, K D) ve istatistik parametreler için (standart hatalar, Ki-kare, R 2). </li><li> &quot;Veri Aktarma&quot; başlığı altında, &quot;İhracat Tablo için. Csv File&quot; tıklayarak uydurma sonuçları kaydedin. Grap içinhing veya diğer yazılımı ile veri / donatılmış eğriler daha fazla analiz, bir metin dosyasındaki her sensörün verilerini ve donatılmış eğrisi kaydetmek için &quot;İhracat Montaj Sonuçlar&quot; butonuna tıklayınız. </li></ol>

<ol>
	<li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis.">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li><li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li><li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes.">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li><li>Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enzymes.">The Enzymes.</a> Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).</li><li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+subunit+&#949;+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase.">The role of subunit &#949; in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li><li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+(F1)+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation.">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).</li><li>Mirsaeidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+40+years,+new+medicine+for+combating+TB.">After 40 years, new medicine for combating TB.</a> Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).</li><li>Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F1-ATPase+of+Escherichia+coli:+The+&#1013;-inhibited+state+forms+after+ATP+hydrolysis,+is+distinct+from+the+ADP-inhibited+state,+and+responds+dynamically+to+catalytic+site+ligands.">F1-ATPase of Escherichia coli: The &#1013;-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands.</a> J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).</li><li>Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor:+glycosylation,+trafficking,+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface.">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li><li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein.">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li><li>Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

Yazarlar, Çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

BLI için şu anda mevcut araçlar biyomoleküler etkileşimler için deneylerinde önemli verim ve esnekliğe izin verir. Çeşitli çözelti örnekleri siyah mikrotitre levhasının küvetleri içerisinde dağıtılır ve paralel BLI sensörler bir dizi tabağın kuyu sütunlar arasında ileri ve geri hareket ettirmek için programlanmıştır. Numuneler tahlil boyunca orbital çalkalama ile karıştırılır. Burada kullanılan sistem 8 sensörleri ve 96 oyuklu bir plaka örnek kullanır, ancak başka bir sistem 16, ...

Protein-protein etkileşimleri, birçok biyolojik sürecin önemli olan ve yüzey plazmon rezonansı (SPR) gibi etiket içermeyen optik yöntemler 1 bağlanması ve ayrışma kinetikleri incelemek için in vitro olarak kullanılmıştır. Çoğu etiket içermeyen yöntemleri, sensor yüzeyi üzerine hareketsiz bir biyomolekülün ve hareketsizleştirilmiş biyomolekülün 1 ile ilişkilendiren olarak çözeltiden bir bağlanma partneri tespit etmek için bir optik sinyal kullanır. SPR, son derece hassas bir yöntem olmasına rağmen, bunun nedeni sensörün 2 üzerinde akan solüsyonun kırılma endeksi değişikliklere girişime maruz kalır. SPR, Bio-katmanlı interferometrisi (BLI) gibi duyarlı değil az numune bileşiminde 1,3 değişikliklerden etkilenir rağmen. BLI ucunda özel bir biyouyumlu kaplamaya sahip fiber optik biyohissedicilerin kullanır. (Sekizli-RED96) Burada kullanılan sistemi sekiz spektrofotmetrelere içerir. Beyaz ışık bir robot kol hareket prob bir satıra taşınıyor. Fiber optik sensörler are problar tarafından yakalandı ve numuneleri ihtiva eden 96 oyuklu bir plakaya taşınır. Hedef moleküllerin bir biyoalgılayıcı yüzey üzerinde immobilize edilir. Daha sonra sensör çözelti içinde bağlanma ortağı ihtiva eden oyuklara taşınır. BLI hareketsizleştirilmiş molekül ile bağlanma partnerinin ilişki izler ve daha sonra bağlanma partneri olmadan çözeltisine hareket sensörleri sonra ayrışma izler. Biyosensör yüzeyine moleküllerin bağlayıcı bir iç yüzeyinden ve sensör ve çözüm arasındaki dış arayüzünden geri Spektrofotometrelerin yansımadı ışık dalgaları arasındaki optik girişime değişikliklere yol açar. Girişim bu değişiklikler, miktarı ve Şekil 1 &#39;deki animasyon özetlendiği gibi, bağlayıcı ve ayrışma kinetik oranlarını belirlemek için kullanılabilir. Biz katalitik bakteriyel ATP sentaz kompleksi ve enzim oto-inhibe olabilir onun ε alt birimi arasındaki etkileşimleri ölçmek için BLI uyguladık. ATP synthase sentezi ve ATP 4 hidrolizini katalize eden bir zara gömülü döner nanomotor olduğunu. Katalitik kompleksi (F 1), bir ATPaz olarak çalışan bir çözünür bir biçimde izole edilebilir. Alt-birim ε iki etki var N-terminal alanı (NTD) doğru montaj ve enzimin işlevsel bağlanması için gerekli olan ancak katalitik alt birimleri ile doğrudan etkileşim değildir, C-terminal sahası (CTD) ile etkileşerek enzimi inhibe Birden fazla alt birimler katalitik 5,6. Bu, ε-aracılı düzenleme bakteri ATP sentaz özgüdür ve mitokondriyal homologunun gözlenmemektedir. Ilaca dirençli tüberküloz 7 tedavisinde bedaquiline son zamanlarda FDA onayı ile gösterildiği gibi, ATP sintaz, antibakteriyel ilaçlar için bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. Böylece, ilaç keşfi için ε inhibitör rolünü hedef mitokondriyal ATP sentezini inhibe yok antibakteriellerle verim verebilecek. İzole edilmiş katalitik kompleksi (F 1), ile, εçözünmeyen bir alt birim olur. Bununla birlikte, F 1 bağlanmıştır ε ile εCTD kısmen enzimin orta boşluk içine sokulması ve doğrudan doğruya 6,8 ayırmak mümkün olan önleyici durumunu oluşturan, dramatik bir konformasyonel değişikliği tabi olabilir. Biz katalitik site ε en konformasyonuna ligandları allosterik etkilerini incelemek için, dolaylı olarak F 1 / ε bağlanma ve ayrışma kinetiği ölçmek ve BLI kullanın. Sistemimizde, ε (SPR) gibi BLI sinyal yana algılayıcı yüzeyi üzerinde hareketsiz hale getirmek için seçildi yüzeyinde bağlayıcı moleküllerin kütlesinin duyarlıdır. Ε alt birim ana F 1 kompleksi (~ 347 kDa), küçük (~ 15 kDa) görecelidir. Bu nedenle, daha büyük bir BLI sinyal hareketsizleştirilmiş ε, F 1 bağlanmasını ortaya çıkar. Çok yavaş olabilir F 1 ayrışma, izleme amacıyla, ε güçlü hareketsiz olması gerekir. Böylece biotinylate seçtiVe streptavidin kaplı biyosensör üzerinde hareketsiz. Proteinler yüzey lisin 9 (i) rastgele modifikasyon, bir biotin-maleimid maddesi 10 ya da (iii) genetik olarak enzimatik sırasında biyotinile belirli bir biotin-peptidi alıcı ekleme ile eşsiz bir yerel veya tasarlanmış sistein (ii) reaksiyonu ile biyotinile edilebilir etiketli proteinin 11 in vivo ifadesi. Sistemimizde, ε yöntem (iii) 8 kullanılarak biyotinile edilir. Biotin-etiketli streptavidin ε sensör üzerinde immobilize olduğu zaman, BLI bağlanması ve alt-birimi ε (F 1 (ε-)) içinde tükendiği F 1 ayrışımı ölçebilen. Burada tarif edilen deneyler için, ön deneyler sensörleri hareketsiz hale getirmek için biotinlenmiş proteinin uygun miktarlarının tespiti için yapılmıştı. Bu, proteinin molekül ağırlığı ve bağlanma partneri üzerinde bağlı olarak değişebilir, ancak hedef hareketsiz protein t az miktarda tespit etmektirhat içerir (i) olarak uygun bir sinyal-gürültü a (K D aşağıda) bağlanma partnerinin düşük konsantrasyonu ve bağlanma partnerinin yakın doyurulması konsantrasyonu ile kinetik bağlanmasının (ii) en az bozulmayla kinetik bağlanma için. Ayrıca, biyotinilasyon stokiyometrisi tutarlı BLI sinyali streptavidin kaplı üzerinde hareketsizleştirilmesi sırasında elde edilebileceğini teyit etmek için değişebilir (ancak&gt; 1 biyotin mol / mol protein önlemek), bu deney, bir ilk biyotinile edilmiş proteinin her yeni yeri için gerekli olabilir sensörler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

Biz, Escherichia coli ATP sintaz katalitik alt birim kompleksi ile ε önleyici etkileşimleri incelemek için Bio-interferometrisi tabaka kullanılmasını tarif eder. Bakteriyel F-tipi ATP sentaz ilaca dirençli tüberküloz mücadele için yeni bir FDA onaylı antibiyotik hedefidir. Alt birim ε C-terminal alanı ile ATP sintaz anlama bakteri spesifik oto-inhibisyon antibakteriyel ilaçların keşfi için enzim hedef için yeni bir yöntem sağlayabilir. Ε ait C-terminal alanı, aktif ve aktif olmayan durumlar ve katalitik site ligandlar arasındaki geçişler enzim baskın olduğu ε en konformasyonlarının hangi etkileyebilir dramatik bir konformasyonel değişime uğrar. Ε dolaylı olarak bir bağlayıcı / katalitik kompleksi ile ayrışma ve mea ait deney, kinetiksureler görünüşte nondissociable inhibitör konformasyon ve enzim bağlı ε kayması. Bio-tabaka Interferometri sinyal çözelti bileşiminde aşırı duyarlı değildir, bu yüzden de ε en şekilsel değişikliklere katalitik-sitesi ligandların allosterik etkilerini izlemek için kullanılabilir.

Gerçek zaman bağlanma ve ayrılma BLI kinetiği Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Bu deney Birleşme ve ayrışmaya olarak deney tamponu ile yapıldı. Sensörler sadece kısaca ön ıslatılmış olmuştu çünkü bu deney, 10 dakika temel adımla başladı. Daha sonra, biyotinile edilmiş ε sensör üzerine yüklenmiştir. Ε farkedilir bir ayrışma bağlayıcı bir ortak ilave vardı referans eğrisinin (G) görüldüğü gibi, geriye kalan tüm adımlar boyunca oluştu. Bir ikinci referans senso...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects at JoVE.com

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

Burada protokolleri Bio-tabaka interferometrisi ile protein-protein etkileşimleri kinetik analizleri tarif eder. Hücresel enerji metabolizmasında yer alır F tipi ATP sintaz, bakteriler kendi ε alt birimi ile inhibe edilebilir. Biz, ε inhibitör C-terminal alanı ile katalitik kompleksinin etkileşimleri incelemek için Bio-tabaka interferometre adapte edilmiştir.

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

28.7K Görüntüleme.  SUNY Upstate Medical University.  Burada protokolleri Bio-tabaka interferometrisi ile protein-protein etkileşimleri kinetik analizleri tarif eder. Hücresel enerji metabolizmasında yer alır F tipi ATP sintaz, bakteriler kendi ε alt birimi ile inhibe edilebilir. Biz, ε inhibitör C-terminal alanı ile katalitik kompleksinin etkileşimleri incelemek için Bio-tabaka interferometre adapte edilmiştir. 

Video: Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Kimya

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Kolloidal Probe Nanoscopy kullanarak parçacık-parçacık Etkileşimleri Nicel ve Nitel Sınav

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature solvents. These coordinating ligands help solubilize and stabilize the nanoparticles while in solution, and can influence the resulting size and reactivity of the nanoparticles during their formation. Despite the ubiquity of using ligands during synthesis, the presence of aliphatic ligands on the nanoparticle surface can result in a number of problems during the end use of the nanoparticles, necessitating further ligand stripping or ligand exchange procedures. We have developed a way to synthesize cadmium sulfide (CdS) nanoparticles using a unique sulfur copolymer. This sulfur copolymer is primarily composed of elemental sulfur, which is a cheap and abundant material. The sulfur copolymer has the advantages of operating both as a high temperature solvent and as a sulfur source, which can react with a cadmium precursor during nanoparticle synthesis, resulting in the generation of ligand free CdS. During the reaction, only some of the copolymer is consumed to produce CdS, while the rest remains in the polymeric state, thereby producing a nanocomposite material. Once the reaction is finished, the copolymer stabilizes the nanoparticles within a solid polymeric matrix. The copolymer can then be removed before the nanoparticles are used, which produces nanoparticles that do not have organic coordinating ligands. This nascent synthesis technique presents a method to produce metal-sulfide nanoparticles for a wide variety of applications where the presence of organic ligands is not desired.

Herein we present a method to synthesize ligand-free cadmium sulfide (CdS) nanoparticles based on a unique sulfur copolymer. The sulfur copolymer operates as a high temperature solvent and a sulfur source during the nanoparticle synthesis and stabilizes the nanoparticles after the reaction.

Bir Kükürt Kopolimer Matrix içinde ligand-serbest CdS Nanopartiküller Sentezi

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, 1,4-benzene-bis(iminoguanidinium) (BBIG), is demonstrated. The ligand is synthesized as the chloride salt (BBIG-Cl) by in situ imine condensation of terephthalaldehyde with aminoguanidinium chloride in water, followed by crystallization as the sulfate salt (BBIG-SO4). Alternatively, BBIG-Cl is synthesized ex situ in larger scale from ethanol. The sulfate separation ability of the BBIG ligand is demonstrated by selective and quantitative crystallization of sulfate from seawater. The ligand can be recycled by neutralization of BBIG-SO4 with aqueous NaOH and crystallization of the neutral bis-iminoguanidine, which can be converted back into BBIG-Cl with aqueous HCl and reused in another separation cycle. Finally, 35S-labeled sulfate and &#946; liquid scintillation counting are employed for monitoring the sulfate concentration in solution. Overall, this protocol will instruct the user in the necessary skills to synthesize a ligand, employ it in the selective crystallization of sulfate from aqueous solutions, and quantify the separation efficiency.

A protocol for in situ aqueous synthesis of a bis(iminoguanidinium) ligand and its utilization in selective separation of sulfate is presented.

bir bis-iminoguanidinium ligand ile seçici kristalleştirme ile Sülfat Ayırma

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Tek Molekül Kuvvetleri Spektroskopisi kullanarak İnorganik Malzemelerle Amino Asitler ve Peptitler Etkileşimi içine Trendleri

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that derive from initial 2-bromo-2-butene lithiation followed by acid mediated dienol cyclization. The revised synthesis and purification of the ligand avoids the use of mechanical stirring while still permitting access to significant quantities (39 g) of Cp*H in good yield (58%). The procedure offers other additional benefits, including a more controlled quench of excess lithium during the production of the intermediate heptadienols and a simplified isolation of Cp*H of sufficient purity for metallation with transition metals. The ligand was subsequently used to synthesize [Cp*MCl2]2 complexes of both iridium and ruthenium to demonstrate the utility of the Cp*H prepared and purified by our method. The procedure outlined herein affords substantial quantities of a ubiquitous ancillary ligand support used in organometallic chemistry while minimizing the need for specialized laboratory equipment, thus providing a simpler and more accessible entry point into the chemistry of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene.

Reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented. The revised protocol for the synthesis and purification of the ligand minimizes the need for specialized laboratory equipment while simplifying reaction workups and product purification. Use of Cp*H in the synthesis of [Cp*MCl2]2 complexes (M = Ru, Ir) is also described.

Değerli Ligand Erişme Geçiş Metaller için altlıklar: 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene bir Modifiye, Ara Ölçeği Hazırlık

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Çekirdekleşme ligand-aracılı ve Paladyum Metal nano tanecikleri gelişmesi

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.