Görüntüleme Dr Martin Spitaler tarafından yönetilen Imperial College London FİLM tesis, içinde bulunan dik bir Leica SP5 konfokal mikroskop üzerinde gerçekleştirildi. Numune tutucu ve miğfer Samuel Jones ve Dr Simon Schultz tavsiye ile, Imperial College London Kimya Mühendisliği departmanı ile işbirliği içinde yapıldı. Nicola Ruivo Francisco Diaz ve Imperial College&#39;da CBS personeli fare hayvancılığa onların yardım ve tavsiye için etkili oldular. Mark Scott CRUK, KKLF, BBSRC ve HFSP tarafından CRUK ve Cristina Lo Celso tarafından HFSP ve FİLM, Olufolake Akinduro tarafından finanse edilmektedir.

Hayvanların kullanımını içeren tüm işlemler, yerel mevzuata uygun olarak yürütülmektedir. Çalışmalarımız İngiltere&#39;de Home Office yanı sıra Imperial College etik paneli tarafından onaylanmıştır. Izin prosedürleri proje ruhsat belgelerinde açıklanan ve her zaman hayvan refahını sağlamak yönergeleri izleyin edilir. Işin yapıldığı ülkenin hayvan deneyleri ile ilgili mevzuata uymak için emin olun. 1. Etiketleme ve HSPCs Enjeksiyon: <ol><li> Lo Celso 14-15 tarafından tarif edildiği gibi hasat hücreleri. </li><li> PBS içinde 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda, hücrelere hazırlayın. NOT: hücreleri saymak için Hemasitometre veya hücre ayırıcı tarafından sağlanan bilgileri kullanın; etiketlenmiş ve enjekte edilecek olan hücre sayısı (- 20,000 HSClerin, 100,000 - örneğin 10.000 leke 300,000 HPC), hücre tipine bağlı olarak değişir; en az 10 5 hücreleri, 100 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ile çalışma durumunda; Serum boyama inhibe gibi, herhangi bir serum olmadan PBS hücrelerin olması önemlidir. </li><li> 5 uM&#39;lik bir nihai konsantrasyonda, hücre süspansiyonu için yaptığı ve solüsyonun dışında çökelmesi ve hücreleri etiketlemek için başarısız değildir boya sağlamak için derhal girdap süspansiyonu ekleyin. </li><li> , 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de eğirme sıvı ayrıldı ve, IV enjeksiyonu (- 150 ul ~ 100) için uygun bir hacmi içinde topağın tekrar askıda bırakılmasıyla yıkanmakta, daha sonra 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca inkübe </li><li> 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve bir insülin şırınga içine toplar. NOT: fare için tüm hücre süspansiyonu tatbik edilmesini sağlar, bu nedenle hiçbir iğne ölü alanı vardır ve bu nedenle bir ensülin şırınga bilinen bir şırınga fazla tavsiye edilir. </li><li> Kuyruk ven enjeksiyon yoluyla ölümcül bir ışınlanmış fare içine hücreleri enjekte edilir. NOT: ti gelişir kemik iliği mikro (hematopoetik ve stromal bileşenleri hem de), üzerine Işınlama bilinir, önemli darbeben. Bu tutarlı bir ışınlama için zamanlama, hücre enjeksiyon (en iyi bütünleşme için radyasyondan sonra 4-24 saat) ve görüntüleme sağlamak için bu nedenle çok önemlidir. İşte ışınlama enjeksiyon öncesi 6 saat yapılır ve görüntüleme enjeksiyondan sonra 20 saat yapılır. <ol><li> Kuyruk toplardamanndan yapılan vasodilated görünene kadar sıcak odasına (37 ° C) fare yerleştirin. </li><li> Süzgeç içine fareyi hareket ettirin ve dikkatle kuyruk damar içine iğne kaydırın. </li><li> Ven içine hücreleri enjekte - enjeksiyon için hiçbir direnç karşılaştı edilmelidir. </li><li> Hücreler, kemik iliği alanlarına göç olanak sağlamak amacıyla fare O / N bırakın. </li></ol></li></ol> 2. Görüntüleme için Fare hazırlanması <ol><li> Ince forseps ile bir çift ince bir çift makas gibi, steril bir ortamda bir kullanım öncesi başlık parçası ve mağaza otoklava. </li><li> Mümkün olduğu kadar taze anestetik Makyaj (0.38 ml Ketamin + 0.25 ml Medetomidin + 4.47 ml Su). NOT: otizofluran ve diğer enjektabl dahil olmak üzere ona onaylı anestetikler, çok etkili olacaktır. 1 saat için her 45 dakikada bir uygulanır, 50 ul - anlatılan kokteyl 30 üst-up ile, vücut ağırlığının her 10 gramı başına 0.1 ml periton içine tatbik edilecektir. </li><li> Gerekirse istendiğinde sahne kalibre, mikroskop ve yazılımı başlatmak iki foton lazer açın. Lazerler açın ve onları ısınmak ve görüntüleme için fareyi hazırlarken stabilize sağlar. </li><li> Intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi için seçilen anestezik hazırlanan karışım (adım 2.2) kullanılarak fare anestezisi. Şimdi ve protokol boyunca düzenli aralıklarla pedal refleks ile derin anestezi başlangıcını izleyin. NOT: fare işlem boyunca dikkatle izlenmeli ve anestezi yıldırım görünüyorsa gerekir - (2.2 ayrıntılı olarak) (tipik sonra 45 60 dk) daha sonra bir üst-up dozunu uygulamak. Farklı yaş ve cinsiyet fareler arasında bazı varyasyon bekliyoruz. Bu koroYeterli önlemleri sağlamak için yerel veteriner memuru ile anestezi protokolünü görüşmek üzere tant fare refahını sağlamak için alınır. </li><li> Fare gözünde herhangi etanol elde etmek için değil sağlanması, bir doku üzerinde% 70 etanol ile kafa derisi üst çubukla. </li><li> Steril forseps ve makas kullanılarak, dikkatli bir yansıması için kalvaryumun alanı ortaya çıkarmak için kafa derisi orta bölümünü kaldırın: forseps ile cildi kaldırarak kulakları arasındaki başın arka kısmında küçük bir kesi yapmak. Cilt yukarıda tutarak, derinin altına makas kaydırın ve yavaşça istenen görüntüleme alanının dışından birlikte kesti. </li><li> Nemli tutmak için steril PBS ile nemlendirilmiş steril pamuklu çubukla maruz kemik silin. </li><li> Görüntüleme için hazır fare kafatası metal kafa parça takın. <ol><li> Bu, bir macun haline gelene kadar bir ağırlık tekne diş çimento yeterli miktarda karıştırıp ve hızlı bir şekilde s eklenecektir baş kısmının alt yüzeyine uygulamakkull. </li><li> Çimento setleri önce, sonra, emin görüntüleme alanında herhangi bir diş çimento almak için değil yapım, fare kafatası üzerine baş kısmını yerleştirmek ayarlandığı için bekleyin. </li><li> Kafatası nemli tutar Site içi Hidrojeli küçük bir miktar uygulayın. </li></ol></li><li> Sahibine baş kısmını takın ve oluklar tutucu çentikler sığacak sağlanması, vidayı kullanarak sabitleyin. </li><li> Mikroskop aktarmadan önce steril PBS ile steril pamuk tomurcukları ile kafatası ve temiz gelen hidrojel çıkarın. </li><li> , Mikroskop aşamaya yuvasını fare altındaki ısıtma mat konumlandırmak, rektal termometre probu yerleştirin ve yapışkan bant ile sahnede yerde her şey güvenli. </li><li> Onlar anestezi altında iken kurumasına etmemelerini sağlamak için fare gözleri oftalmik merhem küçük bir damla koyun. NOT: anestezi altında iken fare görüntüleme işlemi sırasında herhangi bir anda sahipsiz bırakılmamalıdır. </li></ol>İn Vivo Görüntüleme: Yüksek çözünürlüklü Bacaları ve Time-lapse Toplama <ol><li> Göz parçaları ile kafatası odaklanın. <ol><li> , Saflaştırılmış, steril su ve bir su daldırma lens kullanarak görüntüleme penceresini doldurmak o su damlasını değecek şekilde indirin. </li><li> Işık kaynağı gibi harici bir lamba kullanarak, mikroskop mercekleri kullanılarak kafatasının üst Odak. </li><li> Merkezi dikiş üzerinde görüntüleme alanını yerleştirin ve bir başlangıç ​​pozisyonu olarak koronal sütür bulmak için kafa arkasına doğru hareket ettirin. </li></ol></li><li> Eksitasyon ve emisyon tabloda belirtilen ilgili florofor etkili uyarı ve tespit izin vermek için mikroskop ayarlayın. NOT: Geleneksel galvanometre tarama kafası LAS-AF yazılım platformu ile çalışan bir Leica SP5 dik konfokal Burada kullanılan iken, prosedür kolayca diğer mikroskop / yazılım platformları çoğaltılmış olabilir. Burada kullanılan objektif Leica HCX IRAPO L 25x W / 0.95 NA bDiğer üreticilerin ut eşdeğer lensler uygun büyütme ve yüksek NA mevcuttur <ol><li> 512 x 512 piksel hem XY görüntülerin yanı sıra 400 Hz 3D Z-yığını ve set görüntüleme hızı ve çözünürlüğü yakalamak için bir moduna yazılımı yerleştirin. NOT: Kurulum ve donanım burada 620 mikron bir görüş alanı neden ve bu diğer platformlarda farklı olabilir. </li><li> Birden fazla kanal / parça yanı sıra toplama yöntemi en azından yığınlarının mümkünse veya çerçeveler arasında var ayarlarını değiştirmek için ayarlanmış sağlamak, yakalanan edebiliyoruz, böylece yazılımı ayarlayın. Her yığının edinimi sonunda lazer aydınlatmasını kapatmak, 3 bağımsız çekim ayarlarını ayarlayın. Not: üç kanal kanallar arasında çapraz etkiyi azaltmak için, bu işlem için gerekli olacaktır. </li><li> Kurulum iki foton SHG kemik sinyali (840 nm uyarım; 400-440 nm emisyon) için ilk ardışık tarama için ayarlar; MP lazer için deklanşörü açın ve M sağlamak% 25 ve lazer açıldığında - P kazancı ve ofset doğru kurulum vardır, lazer güç 12.5. Tek dedektör gibi uygun bir PMT seçin ve beyaz rengini değiştirmek. Not: Mevcut bir parlak, daha derin sinyal elde etmek için ne zaman uygun filtreler ile NDD dedektörler kemik tespiti için kullanılmalıdır. </li><li> Tekrar kanal kurulumu kombine otofloresansı için GFP kanal için kullanılan prosedür (543 nm uyarma; 560 - 600nm emisyon) ve DiD (633 nm uyarım; 650-720 nm emisyon) ikinci ayarları altında iki uygun PMT kullanarak, tarayın. Otofloresansı için yeşil ve DiD için kırmızı kanal rengini değiştirin. Not: Otomatik-floresan kanal iki kanal yerleştirilmiştir edilir DiD pozitif hücrelerin daha kolay algılanmasını sağlar gibi yeşil kullanılarak - autofluorescent hücreler nedeniyle iki kanal süre olmak üzere sarı / turuncu renkte görünür DiD hücreleri sadece onlar sadece görünür beri kırmızı olarak görünür kanal DiD. Otomatik floresan kanalgörüntüleme amaçları GFP kanal ile karışıklığı önlemek için, kullanıcının, bu farklı bir renk değiştirilebilir istediği, ancak, yalnızca, bu karşılaştırma için kullanılan herhangi bir son analizde kullanılmaz. </li><li> Son olarak kurulum GFP için üçüncü ve son tarama (488 nm uyarma; 500-530 nm emisyon); Gerekli ve sonra etrafında% 15 488 nm lazer çizgisinin lazer gücünü ayarlamak veya lazer için uygun bir seviye sadece aktif dedektörü olarak uygun bir PMT seçmek ve yeşil onun PseudoColor değiştirmek, kullanıldıkları takdirde obtüratör açık olduğundan emin olun. </li><li> Seçilen kanalın bir önizleme taraması başlar ve dedektör Kazancı ayarlamak ve optimal pozlama için Ofset için bir &#39;Canlı&#39; görüntüleme modunu etkinleştirin. Sıralı penceresinde her tarama için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Kolayca yeniden bu çok kanallı tarama ayarları kaydedin. NOT: Bu kullanıcı sonraki oturumlarda ayarlarını yeniden sağlar. </li></ol></li><li> &#39;Mark a olarak adlandırılan çok-pozisyon yakalama etkinleştirinnd gösterdi yazılım &#39;bulun ve koordinat noktalarını sıfırlayın. </li><li> Merkez ve koronal sütür arasındaki kesişme başlayarak, kemik görüntüleme alanını taramak, hem otoflüoresanı kullanarak kemik iliği alanının derinliğini tarama (sözde yeşil renkli) ve DiD (pseudo-kırmızı renkli) bir bileşik görüntüsü. NOT: autofluorescent hücreler her iki kanal mevcut olabilir ve etiketlenmiş hücreler kompozit görüntü kırmızı-tek hücreler olarak görünür MUYDUNUZ ise kompozit görüntü sarı / turuncu görünecektir. </li><li> Bir hücre tespit edildiğinde, Mark &quot;sol taraftaki Yeni Pozisyon simgesini ekle&quot; Find &quot;penceresinde tıklayarak aracını yeni bir koordinat konumuna (x, y ve z) olarak işaretlemek &#39;Mark ve bulun&#39; . </li><li> Görüş mevcut alan incelendiğinde edildiğinde, sol / sağ / yukarı / aşağı ya bakış bir alanın evre mesafe taşımak. Yavaş yavaş th solundaki bütün görüntüleme pencere alanının etrafında çalışma, görüş her alan için bu işlemi tekrarlayıne merkezi sütür, fare burnuna doğru hareket. Merkezi dikiş çatallanma görünürde sonra, dikiş sağ tarafına gidin ve (koronal sütür doğru, yani) ters yönde sol tarafı taramaya işlemi tekrarlayın. Kullanarak ilgi herhangi bir yeni hücre koordinatlarını işaretleyin &#39;Mark ve Bul&#39; aracı. </li><li> Görüntüleme penceresi Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, &#39;Mark ve bul kullanmak noktaları gözden aracını (istenen noktayı seçin ve tek tek her noktasını gözden). Her pozisyon için her hücrenin Z-yığını üst ve alt Set, (birçok yazılım platformları boşluk yakalayan azaltır her pozisyon için bağımsız z-yığınları yapmak için izin verecektir). Her noktası için, netleme ve aşağı ve 3D z-yığın yakalama için üst ve alt Z pozisyonlarını ayarlayabilir ve bireysel noktasını güncelleştirmek &#39;Mark ve bul. 5 um Z-Stack aralığını ayarlayın ve uygun bir kalite her sıralı tarama kanal için ortalama: Çizgi or Çerçeve ortalama. NOT: ortalamasına taramalarının sayısını arttırmak iktisap süreyi artırır. </li><li> Tüm tarama işlemine başlarken tarafından ilgi her bir nokta için yüksek kaliteli referans yığını Edinme (genellikle oldukça &quot;Capture&quot; den &#39;Başlat&#39; olarak anılacaktır). NOT: Bu tarama gelecekte yüksek hızlı görüntüleme için bir referans olarak hareket edebilir. </li><li> Bir kez, yüksek kaliteli tarama ile tamamladı yakalanması için bir time-lapse ayarını etkinleştirin. </li><li> Time-lapse ayarları, istenilen uzunlukta (örneğin, 5 saat) 5 dakika ve genel çalışma süresi için zaman aralığını ayarlayın. Genel tarama için bu ayarları &#39;Uygula&#39;. NOT: Bir 5 dakika zaman atlamalı aralığını sağlamak için bu tarama süresini azaltmak amacıyla, bir, ortalama için kullanılan taramaları sayısını azaltmak 512 x 512 piksel çözünürlüğünü sınırlamak, gerekli faz düzeltme ile (çift yönlü için tarama dönüştürmek gerekebilir ) Her iki tarama yön align ve / veya 600 Hz veya daha fazla (daha fazla 600 tarama hızını arttırmak içinHz) gösterdi yazılım platformu için görüntüleme alanının yakınlaştırma neden olacaktır. Bu sıralı görüntüleme modu, başlangıçta bir yüksek kaliteli görüntü yığını elde etmek için kullanılan iken, eşzamanlı kazanım time-lapse görüntüleme sırasında hızını artırmak için kullanıldığına dikkat etmek de önemlidir - bu ekstra yerleştirir kanallar arasında bazı hafif çapraz konuşma neden olabilir doğru ayrılmış referans yığınlarının ilk yakalama üzerinde önemi. </li><li> (Göstermiştir yazılımında &#39;Başlat&#39; düğmesine tıklayarak önceki gibi) görüntüleme başlayın. NOT: kurumasına ve vital bulguları ve ısıtma-pad sıcaklığını izlemek değil, düzenli, gerektiğinde fareyi aşırı doz için dikkatli olmak, daha küçük dozlarda uygulanması ile anestezi uygun seviyesini korumak amacını sağlamak için su kontör emin olun boyunca. </li><li> Bittiğinde, rektal prob ve h telleri sağlanması, sahibinden lensi kaldırın ve daha sonra mikroskop aşamasından tutucusunu çıkarınmat yeme zarar görmezler. </li><li> Sahne sahibinin baş kısmını sökün ve dikkatlice fareyi çıkarın. Servikal dislokasyon kullanarak fare itlaf ve kafatası kapalı takarak metal kafa-parça kaldırın. Verilerin diske kaydetmek ve daha sonra analiz için sunucusuna aktarmak. Not: baş parçası, ideal olarak birkaç saat boyunca aseton içinde daldırma ve son olarak kalan çimento kapalı sürtünme ile temizlenir. </li></ol>

<ol>
	<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hematopoietic+Stem+Cell+Niche+at+a+Glance.">The Hematopoietic Stem Cell Niche at a Glance.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Wang, L. D., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Niches+in+the+Origination+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dynamic Niches in the Origination and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 643-655 (2011).</li><li>Schofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relationship+Between+the+Spleen+Colony-forming+Cell+and+the+Hematopoietic+Stem+Cell.">The Relationship Between the Spleen Colony-forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell.</a> Blood Cells. (1-2), 7-25 (1978).</li><li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+Between+Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Fibers.">Interaction Between Satellite Cells and Skeletal Muscle Fibers.</a> Development. 109 (4), 943-952 (1990).</li><li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-retaining+Cells+Reside+in+the+Bulge+Area+of+Pilosebaceous+Unit:+Implications+for+Follicular+Stem+Cells,+Hair+Cycle,+and+Skin+Carcinogenesis.">Label-retaining Cells Reside in the Bulge Area of Pilosebaceous Unit: Implications for Follicular Stem Cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis.</a> Cell. 61 (7), 1329-1337 (1990).</li><li>Doetsch, F., Caill&#233;, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+Zone+Astrocytes+are+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+Mammalian+Brain.">Subventricular Zone Astrocytes are Neural Stem Cells in the Adult Mammalian Brain.</a> Cell. 97 (6), 703-716 (1999).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Calcium+Signalling+Using+Genetically+Targetable+Fluorescent+Indicators.">Measuring Calcium Signalling Using Genetically Targetable Fluorescent Indicators.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Cellular+Imaging+Pinpoints+the+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+in+the+Early+Steps+of+Adult+Hematopoietic+Reconstitution.">In vivo Cellular Imaging Pinpoints the Role of Reactive Oxygen Species in the Early Steps of Adult Hematopoietic Reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+Specialized+Bone+Marrow+Endothelial+Microdomains+for+Tumour+Engraftment.">In vivo Imaging of Specialized Bone Marrow Endothelial Microdomains for Tumour Engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+Tracking+of+Individual+Haematopoietic+Stem/Progenitor+Cells+in+their+Niche.">Live-animal Tracking of Individual Haematopoietic Stem/Progenitor Cells in their Niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Functional+Haematopoietic+Stem+Cell+Niche+Using+Real-time+Imaging.">Detection of Functional Haematopoietic Stem Cell Niche Using Real-time Imaging.</a> Nature. 457 (7225), 97-101 (2009).</li><li>K&#246;hler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Cellular+Dynamics+and+Endosteal+Location+of+Aged+Early+Hematopoietic+Progenitor+Cells+Revealed+by+Time-lapse+Intravital+Imaging+in+Long+Bones.">Altered Cellular Dynamics and Endosteal Location of Aged Early Hematopoietic Progenitor Cells Revealed by Time-lapse Intravital Imaging in Long Bones.</a> Blood. 114 (2), 290-298 (2009).</li><li>Schultz, S. R., Kitamura, K., Post-Uiterweer, A., Krupic, J., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Pattern+Coding+of+Sensory+Information+by+Climbing+Fibre-evoked+Calcium+Signals+in+Networks+of+Neighboring+Cerebellar+Purkinje+Cells.">Spatial Pattern Coding of Sensory Information by Climbing Fibre-evoked Calcium Signals in Networks of Neighboring Cerebellar Purkinje Cells.</a> J Neuroscience. 29 (25), 8005-8015 (2009).</li><li>Lo Celso, C., Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+Transplanted+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Mouse+Calvarium+Bone+Marrow.">In vivo Imaging of Transplanted Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Mouse Calvarium Bone Marrow.</a> Nat Protoc. 6 (1), 1-14 (2011).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+(HSCs).">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (2), e157 (2007).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Seeing+to+Believing:+Labelling+Strategies+for+in+vivo+Cell-tracking+Experiments.">From Seeing to Believing: Labelling Strategies for in vivo Cell-tracking Experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relationship+Between+Bone,+Hemopoietic+Stem+Cells+and+Vasculature.">The Relationship Between Bone, Hemopoietic Stem Cells and Vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Nombela-Arrieta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+of+Haematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cell+Localization+and+Hypoxic+Status+in+the+Bone+Marrow+Microenvironment.">Quantitative Imaging of Haematopoietic Stem and Progenitor Cell Localization and Hypoxic Status in the Bone Marrow Microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 15, 533-543 (2013).</li></ol>

There is nothing to disclose.

Ne gerçekleştirildi? Bu protokol Fare kalvaryal kemik iliğinde arıtıldı FACS göçünü ex vivo etiketli nakledilen HSPCs izlemek için hızlandırılmış çok boyutlu görüntüleme kullanır. Tek nakledilen hücrelerin tanımlanması elde edilmiştir ve bu yüksek doğruluk ile zaman (saat) uzun süreler boyunca takip edilmiştir. Solunum kaynaklı hareket eserler minimize edilmiş ve hücreler tekrar tekrar uzun bir zaman boyunca reimaged edilmiştir. Gelecek tarifi nedir? Tekniğinin geliştirilmesi kısaltmak ve Not (fare kurtarma işlemini kolaylaştırmak için bir hafta veya daha fazla ve bu izofluran gibi gaz anestezik kullanımı boyunca, birden fazla gün görüntüleme için izin kurtarma deneylerde doğru ilerleme olabilir: Kurtarma deneyler kesinlikle gerektirir Steril cerrahi koşullar ve uygun analjezik uygulanması). DevBir in vivo boyaların daha büyük bir renk paleti yanı sıra, aynı zamanda, çok-etiketleme deneyleri kolaylaştırmak kemik iliği içinde hücre-hücre etkileşim daha fazla bilgi sağlar ve gelecekte daha karmaşık deneyler için sağlayacak hematopoietik hücrelerin etkili genetik etiketleme e Gelişim. Ayrıca, birden çok kemik iliği yapıları ve stroma bileşenlerinin eş zamanlı etiketleme HSPC nişler yer alan olayların bir daha tam bir resim sağlayacaktır. Hızlandırılmış filmlerin görüntü kararlılığı ayrıca stabilize edici mikroskop hem de görüntü tarihi algoritmaları kullanarak numune ve postacquisition sıcaklık gradyanları minimize preacquisition geliştirilebilir. Sınırlamalar: Açıklanan tekniği bazı sınırlamalar sunar. Enjekte edilebilir anestetiklerin uygulamasının ardından farelerin hayatta kalma süreleri önceden tahmin edilemez ve bu bireysel yanıtına bağlı olarak tecrübe komplikasyonlara çok kolayanestezik. Fare anestezi kurtarmak için ve fare ideal zaman atlamalı görüntüleme süresini sınırlayarak, tahsil edilecek olup olmadığını dikkatlice planlamak önemlidir genellikle, bir görüntüleme oturumu artık zordur. Enjekte anestezik kullanılması, her görüntüleme oturumda sürebilir zaman sınırlar. Bu anestezik küçük bir doz EÖ tarafından anestezi uzatmak mümkün olsa da, zor bu doğru ve fareyi doz aşımı in vivo görüntüleme erken fesih en sık nedenlerinden biridir gerçekleştirmek olduğunu. Izofluran&gt; 2 saat uzun idare nadiren başarılı sonra gaz anestezi fare ancak hızlı iyileşme, daha az toksik ve daha uzun bir ilk görüntüleme oturumları için izin verir. Tekniğin diğer kısıtlılığı nedeniyle hızla görüntüler elde etmek için gerekliliğine, çok noktalı time-lapse görüntüleme sırasında elde edilebilir görüntülerin sınırlı çözünürlük. Fokal sürüklenme veya alanı ile birleştiğinde, (diski atlar) Yukarıdaki ussed, hücrelerin izleme zorlaştırabilir. Alternatif yöntem Karşılaştırma: HSPCs genellikle DiD lipofilik boya ile etiketlenmiş, ancak [16] gözden gibi DiR ve DII boyalar, eşdeğer alternatifler ve diğer hücre boyalar sürece yeterince parlak kullanılabilir vardır. Hücrelerin ex vivo etiketlendirmesi HKH&#39;lerin uzun vadeli fonksiyonunu etkilemez gösterilmiştir olsak da, bu hücre bölünmesiyle seyreltildi ve neredeyse sınırlama (ya da herhangi bir başka kimyasal boya) sahiptir. HKH&#39;lerin transplantasyonu izleyen ilk günlerde çoğalırlar yana, bu hücreler için gürültü oranı sinyal hızla bozulur. Genetik manipülasyon ve floresan proteinleri ifade ile hücrelerin etiketlenmesi endojen floresan proteinleri kafatası kemik yoluyla tespit edilebilir bir sinyal üretmek için yeterince yüksek seviyelerde ifade edilir sürece, uygulanabilir bir alternatif bir yöntemdir. Alternatif techn vardırMevcut iques kendi yararları ve sınırlamaları ile, kemik iliği alanı içinde her HSPCs görüntülenmesine gerçekleştirmek için. Konfokal görüntüleme cerrahi matkap ile tibia ve kemik minesinin incelmesi ekspojurlar takip ederken, fiber optik tabanlı görüntüleme cihazlarının yerleştirilmesi, uzun kemiklerde [8] kemik iliği sulandırma görüntüleme için izin [12] HSPCs ikamet detaylı görüntülerini üretti uzun kemiklerin çevresel alanları. Bununla birlikte, bu yöntemler, çok daha fazla invasif burada tarif edilen ve bu nedenle aynı fare içinde aynı kemik iliği alanda odaklanarak görüntüleme tekrar ederiz mani olandan bulunmaktadır. Ayrıca, bu teknikler geniş bir çevre dokuda hasar kaçınılmaz cevap veren gözlenen hücrelerini etkiler olasıdır. HSPCs kesilmiş, çatlak uyluk [11] üzerinde yer lamelleri ile kısa bir süre için görüntülenmiş olan, üzerine HSPCs doku bu sert, ancak hazırlama etkisi değil, Clear, ve teknik tek bir zaman noktasında elde etmek için gözlemler benzersiz kullanılmıştır. Sabit kemikler lekeli, seri bölüme ayrılır ve elde edilen görüntüleri damar atmalarını kullanılan, özellikle mükemmel 3D çözünürlük sağlayan bir 3D modeli yeniden inşa edilmiştir [17], ve son zamanlarda Lazer Tarama Cytometry (LaSC) kantitatif elde etmek için kullanılır olmuştur in situ HSPCs tedbirler hakkında, [18] immunboyama tarafından vurgulanan, ancak hücreler davranışları hakkında herhangi bir zamansal bilgi sağlayamıyoruz. Yeni yöntemin tarif edilen teknikler 4D hücrelerin izlenmesi için 3 boyutlu olarak iyi bir çözünürlük, yeterli geçici örnekleme bir kombinasyonunu sağlar ve bu nedenle, kemik iliği ile etkileşim HSPCs uzun süreli izleme elde etmek için ideal bir yaklaşım sağlar, göreceli olarak-invaziv mikroçevresinin.

Kök hücre nişler gibi koku ampul, kas lifi, saç folikülü şişkinlik veya MSS subventricular 4-7 olarak yıllardır 3 tanınan ve de birçok dokuda karakterize edilerek rağmen hematopoetik kök hücreler (HKH&#39;lerin) ve kemik iliği mikro arasındaki etkileşimler ( BM) için hala tam olarak bağlı kemiğe boyunca tek hücrelerin yanı sıra dokunun kendisinin çok sıvı gözlemlemek zor anlaşılır. Farklı hücre tipleri ve düzenleme sinyallerinin karmaşık bir ağ sükunet arasındaki dengeyi düzenlemekten sorumlu olduğunu, kesip çıkartma veya HSC ya da mikro-kendisi stromal hücreler içindeki belirli genlerin aşırı ifade göre fonksiyonel çalışmalarda da bir dizi aracılığıyla, gösterilmiştir , çoğalma, genişleme ve HKH&#39;lerin 1-2 farklılaşması. HKH&#39;lerin ve nişler arasındaki karışma yalnızca doğrudan gözlem yoluyla derinlemesine anlaşılabilir. Bu ach olduğunusadece mikroskopi açısından mevcut teknolojiyi birleştirerek gelişmiş görüntüleme protokollerinin gelişmesine ievable sayesinde, aynı zamanda numune tutucu çözümleri ve toplama yazılımı. Fare kalvaryal kemiklerin BM bölmesine aktarılmıştır hematopoietik kök ve projenitör hücreleri (HSPCs) tek hücre çözünürlüklü canlı görüntüleme aşılanması HSPCs daha olgunlaşmamış hücrelerin SDF-1 ve VCAM-1-pozitif damarların 8-9 yakınma ve bu lokalize olduğunu gösterdi onların döl 10 daha uzak ise GFP pozitif osteoblastik hücreler (osteoblast kısıtlı kollajen 1α promotör GFP sürücüler hangi Col2.3-GFP transgenik fare hattı,) 20 mikron - 15 içinde bulunur. Benzer gözlemler disseke ve kırık femur kemikleri 11&#39;den ve inceltilmiş tibeal kemiklerden 12 elde edildi. Kalvarial kemik iliği Görüntüleme th içinde HSPCs doğrudan görselleştirme ulaşmak için en az invaziv bir yaklaşım kalırEIR yerli mikroçevresinin. Herhangi bir canlı numune, görüntüleme ile, numune hareketi için gereksiz bozulmaları önlemek için mümkün olduğu kadar yine örnek tutmak için içsel bir ihtiyaç vardır. Nefes Kalvaryal kemik iliği görüntülerken kaçınılması gereken fare kafa salınım hareketleri neden olur. Onlar frontal kemiklerin engel çünkü beyin görüntüleme ve elektrofizyoloji örneğin kullanılan geleneksel stereotaktik sahipleri, kalvaryumun görüntüleme için uygun değildir. Canlı görüntüleme ve elektrofizyoloji çalışmaları 13 sırasında sıkıntı en aza indirmek için kullanılan bir fare tutucu başlayarak, 2 komponent tutucu bir ile tutuş sağlayan büyük bir koluna bağlı bir görüntüleme penceresi oluşturmak için fare kafasına sabitlenen küçük bir parça ile geliştirilmiştir mikroskop sahne sıkıca tutan ağır taban plakası. Hala yerinde kafasını hareketsizleştirerek ve yeterli m ortadan kaldırırken, fare kafatası kafa parçasını emniyete ücretsiz nefes sağlarnefes nedeniyle Hareketleri. Tutucu gövdeye baş parçasını birbirine bağlayan &quot;kilit ve anahtar&quot; mekanizması penceresinin büyüklüğü bu nedenle ameliyat basitleştirilmesi, konumlandırma netliği kadar artan en aza sağlar, ve aşamaya taban plakasının uygun Mikroskop doğru hizalama için izin verir. Doğru hareketli hücreleri izlemek için, çok noktalı bir zaman atlamalı protokol süresi noktaları arasındaki 5 dk aralıklarla zamanla hücrelerin izlenmesini sağlamak için tasarlanmıştır. Burada, etiketli MUYDUNUZ HKH&#39;lerin col2.3GFP osteoblasitc muhabiri fareler 10,14 enjekte ve yaklaşık 20 saat sonra görüntülenmiş. Tasarlanmıştır ve birden fazla saatlik bir süre içinde aynı bölgelerde hızlı çok noktalı zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için gereken görüntüleme ayarları detaylı olarak tarif edilmektedir fare tutucu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine(Narketan 100mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:119px;">407575 0107 C</td>
			<td style="width:167px;">Other anesthetics may be used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Medetomidine(Domitor 1mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Elanco</td>
			<td style="width:119px;">134800-2</td>
			<td style="width:167px;">Other analgesics may b used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Vibrant DiD cell labeling solution</td>
			<td style="width:71px;">Roche Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">V22887</td>
			<td style="width:167px;">Other colors are available and may be used if required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lacrilube ophtalmic ointment</td>
			<td style="width:71px;">Allergan</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">avaliable by prescription by the local vet</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Kemdent &#34;Diamond Carve&#34; glass ionomer cement</td>
			<td style="width:71px;">Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td>
			<td>SUN527</td>
			<td style="width:167px;">We use shade A3, but any shade of cement can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sterile water</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;">Terumo Medical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">SS10M3109</td>
			<td style="width:167px;">1mL, 31G</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">340031</td>
			<td style="width:167px;">Cone type (small)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Autoclaved forceps and scissors</td>
			<td style="width:71px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGT577 
			AGT5034</td>
			<td style="width:167px;">Iris scissors - 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Weigh boat and cement stirrer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>611-1996/231-0370</td>
			<td style="width:167px;">5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Not available</td>
			<td style="width:167px;">Call for quote</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506323</td>
			<td style="width:167px;">HCX IRAPO L lens</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Custom designed mouse holder</td>
			<td style="width:71px;">Imperial College Engineering Workshop</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">See Figure 1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Heating pad with rectal thermometer probe</td>
			<td style="width:71px;">BASi Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td>
			<td style="width:167px;">Heat mat/ Control box/ Thermometer probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow

Sakinleştikten ve çoğalması, kendini yenileme ve farklılaşmış döl üretimi arasında hassas bir denge sayesinde, hematopoetik kök hücreler (HKH&#39;lerin) tüm olgun kan hücresi soylarının ciro korumak. Belirli HSC kaderi açan karmaşık sinyallerin koordinasyon HKH&#39;lerin ve hala anlaşılamamıştır karmaşık kemik iliği mikro, [1-2] arasındaki etkileşim dayanır. Biz çok adım confocal ve in vivo görüntüleme teknikleri iki-foton ile istikrarlı hayvan konumlandırma için yeni geliştirilen bir örnek tutucu birleştirerek, yüksek çözünürlüklü 3D HSPCs içeren yığınları ve onların çevresindeki nişler elde etmek ve zamanla onları izlemek nasıl mümkün olduğunu açıklamak Çok noktalı time-lapse görüntüleme yoluyla. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme tespit ex vivo olarak etiketlenmiş hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPCs) kemik iliği içinde ikamet verir. Dahası, multi-noktalı time-lapse 3D görüntüleme, odaha hızlı alma ayarları ile btained, HSPC hareket ve HSPCs ve stroma hücreleri arasındaki karşılıklı etkileşimleri hakkında doğru bilgi sağlar. GFP pozitif osteoblastik hücrelerde ilgili olarak HSPCs takibi bu yöntemin örnek teşkil eden bir uygulama olarak gösterilmiştir. Bu teknik, fare kemik iliği calvarium mekan içinde herhangi bir ilgi, uygun şekilde etiketlenmiş, hematopoietik ve stromal hücre izlemek için kullanılabilir.

Yapılan özel bir kalvaryumun görüntüleme penceresi dahil yüksek hassasiyetli fare tutucu ölümcül ışınlanmış alıcı farelerde (Şekil 1A) enjekte FACS arıtılmış, etiketli HSPCs uzun süreli görüntüleme sağlar. Tipik olarak, 15 ile enjekte edilmesinden sonra - 20 bin işaretli hücrelerin, 8-15 hücreler kafatası ertesi gün kemik iliği görüntüleme alanı içinde genellikle tanınabilir. Tespit HSPCs (Şekil 1C ve film) 4D zaman atlamalı filmleri izledi 120 mikron kalınlığında, (Şekil 1B), - İşte yaklaşık 90 kemik iliği alanları HSPC içeren tek hücreli çözünürlüklü 3D yığınları kazanmak için nasıl gösterilir. Diş çimento optimal hazır değilse, optimumun altında sonuçlar, örneğin, su ve tutucunun üst tepesinde edilebilir olsa da, sigara kapalı alanlardan akabilir, elde edilir, herhangi bir zaman süresi olan daldırma objektif değildir su içine siyah f yol açar<html> Rames. Görüntülerin bazı sürüklenme ani atlar yol ancak fare ilerleyici ayrılması yol açan, uygun olmayan çimento yapışma ile vurgulanmış ve kurmak görüntüleme düzensizlikler tarafından edilebilir nedeni fare tutucunun malzemelerin termal genleşme kaçınılmazdır time-lapse görüntüleme sırasında odak. Daha önce görüntülenmiş pozisyonları Revisiting zaman çok noktalı time-lapse görüntüleme sırasında Drift de sahne hareketleri yanlışlıklar neden olabilir. Zaman atlamalı filmleri Drift ve kekeme eserler görüntü kaydı algoritmaları kullanarak düzeltilebilir. Tablo 1. Uyarma ve emisyon ayarları. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> Renk Kanal </td><td style="width:213px;"> Uyarma </td><td style="width:208px;"> Emisyon </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488 nm </td><td style="width:208px;"> 500-530 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> Otofloresans </td><td style="width:213px;"> 543 nm </td><td style="width:208px;"> 560-610 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> DiD </td><td style="width:213px;"> 633 nm </td><td style="width:208px;"> 640-700 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840 nm (MP) </td><td style="width:208px;"> 400-450 nm </td></tr></tbody></table><img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> Fare kalvaryumun içinde HSPCs in vivo 4D görüntülemede Şekil 1.. Deney (A) Taslağı (B - C).. Elde edilmiş sonuçlara örnekler (B), 3 boyutlu bir yığından 2B dilim (toplam derinliği 114 um), kollajen kemik (beyaz) bir sinyal ihtiva eden etiketli MUYDUNUZ hücreler (kırmızı) , autofluorescent cells (sarı) ve osteoblastik hücreleri (yeşil). Ölçek çubukları:. Osteoblastik hücreleri (yeşil) yakınına göç bir etiketli MUYDUNUZ HSC (kırmızı) gösteren bir 4D time-lapse film 100 mikron (C) 2D dilimleri. Noktalı çizgi, hücre yer değiştirmesini ortaya koymaktadır. Ölçek çubukları: 50 um (B) ve 100 um (° C). NOT:. Video makalede sırasında gösterilmiştir (C) time-lapse edinimi elde film <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow at JoVE.com

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

in-vivo-4-dimensional-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

13.7K Görüntüleme.  Imperial College London.  Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir. 

Video: In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biyoloji

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Kemik İliği Hematopoetik Hücreler, Homing

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...