JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund&#8212;Memorial Hermann Foundation.

1. EML Hücre Kültürü ve Sistem ve sıralama Manyetik Hücre kullanma Lin-CD34 + ve Lin-CD34 Hücrelerinin Ayırma Floresan aktive Hücre Ayırma Yöntemi <ol><li> Kök hücre faktörü toplanması için bebek hamster böbrek (BHK) hücre kültür ortamının hazırlanması: <ol><li> 37 ° C&#39;de bir hücre kültürü inkübatöründe,% 5 CO2 seviyesinde 25 cm2 bir şişede (Tablo 1)% 10 FBS içeren DMEM aracı madde içinde kültür BHK hücreleri. </li><li> Hücreler 80 genişlediğinde, -% 90 birleştiği, 10 ml PBS ile bir kez hücreleri yıkayın. Tek tabaka için% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 5 ml ilave edilir ve hücreler, müstakil kadar oda sıcaklığında (RT) 1-5 dakika boyunca kuluçkalayın. </li><li> Pipet hafifçe aşağı çözüm yukarı ve hücrelerin öbekler kırmak için. Tripsin aktivitesi durdurmak için şişeye bitmiş DMEM 5 ml. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplanır. </li><li> Ortamı çıkarın ve taze BHK hücre kültür ortamı, 10 ml hücre pelletini. </li&gt; <li> Transferi 2 yeni bir 75 cm&#39;lik 2 şişeye aşama 1.1.4 gelen hücre süspansiyonu ilave edildi ve şişeye taze BHK hücre kültür aracı maddesi 48 ml ilave ediniz. </li><li> Kültür BHK iki gün hücreler ve kültür ortamının toplanması. Geçişi, bir 0.45 um filtre içinden ortamı. Bir sonraki kullanıma kadar -20 ° C &#39;de orta saklayın. </li></ol></li><li> EML hücre kültürü: <ol><li> Bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde BHK hücre kültür ortamı (Tablo 1) ihtiva eden EML bazik bir ortamda kültür EML hücreleri (süspansiyon). </li><li> Tepe yoğunluğu en az 6 x 10 5 hücre / ml düşük hücre yoğunluğunda (0.5-5 x 10 5 hücre / ml) EML hücreleri koruyun. 1 oranında her 2-3 günde bir hücreleri bölün: 5&#39;tir. Passage EML hücreleri nazikçe ve 10 nesiller için pasaj sonra kültürünü atın. </li></ol></li><li> Soyu pozitif hücrelerin tükenmesi: <ol><li> 200 xg FO santrifüj ile EML hücreler hasatR, 5 dakika, bir kez PBS ile hücreleri yıkayın. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplanır. </li><li> Hücrelerin PBS ile yeniden süspanse edin ve bir hemositometre ile hücreleri sayın. (Hücre izolasyon sisteminin sağlayıcı tarafından sunulan talimatlara bakınız) hücre sayısına bağlı olarak takip eden hücre ayrıştırma aşamasında antikor konsantrasyonunu belirler. </li><li> Soy negatif (Lin-) izole nesilli antikor kokteyli (biyotin-konjuge monoklonal antikor kokteyli hücreleri, CD5, CD45R (B220), CD11b, anti-Gr-1 (Ly-6G / C) 7-4 ve Der-119 ) ve üreticinin talimatlarına göre, bir manyetik etkinleştirilmiş hücre tasnif sistemi. </li></ol></li><li> Lin-CD34 + ve Lin-CD34 hücre ayrımı: <ol><li> 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de adım 1.3.3 gelen Lin hücreleri aşağı doğru döndürün. PBS ile hücre pelletini ve bir hemositometre ile hücreleri sayın. </li><li> FACS tamponu ile iki kez hücreler yıkanır ve 200 x g&#39;de, hücreleri topaklamak5 dakika karıştırıldı. </li><li> Sırasıyla sayı 1, 2, 3, 4, 5, beş, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin. 10 6 hücre (tüp başına 10 6 hücre) başına 100 ul FACS tamponu ile tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Tüp 1 ve tüp 2 Anti-Mouse CD34 FITC antikor 1 ug ekleyin ve hafifçe tüpleri karıştırın. </li><li> Karanlıkta 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de tüm tüpler inkübe edin. </li><li> Borunun 1, APC-konjuge Köken Kokteyl antikor 0.25 boruyu 3 PE-konjuge anti-Sca1 antikorun ug ve 20 ul ila Köken Kokteyl antikorlar, APC-konjuge PE-konjuge anti-Sca1 antikorun 0.25 ug ve 20 ul ekle tüp 4. </li><li> Nazikçe tüpleri karıştırın ve karanlıkta bir 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de kuluçkalayın. </li><li> Hücrelere FACS tampon 300 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> Üç kez FACS tampon 500 ul hücreleri yıkayın. </li><li> FACS met 500 ul hücre pelletiniffer. </li><li> Tazminat kurma borular 2, 3, 4, ve 5 &#39;de hücreleri kullanır. FACS Aria kullanarak tüp 1 Lin-SCA + CD34 + ve Lin-SCA-CD34 hücreleri izole. </li></ol></li></ol> 2. Yüksek verim dizinleri için RNA Hazırlama ve Kütüphanesi İnşaatı <ol><li> İzolasyon, kalite analizi ve RNA ölçümü: <ol><li> Üretmektedir &#39;protokol takip edilen Lin-CD34 + ve sırasıyla TRIzol kullanılarak Lin-CD34 hücrelerden toplam RNA ekstrakte edin. </li><li> Üreticinin protokolü takip edilerek, kirlenmiş DNA&#39;sı kullanılarak deoksiribonükleaz I (DNase I) çıkarın. İsteğe bağlı olarak, daha fazla kullanım için bu aşamada -80 ° C&#39;de RNA saklayın. </li><li> Tedarikçi tarafından sunulan talimatlara göre Bioanalyzer kullanan toplam RNA kalitesini değerlendirmek. RNA Bütünlük sayısı (RIN) 9 daha lager RNA örneği kullanın. </li></ol></li><li> Kütüphane İnşaat ve yüksek verim sıralama: NOT: Bu protokol Illumina platformu kullanılarak RNA-seg açıklar. IçinDiğer sıralama platformlar, farklı kütüphane hazırlama yöntemleri gereklidir. <ol><li> Kütüphane hazırlanması için numune başına yüksek kaliteli toplam RNA 0,1-4 mikrogram kullanın. Normal olarak, toplam RNA, 2 ug 10 5 EML hücrelerinden elde edilebilir. </li><li> RNA, saflaştırma ve parçalanma, birinci ve ikinci dizi cDNA sentezi, son tamir, 3, RNA&#39;ya dizileme örnek hazırlama sisteminin kullanımı, &#39;sağlayıcının talimatlarından ayrıntılı standart prosedürler takip edilerek, PCP, adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonu sona erer. <ol><li> Olumlu oligo-dT manyetik boncuklar kullanılarak PolyA mRNA seçin ve mRNA fragmanı. </li><li> CDNA&#39;nın elde edilmesi ve daha sonra çift şeritli cDNA oluşturmak için cDNA, ikinci dalı sentez etmek için, rastgele primerler kullanılarak ters transkripsiyon gerçekleştirin. </li><li> 3 &#39;çıkıntılar ve 5 doldurun&#39; Kaldır DNA polimeraz tarafından çıkıntılar. Adenilat 3 &#39;birbirlerine bağlanması ile ilgili cDNA fragmanlarının önlemek için sona erer.</li><li> DscDNA her iki ucuna multipleks indeksleme adaptörleri ekleyin. DNA fragmanlarının zenginleştirilmesi için PCR gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak kütüphanenin konsantrasyonu hakkında bilgi edinmek için A260 / A280 ölçün. </li><li> Kütüphane kalitesi değerlendirildi ve Bioanalyzer kullanılarak DNA parçalarının boyut aralığı ölçer. </li></ol></li></ol> 3. Veri Analizi Bu bölümde kullanılan yazılım referans için (Tablo 2) bakınız. <ol><li> Alt analizi için veri dosya işleme: <ol><li> .bcl (Baz çağrı dosyası) dönüştürmek casava yazılımı (Illumina, sürüm 1.8.2) kullanarak dosya .fastq dosya. <ol><li> Linux sistemi &#39;Terminal&#39; ateş. Bir Illumina HiSeq2000 dizileme makineden veri dosyasını içeren veri klasörüne gidin. Sonuç klasör &#39;NASboy1 / JiaqianLabData / HiSeq_RUN / 2013_07_11 / 130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX /&#39; türü olduğunu varsayalımŞekil S1a içinde komuta ve veri klasörünü girin. </li><li> Linux sistemi casava 1.8.2 yükleyin. , Outputfolder &#39;Hizalanmamış&#39; olduğunu varsayalım dönüştürmek için yapılandırma dosyası hazırlamak için Şekil S1B yılında komutunu kullanın. Sadece bir .fastq dosya her bir numune için oluşturulan sağlamak için --fastq-küme sayımı 0 seçeneğini kullanın. Oluşturulan .fastq dosyası Gz biçimindedir. Alt analizi (Şekil S1B) için açın. </li><li> &#39;Hizalanmamış&#39; klasörü oluşturulduktan sonra, &#39;Hizalanmamış&#39; klasöründe (Şekil S1C) gidin. </li><li> Dönüştürme işlemini başlatmak için Şekil S1D yılında komutunu kullanın. &#39;-j&#39; Parametresi kullanılacak cpu sayısını sağlayan. </li><li> Sistem dönüştürme işlemini bitirdikten sonra, &#39;Hizalanmamış&#39; klasörü (Şekil S1E) kapsamında sonuç klasörüne gidin. </li><li> &lt;Şekil S1F içinde komutunu kullanın/ Strong&gt; Her numune klasörü altında .fastq dosyasının içine .fastq.gz dosyayı açmak için. </li></ol></li></ol></li><li> Roman transkript algılamak ve smokin Suite 26 ile ifade düzeyini değerlendirmek: <ol><li> RNA-Seq (elde ucsc sürümü MM9, fare referans genomuna okur eşleştirilmiş sonu haritada <a href="http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html" target="_blank">http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html</a> kullanır) Tophat yazılımını kullanarak (versiyon 1.3.3) 27 Papyon mapper (sürüm 0.12.7) 28 okuyun. Tophat ifade seviyesi tahmin doğruluğunu geliştirmek için &quot;-hayır-roman-juncs&quot; seçeneği ile verilir. <ol><li> Haritalama işlemi uygulanacak bir klasörde .fastq dosyaları koydum. Bir paired-end dizileme numune için 2 .fastq dosyaları (Example1.read1, Example1.read2 yeniden adlandırmak) olduğunu varsayalım eşleme (sistem ayarına göre parametrelerini ayarlamak) yapmak için Şekil S2 komutunu kullanın.&quot;-p&quot; Parametresi kullanılacak cpu sayısını sağlayan. &quot;R&quot; ve &quot;-mate-std-dev&quot; parametreleri kütüphane QC elde edilen veya (Şekil S2) hizalanmış bir alt kümesi okur varılabilir. </li></ol></li><li> Kol Düğmesi yazılımını kullanarak RNA transkriptleri okur eşlenen (versiyon 1.3.0) 29 birleştirin. Açıklama bilinen genlerin dosya (tophat tarafından kullanılan aynı .gtf dosyası) ve tophat tarafından üretilen .bam dosyasını kullanarak çalıştırın Kol Düğmeleri. <ol><li> Tophat çalışmasını tamamladıktan sonra, aynı klasörde, transcriptome ve tahmin transkript ifade seviyesini oluşturmak için kol düğmeleri çalıştırmak için Şekil S3A yılında komutunu kullanın. &#39;GenomeSeqMM9&#39; klasöründe &#39;mm9_repeatMasker.gtf&#39; ve genom dizisi dosyaları UCSC Genom Browser elde edilebilir. </li><li> Elde edilen genes.expr ve transcripts.expr dosyaları genler ve transkript (izoformları) olarak ifade değerini içerir. Kopyalama ve yapıştırmabir Excel dosyası içeriğini dosya ve hesap tablosu uygulaması (Şekil S3 B) ile işleyebilirsiniz. </li><li> Yeni transkript belirlemek için referans &#39;mm9_genes.gtf&#39; dosyasına çıkan &#39;transcripts.gtf&#39; dosyası karşılaştırmak için Şekil S3C yılında komutunu kullanın. </li><li> Elde edilen .tmap dosyası karşılaştırma sonucunu içerir. Kopyalayın ve bir Excel dosyası için dosya içeriğini yapıştırın ve elektronik tablo uygulaması ile manipüle. Sınıf kodu ile deşifreleri &#39;u&#39; (Şekil S3D) sağlanan dosyası .gtf referans ile karşılaştırıldığında &#39;roman&#39; olarak kabul edilebilir. NOT: değerleri 0.1 altında ise aşağı analiz kolaylık sağlamak için, 0.1 FPKM değerlerini ayarlayın. NOT: Adım 3.2.3 - 3.2.6 roman transkriptlerinin &#39;ifadesi tahminin doğruluğunu geliştirmek isteyenler için isteğe bağlıdır. Haritalama ve transcriptome inşaat r olması gerekir, çünkü bu, çok daha uzun bir zaman alacakun birden çok kez. </li></ol></li><li> Varsayılan parametrelerini kullanarak Tophat çalıştırın ve daha sonra Şekil S3E içinde komutunu kullanarak oluşturulan .gtf dosyaya kol düğmeleri çalıştırın. </li><li> Şekil S3F yılında komutunu kullanarak referans genom .gtf dosyaya çıkan .gtf dosyasını karşılaştırın. </li><li> Aşama 3.2.2.4 tarif edildiği gibi nihai .tmap dosyasını çözümler. Kopyalayın ve bir Excel dosyası için dosya içeriğini yapıştırın ve elektronik tablo uygulaması ile manipüle. Sınıf kodu ile deşifreleri &#39;u&#39; olarak kabul edilebilir &#39;roman&#39; sağlanan dosyası .gtf referans ile karşılaştırıldığında. </li><li> Aşama 3.2.5 sonra, referans .gtf dosyası olarak kullanılabilir klasördeki bir .combined.gtf bir dosya vardır. Yeni transkriptler, daha doğru bir şekilde tahmin FPKM elde etmek için aşama 3.2.1 ve 3.2.2&#39;de tarif edildiği gibi TopHat ve kol düğmeleri ikinci bir çalışma yapılabilir. </li></ol></li><li> Differentiall Algılamay DESeq paketi 30 kullanılarak genleri dile getirdi. <ol><li> DESeq giriş bir ham okuma sayar tablodur. Böyle bir tablo elde etmek için, HTSeq web sitesinden indirilebilir HTSeq Python paketi ile dağıtılan htseq-sayısı komut dosyasını kullanabilirsiniz ( <a href="http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html" target="_blank">http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html</a> ) . <ol><li> Samtools, piton ve htseq-sayımı programsare sistemde yüklü olduğundan emin olun. Şekil S4a yılında komutunu kullanarak tophat çıkışından ham okuma sayısı numaralarını edinin. </li><li> &#39;Raw_Count_Table.txt&#39; Excel kullanarak, &#39;ExperimentDesign.txt&#39; dosyalarını hazırlayın. Kopyala ve DESeq R paketi (Şekil S4B) için .txt formatında içeriği kaydedebilirsiniz. </li><li> Sistemde R programı yükleyin. Terminalde, yazın &#39;R&#39; basın ENTER.A ekran mesajı olacak appearas Şekil S4C gösterdi. </li><li> &#39;Raw_C OkuŞekil S4D yılında komutunu kullanarak R içine ount_Table.txt &#39;,&#39; ExperimentDesign.txt &#39;. </li><li> Şekil S4E yılında komutunu kullanarak DESeq paketi yükleyin. </li><li> R (Şekil S4F) olarak çarpanlara koşulları. </li><li> Normalize sayım masaya olumsuz bimominal testi çalıştırmak için Şekil S4G yılında komutunu kullanın. </li><li> Bir .csv dosyasında çıkış önemli diferansiyel ifade edilen genlerin Şekil S4H yılında komutunu kullanın. </li></ol></li></ol></li><li> Excel kullanarak numunelerin genelinde Arama transkripsiyon faktörleri &#39;(TF) FPKM değerleri. Kesişim DE gen masa ve TF&#39;ler tablo. Genler farklı şekilde transkripsiyon faktörlerini ifade hem tabloya ait. <ol><li> Web sitesine gitmek <a href="http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php" target="_blank">http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php</a> ve transkripsiyon faktörleri indirin. Ardından &lt;(Excel&#39;de DE transkripsiyon faktörlerini arama<html> strong&gt; Şekil S5). </li></ol></li><li> UCSC genom tarayıcı görselleştirme için .bigwig dosyası oluşturuluyor. <ol><li> Web sitesinden &#39;bedtools&#39; yazılım paketi indirin <a href="https://github.com/arq5x/bedtools2" target="_blank">https://github.com/arq5x/bedtools2</a> ve sistemde 31 yazılımı yükleyin. Web sitesinden ucsc aletler &#39;bedGraphToBigWig&#39; indirin <a href="http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/" target="_blank">http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</a> ve sistemdeki yazılımı yükleyin. </li><li> .bam Dosyasını içeren klasörü, .bed dosyasına tophat tarafından oluşturulan .bam dosyayı dönüştürmek için Şekil S6A yılında komutunu kullanın. </li><li> .Yatakta Dosya üretildikten sonra, .bigwig dosyası oluşturmak için Şekil S6B yılında komutunu kullanın. Dosya &#39;ChromInfo.txt&#39; Aşağıdaki url elde edilebilir:arget = &quot;_blank&quot;&gt; http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz. </li><li> UCSC Genom Browser bir özel parça gözlemlemek. Web sitesine bakın <a href="http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html</a> UCSC genom tarayıcısı kullanarak özel bir iz görüntülemek için nasıl. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil S1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig1.jpg" /> Şekil S1: .bcl dosya dönüştürme casava yazılımı kullanarak dosyayı .fastq için. <img alt="Şekil S2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig2.jpg" /> Şekil S2: Haritalama Tophat kullanarak genom referans okur. <img alt="Şekil S3" fo:conçadır-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.104 / 52104supplementalfig3.jpg&quot; /&gt; Şekil S3: roman transkript ve ifade seviyesi tahmini Algılama. <img alt="Şekil S4" fo:content-width="3.4in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig4.jpg" /> Şekil S4: package DESeq kullanarak diferansiyel ifade geni çağrılıyor. <img alt="Şekil S5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig5.jpg" /> Şekil S5: farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörlerinin belirlenmesi. <img alt="Şekil S6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig6.jpg" /> Şekil S6: veri görselleştirme için haritalama sonucu dönüştürme.

<ol>
	<li>Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+aging:+wrinkles+in+stem+cell+potential.">Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential.</a> Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf7+is+an+important+regulator+of+the+switch+of+self-renewal+and+differentiation+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line.">Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line.</a> PLoS genetics. 8, (2012).</li><li>Ye, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+in+EML+cell+stimulation+by+stem+cell+factor+and+IL-3.">Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).</li><li>Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphohematopoietic+progenitors+immortalized+by+a+retroviral+vector+harboring+a+dominant-negative+retinoic+acid+receptor+can+recapitulate+lymphoid,+myeloid,+and+erythroid+development.">Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development.</a> Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).</li><li>Weiler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D3:+a+gene+induced+during+myeloid+cell+differentiation+of+Linlo+c-Kit++Sca-1(+)+progenitor+cells.">D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells.</a> Blood. 93, 527-536 (1999).</li><li>Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+precursor+cells+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line.">Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).</li><li>Chu, Y., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing:+platform+selection,+experimental+design,+and+data+interpretation.">RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation.</a> Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).</li><li>Hornett, E. A., Wheat, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RNA-Seq+analysis+in+non-model+species:+assessing+transcriptome+assemblies+as+a+scaffold+and+the+utility+of+evolutionary+divergent+genomic+reference+species.">Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species.</a> BMC genomics. 13, 361 (2012).</li><li>Eswaran, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+cancer+reveals+novel+splicing+alterations.">RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations.</a> Scientific reports. 3, 1689 (2013).</li><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptomes+during+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+revealed+by+short,+long,+and+paired-end+sequencing.">Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).</li><li>Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+of+Arabidopsis+pollen+uncovers+novel+transcription+and+alternative+splicing.">RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing.</a> Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).</li><li>Edgren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fusion+genes+in+breast+cancer+by+paired-end+RNA-sequencing.">Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing.</a> Genome biology. 12, 6 (2011).</li><li>Ilott, N. E., Ponting, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+long+non-coding+RNAs+using+RNA+sequencing.">Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing.</a> Methods. 63, 50-59 (2013).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+novel+long+non-coding+RNAs+based+on+RNA-Seq+data+of+mouse+Klf1+knockout+study.">Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study.</a> BMC bioinformatics. 13, 331 (2012).</li><li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform.">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).</li><li>Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+sequencing+of+the+siRNAs+associated+with+peach+latent+mosaic+viroid+infection.">In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection.</a> BMC molecular biology. 11, 16 (2010).</li><li>Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+nucleotide+variations+in+expressed+exons+of+the+human+genome+using+RNA-Seq.">Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq.</a> Nucleic acids research. 37, 106 (2009).</li><li>Djari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-based+single+nucleotide+polymorphism+discovery+in+bovine+muscle+using+next-generation+transcriptomic+sequencing.">Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing.</a> BMC genomics. 14, 307 (2013).</li><li>Murphy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+studies+using+microarrays:+principles,+problems,+and+prospects.">Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects.</a> Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+characterization+of+spinal+cord+injury+transcriptome+in+acute/subacute+phases:+a+resource+for+understanding+the+pathology+at+the+systems+level.">RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level.</a> PLoS one. 8, 72567 (2013).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome research. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+analyze+gene+expression+using+RNA-sequencing+data.">How to analyze gene expression using RNA-sequencing data.</a> Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).</li><li>Glenn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+guide+to+next-generation+DNA+sequencers.">Field guide to next-generation DNA sequencers.</a> Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nature protocols. 7, 562-578 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome biology. 10, 25 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature. 28, 511-515 (2010).</li><li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data.">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome biology. 11, 106 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Cheranova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+transcriptomes+in+thrombin-treated+and+control+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells.">RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnimalTFDB:+a+comprehensive+animal+transcription+factor+database.">AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database.</a> Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+transcribed+loci+in+ENCODE+regions+using+RACE+sequencing+reveals+extensive+transcription+in+the+human+genome.">Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome.</a> Genome Biol. 9, 3 (2008).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+RT-PCR+recovery+of+full-length+cDNA+clones.">Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones.</a> Biotechniques. 36, 690-696 (2004).</li><li>Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rat+genes+by+TWINSCAN+gene+prediction,+RT-PCR,+and+direct+sequencing.">Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing.</a> Genome Res. 14, 665-671 (2004).</li><li>Dewey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+novel+human+genes+through+simultaneous+gene+prediction+in+human,+mouse,+and+rat.">Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat.</a> Genome Res. 14, 661-664 (2004).</li><li>Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Memeli transcriptome 34-38 çok karmaşık. RNA-Seq teknoloji It gen ifadesi analizi için diğer yöntemlere göre birçok avantajı vardır transcriptome analizi, roman transkript tespiti ve tek nükleotid varyasyon keşif vb çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Girişte de belirtildiği gibi, mikrodizi hibridizasyon eserler üstesinden gelir ve yeni bir transkript de novo tanımlamak için kullanılabilir. RNA-sıralamasının bir sınırlama Sanger dizileme karşıla?...

Hematopoetik kök hücreler erişkin kemik iliği niş ağırlıklı olarak ikamet nadir kan hücreleridir. Bunlar, kan yeniden doldurmak için gereken hücreleri ve immün sistem 1 üretimi için sorumludur. Kök hücrelerin bir tür olarak, HSC kendini yenileme ve farklılaşma kabiliyetine sahip bulunmaktadır. HKH&#39;lerin kaderi kararını kontrol mekanizmaların tanıtılması, kendini yenileme veya farklılaşma ya doğru, kan hastalığı araştırmalar ve klinik kullanım için 2 HKH&#39;lerin manipülasyon değerli rehberlik sunacak. Araştırmacılar tarafından karşılaşılan bir sorun, HSC muhafaza ve çok sınırlı bir ölçüde, in vitro olarak genişletilebilir olabilir; soylarına büyük çoğunluğu kısmen kültür 2 ayrıştırılmıştır. Genom ölçeğinde kendini yenileme ve farklılaşma süreçlerini kontrol tuşuna regülatörleri tanımlamak için, biz bir model sistem olarak bir fare ilkel hematopoetik öncül hücre hattını EML kullanılır. Thhücre hattı fare kemik iliği 3,4 türetilmiştir edilir. Farklı büyüme faktörleri ile verildiğinde, EML hücrelerin in vitro 5 eritrosit, miyeloid ve lenfoid hücrelerine dönüştürmek olabilir. Önemli olarak, bu hücre hattı kültürü ortamı bunların multipotentiality tutma hala kök hücre faktörü (SCF) ihtiva eden ve büyük miktarda çoğaltılabilir. EML hücreler kendini sürekli yenileyen Lin-SCA + CD34 + alt popülasyonlar ayrılır ve kısmen yüzey belirteçleri CD34 ve SCA 6 dayalı Lin-SCA-CD34 hücreleri ayırt edilebilir. Kısa vadeli HKH&#39;lerin, SCA + CD34 + hücrelerde de benzer kendini yenileme edebiliyoruz. Hızla Lin-SCA + CD34 + ve Lin-SCA-CD34 hücre karışık bir nüfus yeniden ve 6 çoğalmaya devam edebilirsiniz SCF, Lin-SCA + CD34 + hücre ile tedavi edildiğinde. Popülasyonlar morfolojik olarak benzer ve c-kit mRNA ve protein 6 benzer seviyelerine sahiptir. Lin-SCA-CD34 hücreleri, IL-3 yerine SCF3 ihtiva eden ortam içinde yayılan yeteneğine sahiptirler. Unveiling hematopoiez sırasında erken gelişimsel geçiş hücresel ve moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sunacak EML hücre kaderinin kararda kilit düzenleyiciler. Kendini sürekli yenileyen Lin-SCA + CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-SCA-CD34 hücreleri arasındaki yatan moleküler farklılıkları araştırmak amacıyla, farklı şekilde ifade genleri tanımlamak için RNA-seg kullanılır. Transkripsiyon faktörleri hücre kaderini belirlemede önemli olduğu gibi, özellikle biz, transkripsiyon faktörleri odaklanmak. RNA-Seq profil ve genom 7,8 transkripsiyonu RNA&#39;lar ölçmek için (NGS) teknolojileri yeni nesil dizileme yeteneklerini kullanan yeni geliştirilmiş bir yaklaşımdır. Kısaca, total RNA, poli-A, ilk template.The RNA şablonu ile sonra ters transkriptazı kullanılarak cDNA&#39;ya dönüştürülür olarak seçilir ve parçalanmış. CDNA kütüphanesinin oluşturulması için sağlam olmayan bozulmuş RNA kullanılarak, tam uzunlukta RNA transkriptlerinin haritasını yapmak için önemlidir. Amaçlarlasekanslama poz, belirli bir adaptör dizileri cDNA&#39;nm her iki ucuna eklenir. Daha sonra, bir çok durumda, cDNA molekülleri, PCR ile amplifiye edilmiş ve yüksek verimli bir şekilde dizildi. Sekanslama sonra, elde edilen bir bir referans genom ve transkriptom veritabanına hizalanabilir okunur. Sayısı referans gen haritası sayılır ve bu bilgi gen salgılama seviyesini tahmin için kullanılabileceğini okur. Ayrıca sigara model organizmaların 9 transcriptomes incelenmesini sağlayan bir referans genom olmadan de novo monte edilebilir okur. RNA-DİZ teknolojisi aynı zamanda ek yeri izoformları 10-12, yeni transkriptler, 13 ve gen füzyonlarının 14 tespit etmek için kullanılmıştır. Protein kodlayan genlerin saptanması ek olarak, RNA Dizi aynı zamanda gibi kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar, transkripsiyonu seviyesini roman tespit ve analiz etmek için kullanılabilir uzun siRNA&#39;nın vb 18 RNA 15,16, mikroRNA 17, kodlayıcı olmayan. Çünkü tBu yöntemin de hassasiyeti, tekli nükleotit varyasyonları 19,20 tespiti için kullanılmıştır. RNA-Seq teknolojisinin gelişiyle önce, mikrodizin gen ifadesi profili analiz etmek için kullanılan ana yöntem oldu. Önceden tasarlanmış probları sentezlenebilir ve daha sonra, mikro-dizi slayt 21 oluşturmak üzere bir katı yüzeye bağlanır. mRNA, ekstre edilmiş ve cDNA&#39;ya dönüştürülür. Ters transkripsiyon işlemi sırasında, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin cDNA dahil edilir ve cDNA mikrodizi slaytlar üzerine hibridize edilebilir. Belirli bir noktaya toplanan sinyalin yoğunluğu, bu noktada 21 spesifik prob bağlanma cDNA&#39;nın miktarına bağlıdır. RNA-Seq teknolojisi ile karşılaştırıldığında, mikrodizin çeşitli sınırlamalar vardır. RNA-Seq teknoloji kullanımını zaman sınırlar görece yüksek arka plan düzeyinde roman transkript tespit edebiliyor iken Birincisi, mikrodizin, gen şerhin önceden varolan bilgiye dayanır gene ifade seviyesi düşüktür. Bağlı arka plan ve sinyallerin doymaya mikrodizisinin hassasiyeti de, yüksek ve aşağı ifade edilen genlerin 7,22 ile sınırlıdır, oysa Bunun yanı sıra, RNA-Dizi teknoloji, algılama (8.000 kat) 7 çok daha yüksek bir dinamik aralığı vardır. Son olarak, mikrodizi probları bir örnek 23 içindeki farklı transkriptlerinin nispi temsil seviyelerini karşılaştırırken sonuçları daha az güvenilir hale hibritleştirme verimlilikleri, farklıdır. RNA-Seq mikrodizisinden üzerinden pek çok avantajı olmasına rağmen, veri analizi karmaşık. Bu, birçok araştırmacılar hala RNA-Sek yerine mikrodizisini kullanmak nedenlerinden biridir. Çeşitli biyoinformatik araçları RNA-Dizi veri işleme ve analiz 24 için gereklidir. Birkaç nesil dizileme (NGS) platformlar arasında, 454, Illumina, KATI ve İyon Torrent en yaygın kullanılan olanlardır. 454 ilk ticari NGS platform oldu. Diğer sıralama platformlar aksineBu tür Illumina ve bir katı halinde, 454 platformu okunmayacak oluşturur uzunluğu 25 (ortalama 700 baz kaydeder). Nedeniyle daha uzun daha yüksek verim 25 monte onların için transcriptiome ilk karakterizasyonu için daha iyi okur. 454 platformunun ana dezavantajı dizisinin megabase başına yüksek maliyet. Oluşturmak Illumina ve KATI platformları sayısının artması ve kısa uzunluklarda okur. Dizisinin megabase başına maliyet 454 platformu çok daha düşüktür. Nedeniyle Illumina ve SOLID platformları için okur kısa, çok sayıda, veri analizi çok fazla hesaplama yoğundur. İyon sel platformu için sıralama için alet ve reaktiflerin fiyatı ucuzdur ve sıralama süresi 25 daha kısadır. Ancak, hata oranı ve dizinin megabase başına maliyeti yüksek Illumina ve SOLID platformlara karşılaştırılır. Farklı platformlar kendi avantajları ve dezavantajları vardır ve veri analizi için farklı yöntemler gerektirir. Platform sıralama amacı ve finansman durumuna göre seçilmelidir. Bu yazıda, bir örnek olarak Illumina RNA-Dizi platform almak. Biz EML hücre kendini yenileme ve farklılaşma anahtar düzenleyicileri araştırmak için bir model sistem olarak EML hücresi kullanılan ve ifade seviyesi hesaplama ve roman transkript tespiti için RNA-Dizi kütüphane yapımı ve veri analizi yöntemleri ayrıntılı sağladı. Biz EML model sisteminde 2 RNA-seq çalışma, zaman fonksiyonel testi (örn ShRNA demonte) hematopoetik farklılaşma erken aşamalarında moleküler mekanizmasının anlaşılması açısından güçlü bir yaklaşım sağlamak ile birleştiğinde bizim önceki yayın göstermiştir, ve bir olarak hizmet verebilir genel olarak hücre kendini yenileme ve farklılaşma analizi için bir model.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD34 FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Lineage Antibody Cocktail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558074</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special offer sysmtem</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 75cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 25cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430639</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068-015</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140071</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30228.02</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage Cell Depletion Kit, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Isolation of lineage negative cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoVue Plus spectrophotometer&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9569-62</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482; Napco&#8482; 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15-497-002&#160;</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#174; Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>RNA exraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq&#8482; RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2002</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2545</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of key factors regulating self-renewal and differentiation in eml hematopoietic precursor cells by rna-sequencing analysis

Hematopoetik kök hücreler (HSC), lösemi ve lenfoma gibi birçok hastalıkta hastanın hematopoetik sistemi yeniden inşa etmek nakli tedavisi için klinik olarak kullanılmaktadır. HSC kendini yenileme ve farklılaşmasını kontrol eden mekanizmaların tanıtılması araştırma ve klinik kullanım için HKH&#39;lerin uygulaması için önemlidir. Bununla birlikte, bunun nedeni, in vitro proliferasyonu edemedikleri için HKH&#39;lerin büyük miktarda elde etmek mümkün değildir. Bu engeli aşmak için, bu çalışma için, bir model sistem olarak, bir fare kemik iliği türevi hücre hattı, EML (eritroid, miyeloid ve lenfositik) hücre hattı kullanılmıştır. RNA sıralaması (RNA-Dizi) giderek artan bir gen ifade çalışmaları için mikrodizisi değiştirmek için kullanılmıştır. Biz burada EML hücre kendini yenileme ve farklılaşma düzenlenmesinde potansiyel anahtar faktörleri araştırmak için RNA-Sıra teknolojisini kullanarak ayrıntılı bir yöntem rapor. Bu yazıda verilen protokol üç bölüme ayrılmıştır. Ilk part nasıl kültür EML hücreleri ve ayrı Lin-CD34 + ve Lin-CD34 hücreleri açıklar. Protokolün ikinci bölümü, toplam RNA hazırlama ve yüksek sekanslama için daha sonra kütüphane yapımı için ayrıntılı prosedürler bulunmaktadır. Son bölüm RNA-Dizi veri analizi için yöntem açıklanır ve Lin-CD34 + ve Lin-CD34 hücreleri arasındaki farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri belirlemek için verilerin nasıl kullanılacağını açıklar. En önemli ölçüde farklı olarak ifade transkripsiyon faktörleri EML hücre kendini yenileme ve farklılaşmasını kontrol eden potansiyel kilit düzenleyiciler olduğu tespit edildi. Bu yazının tartışma bölümünde, bu deney başarılı performans için önemli adımlar vurgulayın. Özetle, bu kağıt EML hücrelerinde kendini yenileme ve farklılaşma potansiyeli regülatörleri belirlemek için RNA-Sıra teknolojisini kullanarak bir yöntem sunar. Belirlenen anahtar faktörler in vitro ve i aşağı fonksiyonel analize tabi tutulurlarin vivo koşullarda.

Lin-CD34 + ve Lin-CD34 EML hücrelerinde farklı olarak ifade genlerin analiz etmek için, biz RNA-Dizi teknolojisi kullanılmaktadır. Şekil 1 prosedürlerin iş akışını gösterir. Manyetik hücre sıralama ile soy negatif hücrelerin izolasyonu sonra, Lin-SCA + CD34 + ve FACS Aria kullanılarak Lin-SCA-CD34 hücreleri ayrıldı. Lin-zenginleştirilmiş EML hücreleri, anti-CD34, anti-SCA1 ve soy kokteyl antikor ile boyandı. Sadece Lin- hücreleri Sca1 CD34 ifade analizi için geçitlendi. İki p...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis at JoVE.com

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

identification-key-factors-regulating-self-renewal-differentiation

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Görüntüleme.  The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston.  RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine. 

Video: Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biyoloji

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Hızlı büyüyen Tümör üreten hücreleri tarafından salgılanan faktörler tarafından işe alınmış İzleme İşlevsellik ve vaskülatürüne morfolojisi

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...