Uzun süreli ve kısa süreli hematopoetik kök hücre veya HSC izolasyon yöntemi, araştırmacıların HSC bölmesindeki heterojenitenin hücre yenileme mekanizmalarını ve biyolojik temelini daha iyi anlamalarına yardımcı olacaktır. Uzun süreli HSC'lerin özel bir belirteci olabilecek bir transkripsiyon faktörü olan Hoxb5 tanımlandı. Buna dayanarak, bir Hoxb5 muhabirli fare hattı kuruldu ve uzun vadeli ve kısa vadeli HSC'ler başarıyla izole edildi.
Donör kemik iliği hücrelerinin toplanmasına başlamak için,% 70 etanol ile bir harç ve havaneyi sterilize edin ve tamamen kurumasını bekleyin. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS içeren takviyelerden oluşan hücre boyama tamponu olanları dengeleyin. Donör erkek Hoxb5-tri-mCherry fareden izole edilen kemikleri harç içine koyun ve hücre boyama tamponundan üç mililitre ekleyin.
Kemikleri havaneyle fırçalayın, ardından hücre kümelerini nazik pipetleme ile parçalayın ve hücre süspansiyonunu 100 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Çözelti berraklaşana kadar işlemi taze hücre boyama tamponu ile tekrarlayın. Genellikle, üç kez tekrarlamak net bir çözüm elde etmek için yeterlidir.
Femurları ve tibiaları CD45.1.2 konjenik fareden izole ettikten sonra, kemiklerin her iki ucunu keskin steril makasla kesin. Buz gibi soğuk hücre süspansiyon tamponu ile doldurulmuş beş mililitrelik bir şırınga ile donatılmış 23 gauge bir iğne kullanarak, kemik iliğini hücre süspansiyon tamponu içeren steril bir hücre kültürü kabına yıkayın. Hücre kümelerini nazik pipetleme ile ayrıştırın, ardından P1000 pipet kullanarak hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin.
Geçit kurulumu için, metinde verilen talimatları izleyerek numuneyi hazırlayın ve 400 mikrolitresini 35 mikron hücre süzgeci çıtçıtlı kapağı olan yuvarlak tabanlı bir polistiren test tüpüne aktarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek analizden önce ölü hücre germe reaktifini hazırlayın ve numuneye ekleyin. Ardından, akış sitometresini açın ve üreticinin talimatlarını izleyerek analiz yazılımını başlatın.
Ardından, verileri almaya başlamak için Yükle'ye basın. Çiftleri, ölü hücreleri ve soy-pozitif hücreleri hariç tuttuktan sonra, soy-negatif, c-kit-pozitif, Sca-1-pozitif fraksiyonu açın. Ardından, Flk2-pozitif fraksiyonu dışarı çıkarın.
Daha sonra CD150-pozitif, CD34-negatif veya düşük fraksiyondaki Hoxb5-pozitif veya Hoxb5-negatif pHSC'leri açın. Daha sonra,% 10 ısı ile inaktive FBS ile desteklenmiş, 600 mikrolitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS içeren 1,5 milimetrelik düşük proteinli bir bağlama tüpü hazırlayın. Hoxb5-pozitif veya Hoxb5-negatif pHSC sıralamayı gerçekleştirmek için, hazırlanan 1.5-mililitre düşük proteinli bağlama tüpünü bir sıralama toplama cihazına ayarlayın ve daha önce bahsedilen geçit stratejisini kullanarak Hoxb5-pozitif veya Hoxb5-negatif pHSC'leri tüpe sıralayın.
İlk sıralamada, sıralama hassasiyeti modundaki verimi kullanın. 96 delikli plakayı, otomatik hücre biriktirme ünitesi aşamasında önceden hazırlanmış destekleyici hücrelerle ayarlayın. Ardından, 1,5 mililitrelik düşük proteinli bağlama tüpünü akış sitometresinin yükleme portuna ayarlayın.
Hoxb5-pozitif veya Hoxb5-negatif pHSC'leri, daha önce bahsedilen geçit stratejisini kullanarak destekleyici hücrelerle birlikte 96 delikli plakaya sıralayın. Kendi kendini yenileme kapasitelerini test etmek için 10 Hoxb5-pozitif veya Hoxb5-negatif pHSC'yi sıralayın. Donör Hoxb5-tri-mCherry farelerinin kemik iliği analizinin akış sitometri grafikleri, soy negatif, c-kit pozitif, Sca-1-pozitif, CD150-pozitif, CD34-negatif veya düşük, Flk2-negatif ile tanımlanan pHSC fraksiyonundaki hücrelerin yaklaşık% 20 ila 25'inin Hoxb5-pozitif pHSC'ler olduğunu ortaya koymuştur.
Burada, alıcı farelerin periferik kan analizinin temsili akış sitometri grafikleri gösterilmiştir. Ayrıca, primer transplantasyondan sonra alıcı farelerin periferik kan analizi, Hoxb5-pozitif ve Hoxb5-negatif pHSC'lerin transplantasyondan dört hafta sonra benzer donör kimerizmi sunmasına rağmen, sadece Hoxb5-pozitif pHSC alıcılarında sürekli hematopoez gözlendiğini ortaya koymuştur. Hoxb5 negatif HSC'ler transplantasyondan sekiz hafta sonra hematopoetik hücre üretme yeteneğini kaybetmeye başladı.
Sekonder transplantasyon analizinde sadece Hoxb5 pozitif pHSC alıcılarında sağlam hematopoez saptandı. Buna karşılık, Hoxb5-negatif pHSC alıcı farelerde donör hücreler neredeyse hiç gözlenmedi, bu da Hoxb5-negatif pHSC'lerin primer transplantasyondan sonraki 16 hafta içinde kendini yenileme yeteneğini kaybettiğini düşündürdü. Bu protokol genellikle dokuz ila 12 saat sürer, bu nedenle hücre canlılığını korumak için numuneyi prosedürler boyunca mümkün olduğunca dört santigrat derecede tutmak önemlidir.
