Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 hibe ve RU-1652 / 1-1 ile desteklenmiştir. Biz mükemmel teknik yardım ve destekleri için şirket DYOMICS GmbH, Jena için Doreen Mayıs teşekkür ederiz.

NOT: Tüm işlemler, bölgesel hayvan komitesi tarafından ve hayvanların etik kullanımı ile ilgili uluslararası kurallara uygun olarak onaylanmıştır. Malzeme ve Araçların 1. Hazırlık <ol><li> Kendiliğinden oluşan kese dağılımının hazırlanması (SFV) <ol><li> Aşağıdaki fosfolipidlerin stok çözelti çözülür ve hazırlanması: 214 mg / ml, yumurta fosfatidilkolini (EPC), 134 mg / ml kolesterol, 122 mg / ml 1,2-distearoil, sn -glisero-3-phosphoethanolamine- A ^ - [metoksi (polietilen glikol) -2000] (amonyum tuzu) (mPEG 2000 -DSPE) ve 2 mg / ml 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-phosphoethanolamine- A ^ - (7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4 Cam şişeler içinde kloroform ve mağaza il) (amonyum tuzu) (NBD-DOPE). </li><li> Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, yaklaşık 3 mi kloroform vermek ve EP oluşan lipozomlar elde etmek için yuvarlak dipli bir şişeye fosfolipid stok çözeltisinin uygun hacim transferiC: 3: 0.5 Kol: 6.5 bir mol oranında, mPEG 2000 -DSPE. Lipozomlar çift floresan etiketleme için lipit çözeltisine 0,3 mol% NBD-DOPE ekleyin. </li><li> Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 55 ° C&#39;de indirgenmiş basınç altında (300 mbar) altında organik fosfolipid çözeltisinden kloroform buharlaştırın. </li><li> Homojen bir fosfolipid filmi oluşturulduktan sonra, kalıntı kloroform para çıkarmak için 1-2 saat boyunca 10 mbar basınç azaltır. </li><li> Kloroform buharlaştırılır iken, 10 mM Tris tamponu pH 7.4 içinde DY-676-COOH (6,181 uM) çözülür ve sıvı azot ile birlikte bir Dewar kabı doldururlar. Ultrasonik banyoda açınız ve 50 ° C&#39;ye ayarlanmış. </li><li> DY-676-COOH (6,181 uM) bir kendiliğinden oluşan kese (SFV) dağılım oluşana kadar kuru fosfolipid filmi ve kuvvetli bir şekilde girdap hidrat yuvarlak tabanlı bir şişeye çözeltinin uygun hacmi (0.5-1 mi) aktarın. Fosfolipidlerin tüm lipit kaybını önlemek için dağınık emin olun. </li><li> Dikkatle transfer yuvarlak dipli sıvı azot içine SFV dağılımını içeren şişe ve 3-5 dakika dağılımını dondurma. Daha sonra dağılım çözülme 1-2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde dağılmasını vorteks 50 ° C&#39;de ultrasonik bir banyo içine tabanı yuvarlak bir şişe yerleştirin. Yedi dondurma ve çözülme döngüleri toplam yapım, bu prosedürü altı kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> SFV&#39;nin Ekstrüzyon homojen lipozom veziküller oluşturmak için <ol><li> 1 ml şırınga (enjektör-a) içine SFV dispersiyon aktarın ve şırınga-b bir LiposoFast-Temel ekstrüder kullanılarak 100 nm&#39;lik polikarbonat zardan dispersiyon a&#39;ya. </li><li> Geri şırınga-a içine şırınga-b dağılımını a&#39;ya, sonra döngüden on kez tekrarlayın. Nedeniyle ekstrüzyon, zaman ile belirgin bir dispersiyona bulanık bir görünüm şırınga değişir çözelti. On döngüleri (yirmi tek ekstrüzyon adım) cihazdan şırınga-b kaldırmak ve steril içine şırınga doğrudan son kez dağılımını a&#39;ya sonra1.5 ml&#39;lik tepkime tüpü. </li></ol></li><li> Lipozomal saflaştırılması serbest boyadan DY-676-COOH kapsüllü <ol><li> 10 mM Tris tamponu, pH 7.4 (kolon uzunluğu 28 cm, çap 0.8 sm), batırılmış G25 boncuklar kullanılarak, bir jel kromatografi kolonu hazırlayın. </li><li> Jel matrisi içine örnek drenaj jel yatağa çekilmiş vezikül dağılımı 0.5 ml aktarın ve izin. </li><li> 10 mM Tris tamponu pH 7.4 (Şekil 1A) ile lipozomlar Zehir ve sütun tamamen ücretsiz boya drene kadar sütun yıkayın. Ihtiyaç olması halinde, toplamak ve üreticinin talimatlarına göre tuzsuzlaştırma ve dehidrasyon ile ücretsiz boya geri dönüşüm. </li><li> Daha sonra 10 steril mM Tris tamponu, pH 7.4 içinde yeterli hacim içinde eritilmek, ultra santrifüje (200,000 x g, 8 ° C &#39;de 2 saat) ile elüte lipozomlar konsantre edilir. </li></ol></li><li> Kapsüllenmiş DY-676-COOH konsantrasyonunun miktarının belirlenmesi <ol><li> DY-676-COOH (0, 82, 124 eritilmesi ile bir kalibrasyon eğrisi hazırlamak,, 10 mM Tris tampon maddesi içinde 247, 494, 988 nM), pH 7.4,% 0.1 Triton X100 ihtiva etmektedir. </li><li> Veziküller yok etmek ve kapsüllenmiş boya serbest bırakmak için% 1 Triton X100 içeren 100 ul Tris tamponu içinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca lipozomların, 2 ul (50 mmol / lt stokunun, 100 nmol son lipid) içinde çözülür. Daha sonra% 0.1 bir son Triton-X100 konsantrasyonda 10 mM Tris tamponu, pH 7.4 ile seyreltilmiş numuneleri (h / h) 1 ml&#39;lik bir toplam hacim adrestir. Nüsha halinde tüm örnekleri hazırlayın. </li><li> Bir uyarma λ = 645 nm ve emisyon λ = 700 nm emilimi ve emisyon tüm numunelerin (ücretsiz DY-676-COOH ve Triton-X100 tedavi lipozomlar) ölçün. Kurmak ve kapsüllenmiş boyanın konsantrasyonu belirlemek için serbest bir boya kalibrasyon eğrisi kullanır. </li></ol></li><li> Lipozom karakterizasyonu <ol><li> Dinamik ışık saçılması ile lipozomların boyutları ve zeta potansiyeli belirlemek. Ac steril filtre (0.2 um), 10 mM Tris tamponu, pH 7.4 ile lipozomal örnekleri seyreltin100-300 uM (lipit) olarak oncentration. Düşük hacimli tek kullanımlık bir küvet içinde seyreltilmiş örnekleri aktarın ve üretici talimatlarına göre numune ölçer. </li><li> Standart protokollere göre lipozomal veziküllerin boyutu, bütünlüğünü ve homojenliği kanıtlamak için elektron mikroskobu ile lipozomlar karakterize etmektedir. </li></ol></li></ol> 2. Floresan-söndürme Doğrulama ve Hazırlanmış Liposome&#39;lara Aktivasyon <ol><li> Floresans ve aktivasyon fiziko kimyasal analizi <ol><li> Dudak-Q iki 1.5 ml tüpler ve ücretsiz DY-676-COOH için 2 tüpleri hazırlayın. Aktarım, 100 nmol toplam lipitler uygun tüplere (kapsül haline DY-676-COOH 138 ug / ml içeren 42 mmol / L olarak Dudak-S stok çözeltisi 2.38 ul). Dudak-Q boya içeriği (138 ug / 1.000 ul kullanılan Dudak-Q ul x 2.38 örneğin sonuçları 0.38 mikrogram) ücretsiz DY-676-COOH eşdeğer aktarın. Bir küvet inkübe4 ° C &#39;de her bir prob e ve -80 ° C&#39;de gece boyunca (16 saat), ikinci boru dondurma. </li><li> 30 ° C bir ısıtma bloğu ısıtın. Ezilmiş buz ile soğutma kutusu doldurun ve oda sıcaklığına kadar, 10 mM Tris tampon maddesi pH 7.4 bir kısım dengeye getirin. </li><li> 4 ° C ila probları çıkarın ve 5 dakika boyunca 30 ° C &#39;de -80 ° C ila problar (ışıktan korunması için bir alüminyum folyo ile sarılmış) ve hızlı bir şekilde çözülme oda sıcaklığında dengeye getirin. (Ayrıca ışıktan korumak için aliminyum folyoya sarılmıştır), oda sıcaklığında aktarmadan önce 1 dakika boyunca buz üzerinde eritildi probları soğutun. </li><li> 100 ul son hacim olması için sondaların her biri için, 10 mM Tris tampon (pH 7.4) ilave edilir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bütün sondalar dengeye getirin. </li><li> Pipet 80 düşük hacimli cam küvetin içine her sonda ul ve bir spektrometre üzerinde 400-900 nm her sonda emilimini ölçmek. Bunlara karşılık gelen tüplere probu dönün. </li><li> Uygun bir cam küvet içinde her bir prob 80 ul transferve 674 nm heyecan verici prob tarafından spektroflorometre floresan emisyon ölçümü ve 694-800 nm floresan ölçüm. </li></ol></li><li> Bir hücresel kabul etme ve floresan aktivasyon <ol><li> Standart koşullar (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nemlendirilmiş atmosfer içinde) &#39;e uygun mukabil kültür ortamı aşağıdaki hücre çizgileri almak ve kültür. Burada, mürin makrofaj hücre çizgisi J774A.1 kullanımı (Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı,% 10 (h / h) fetal dana serumu ile takviye edilmiş), insan glioblastoma hücre çizgisi olan U-118 mg (temel vitaminler ve% 10 gliserol içeren MEM (h / h) fetal dana serumu) ve insan fibrosarkoma hücre çizgisi, HT-1080 (% 5 FCS ile RPMI). </li><li> Poli-L-lisin ile kaplayın 8 oyuklu bölmeli lamlar (her bir oyuğa 100 ul% 0.001 poli-L-lisin ilave edin ve 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Aspire çözeltisi ve bölmeli lamlar en az 4 için kuruması steril bir tezgah üzerinde oda sıcaklığında saat. odacık slaytları durulayın 3gerekli kadar 200 ul Hank tamponlu salin solüsyonu ile katı daha sonra 4 ° C de parafin, alüminyum folyo ve mağaza ile kapatın. </li><li> Odası slaytlar kuruyor iken gerekli kadar, 4 ° C&#39;de lipozomlar ve boya çözüm ve mağaza filtre sterilize. </li><li> In vivo, NIR floresan görüntüleme sisteminde tüm vücutla sistemi alım analizi için 3 test hücre çizgilerinin her biri için 5, küçük kültür şişeleri (toplam 15 şişeler) hazırlanması. Tohum, 2 x 10 6 J774A.1 U-118 mg ve (beşe olarak) ilgili kültür ortamına 5 ml kültür şişesi başına HT-1080 hücreleri ve 16-24 saat süre ile büyür. , Kültür şişeleri paralel sırasıyla odası slayt 2 kuyuları her hücre hattı (J774A.1 ve HT-1080) veya 20.000 hücreleri (U-118 mg) 30.000 hücrelerini tohum ve 16-24 saat 500 ul kültür ortamında büyümek . </li><li> Bir sonraki gün, hücre hattı başına slaytı üzerinde her bir hücre hattı bir oyuğuna 2 şişelere Dudak-Q, 100 nmol (nihai yağ miktarı) ekleyin.Hemen 1 4 ° C&#39;ye hücre hattı başına şişeyi geri inkübatör ikinci şişeyi aktarmak. NOT: odacık slaytlar üzerinde konsantrasyon yapma, prob hacmi şişelere ilave ve oda slaytlar aynı 10 kat daha yüksek (5 ml 500 ul kültür ortamı için). Mikroskobik algılama şişeler hücre topakları görüntülü NUR floresan görüntüleme sistemi daha az duyarlı olduğu için bu gereklidir. </li><li> Hücre hattı başına slaytı üzerinde her bir hücre hattı bir oyuğuna 2 şişelerinde hücrelere Dudak-Q boya içeriğinin eşdeğer bir konsantrasyonda serbest DY-676-COOH eklenmekte, daha sonra, hemen hücre çizgisi başına 1 bir balona 4 ° C&#39;de (enerji tüketimi) ve arka inkübatör slaytı ile birlikte başka bir şişeye alın. Karşılık gelen koşullar altında, 24 saat süre ile, tüm hücreleri inkübe edin. prob olmadan şişede hücreler işlemden geçirilmemiş kontrol vermektedir. </li></ol></li><li> NIRF görüntüleme ve yarı-kantitatif analizi <ol><li> 24 saatlik bir bekletme süresinden sonra, Hanks ile hücreler 2 defa yıkayarak şişelerinde hücreler hasat 500 ul tüplerinde tuz çözeltisi (HBSS), daha sonra santrifüj (200 xg 5 dakika) ile 500 ul HBSS içinde hücreleri ve pelet kazıma tamponlu. </li><li> Uyarma (615-665 nm) ve emisyon (&gt; 700 nm olarak kesme) için hücre pelet (ve HBSS) bir NIRF görüntüleyici ve görüntü kullanarak filtreleri tüpleri yerleştirin. </li><li> Otofloresans düşeriz ve üretici talimatlarına göre otofloresansı karşı hedefin yoğunluğunu değerlendirmek. Bu ölçümler birbirleri arasında karşılaştırılabilir, böylece pozlama süresi, kamera kazanç, binning ve bit derinliği ölçeklendirme sonra sayım düzeylerini temsil eden ortalama sinyali olarak floresan yoğunluğu (ölçekli sayım / sn), yarı-kantitatif seviyelerini verecektir. </li></ol></li><li> Konfokal mikroskopik analizler <ol><li> 24 saat inkübasyondan sonra, 500 ul HBSS ile 2 kez yıkayarak odası slaytlar üzerinde hücreleri hasat. </li><li> Ce Fix200 ul HBSS, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 3.7 (h / h) formaldehid içeren rf. </li><li> Fiksasyon devam ederken, DNA leke montaj çözümü ile, Hoechst-33258 01:50 sulandırmak. </li><li> Tespit edildikten sonra, daha sonra HBSS ile hücreleri 2 kez yıkayın cam slaytlar gelen odaları ayrı. Kamara slayt kuyulara gelen her yerinde DNA leke içeren 50 ul montaj çözümü ekleyin. RT (karanlık) saydam tırnak cilası ve havada kurumaya 10 dakika boyunca kenarları mühür, cam kapak slipleri ile hücreleri örtün. </li><li> Uygun bir floresan mikroskop veya konfokal mikroskop görüntü hücreleri. Çekirdekler (Hoechst-33258: Uyarma 405 nm, emisyon 420-480 nm) karşılık gelen bileşenlerin görünüm için aşağıdaki uyarma ve emisyon ayarlarını kullanın. NBD-DOPE (lipozom, lipid: eksitasyon 488 nm, emisyon 530 nm). DY-676-COOH (NUR floresan boya: Uyarma 633-645 nm, emisyon 650-700 nm). NOT: emin olun floresan mikroskop birgurupları yüksek 630 nm&#39;den daha dalga boylarının uyarılma ve emisyon izin uygun filtreler ile donatılmıştır. </li></ol></li></ol> 3. iltihabın canlı Floresans görüntülenmesi Lipozom temelli <ol><li> Hayvanlar ve malzemelerin hazırlanması <ol><li> Ev 8-12 haftalık yiyecek ve su ad libitum ile, standart koşullar altında, yaklaşık 36 g ağırlığında, erkek NMRI fareleri. </li><li> Yedi gün önce deney başlamadan önce, doku otoflüoresan azaltmak için tüm fareler düşük pheophorbide diyet verir. </li><li> Yirmi dört saat, her bir deney başlamadan önce, arzu edilen alanda, fareler tıraş (örneğin, arka ayak ödemi görüntüleme arzu edildiği takdirde, tüm arka bölge). </li><li> Hayvanlar tartılır ve prob miktarını hesaplamak Dudak-Q kullanılan içeriğini boya ağırlık ve ücretsiz DY-676-COOH (eşdeğeri kg başına) 10 ľmol (lipit konsantrasyonda fare (Dudak-Q ve Dudak-dK&#39;un başına enjekte edilecek) . </li><li> Resim hayvanlardaHücre pelet için kullanılan aynı ayarlarla bir tüm vücut NUR Floresan görüntüleyici. Bu ölçüm, hayvanların otoflüoresanı içerir. </li><li> 1 ml izotonik tuzlu su çözeltisi, 10 mg zimosan-A çözülür ve 4 ° C de bir gece boyunca muhafaza ediniz. </li></ol></li><li> Enflamasyon ve in vivo NIRF görüntüleme İndüksiyon <ol><li> Aşağıdaki çözümleri içeren fare başına 3 şırınga hazırlayın. 50 ul zimosan-bir (10 mg / ml) ve 50 ul izotonik tuzlu su çözeltisi ile ikinci şırınga ile bir şırınga doldurun. Kontrol hayvanlar için Dudak-Q ve Dudak-dK (10 mmol / kg ağırlık (lipit)) (Dudak-Q gibi konsantrasyon) deney hayvanlarında ve ücretsiz DY-676-COOH için belirlenmiş sayede sondalar, üçüncü şırınga doldurun. Sondalar 150 ul son hacim olması için steril HBSS ile seyreltildi olduğundan emin olun. </li><li> (Kuruluğu önlemek ve derinden uykuda kadar% 2 izofluran ile hayvanları uyutmak ve pençeleri üzerinde dokunulduğunda tepki yok etmek için hayvanların gözleri göz kremi uygulayınBu) yaklaşık 2 dakika sürer. </li><li> (Hala anestezi altında) sıcak minder üzerinde fareyi yerleştirin ve sağ arka bacağında zimosan-A çözüm deri altına ve sol arka bacak üzerinde tuzlu su çözeltisi enjekte. (T 0 saat = gibi) enjeksiyonu / ölçüm kayıt süresi hemen intravenöz prob enjekte ve daha sonra sonra görüntü hayvan. Görüntü küp olarak ortaya çıkan görüntüleri kaydetmek ve tüm diğer hayvanlar ve ilgili problar için yukarıdaki adımları tekrarlayın. </li><li> Görüntü hayvanlar ölçüm odasının aşaması (örneğin, altında sıcak mat koyarak) sıcak olduğundan emin her 10 saat sonrası enjeksiyon için 2 saat ve daha sonra 24 saat sonrası enjeksiyon, hipotermi önlemek için. Her ölçümden sonra, yiyecek ve su ad libitum bir kafese hayvanları yerleştirin ve ılıman bir hayvan odasında kafes yerleştirin. Hayvanlar artık dokunmak tepki kadar, daha sonra, 5-10 dakika boyunca karbon dioksit ile euthanize yapma% 2 izofluran ile ilk anestezi ile hayvanlar EuthanizeEmin hayvanlar tamamen nefes durdurmak ve rigor mortis oluşur. </li><li> Standart çevrimiçi değerlendirilebilir protokoller (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) ve görüntü organları göre fareler parçalara ayır. </li><li> İlk hayvanlarda (karışmama) (serum fizyolojik ile arka bacak sol) otofloresansı ilgi ve iltihaplı bölgenin hedef floresan (zimosan-A ile sağ arka bacak) sonra atama bölgelerin genel floresan indirilmesiyle üreticinin talimatlarına göre ölçüm sonuçlarını değerlendirmek. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Lipozomlar aynı zamanda flüoresan boyalar için iletim sistemleri olarak kullanılabilir olduğundan, bunlar hedef hastalıklar görüntüleme sağlar. örneğin NIRF boya, burada kullanılan DY676-COOH, gibi floresan boyalar yüksek konsantrasyonlarda kapsülleme tutulmuş boyanın flüoresan söndürme yüksek düzeyde olur. Floresan söndürme, yüksek konsantrasyonda birçok floroforlar görülen bir olgu hedef alan bir yüksek hassasiyet ve güvenilir algılama talep edilen in vivo görüntüleme uygulam...

Lipozomlar, yoğun bir şekilde araştırılmıştır ve klinik uygulamalarda 1,2 en, biyo-uyumlu biyomedikal ilaç verme sistemlerinden biri olarak hizmet edilmiştir. Bunlar ağırlıklı olarak doğal hücre zarlarının bölümleri taklit eden biyolojik olarak uyumlu bileşikler, her ikisi de fosfolipidler ile kolesterol, oluşmaktadır. Hidrofilik maddelerin sulu iç kısım içinde kalan edilebilir iken, lipofilik maddeler, lipozomal fosfolipid çift-katlı 3 içine dahil edilebilir. Lipozomların, sulu iç kısmında maddelerin kapsüllenmesi, in vivo bozulmaya karşı koruma sağlar ve aynı zamanda tümör hücreleri yok etmeyi amaçlayan, örneğin kemoterapi için hastalıkların tedavisi için kullanılan sitotoksik ilaçların toksik etkileri ana sistemi engeller. polietilenglikole gibi polimerler ile lipozomal yüzeyinin modifikasyonu (PEGylation) ayrıca nedeniyle sterik stabilizasyon 4 in vivo lipozomal kan dolaşımı süresini uzatır. Moreover, lipozomlar gibi proteinler 5,6, hidrofil maddeler 7,8 ve enzimler 9 gibi çeşitli maddelerin yüksek konsantrasyonları çekilmek olabilir. Bu nedenle kanser tedavisi 4 doksorubisin gibi sitotoksik ilaçların verilmesi için onların onayını hak güvenilir klinik tedavi ve tanı araçları hizmet vermektedir. Dolayı esneklik, lipozomlar da teşhis ve görüntü kılavuzluğunda cerrahi amaçlı fluorochromes ile yüklenebilir. Floresan görüntüleme sağlayan bir maliyet-etkin ve ancak, bazı temel gereksinimleri talep in vivo teşhis aracı non-invaziv. Bu, in vivo görüntüleme için en uygun fluorokromun ışık dağılımı ve saçılma yanı sıra sudan kaynaklanan doku otofloresansı ve hemoglobin düşük aralıkta karakteristik absorpsiyon ve emisyon maksimum seviyesine sahip olduğu gösterilebilir. Böylece, bu tür sondalar 650 nm ve 10 900 arasında kendi abs / em maxima var.<html> Opsonizasyon ve hızlı temizleme büyük ölçüde, in vivo görüntüleme 11 için bunların uygulanmasını kısıtlar; gibi bu yanı, in vitro ve in vivo olarak florokromlar stabilitesi çok önemlidir. Bu tür zayıf kararlılık ve düşük hassasiyet ya da indosiyanin yeşilinin (ICG) 12-16 görüldüğü gibi hedef organlarda üzerinde sitotoksik etkiler gibi diğer etkiler, istenmeyen ve in vivo görüntüleme için sondalar tasarlarken dikkate alınması gerekir. Bu gözlemler, birçok ön-klinik NIR florokromlar, nanopartiküller olarak enflamatuar süreçler, kanser, in vivo görüntüleme ve görüntü kılavuzlu ameliyat 17-20 için yeni teknikler aktif gelişmesine yol açmıştır. En klinik öncesi NIRF (yakın kızıl ötesi floresan) stabilitesi rağmen boyalar in vitro karaciğer ve böbrek yoluyla hızlı bir perfüzyon ve temizlik hastalıkları ve inflamatuar süreçlere in vivo optik görüntüleme kullanılmasını engellemektedir. ntent &quot;&gt; Bu nedenle örneğin florokrom kapsüllenmesi için bir protokol mevcut iyi karakterize yakın kızılötesi lipozomlar içinde oldukça yüksek konsantrasyonlarda 21 kendi kendini söndürme eğiliminden bilinen fluoresan boya DY-676-COOH. Yüksek konsantrasyonlarda H dimer oluşumu ve / veya bir pi-istiflenmesi, flüorofor molekülleri artışı arasındaki düşük bir konsantrasyonda. alan florokrom moleküller arasında Förster rezonans enerji transferi (FRET) birbirlerinin Förster yarıçapı sonucu içinde bulunan florofor molekülleri arasındaki etkileşimi ve böylece bir pi-istifleme etkileşimi önleme ve &#39;H-dimer oluşumu ve yüksek floresan emisyonu. Yüksek ve düşük konsantrasyonu ve eşlik eden floresans ve aktivasyonu arasında geçiş optik görüntüleme 22 yararlanılabilir gelecek vaat eden bir stratejidir. NIRF boyanın yüksek konsantrasyonlarda Bu bağlamda, sarma Lipozomlar, sulu iç DY-676-COOH daha falıdırserbest boya daha in vivo görüntüleme için vorable. Yöntemin meydan boya yüksek konsantrasyonlarda kapsüllenmesi kaynaklanan faydaların doğrulama, ikincisi doğru kapsülleme tüm ilk ve yatıyor. Boya düşük konsantrasyonlarda olmayan bir söndürüldü lipozom formülasyonu ile ücretsiz boya o ile söndürüldü lipozomlann görüntüleme özelliklerinin karşılaştırılması ve vazgeçilmezdir. Biz lipozomlarda DY-676-COOH söndürme konsantrasyonlarının kapsülleme mümkündür alternatif donma ve çözülme döngüleri ile birlikte basit, ama son derece etkili bir film hidrasyon ve ekstrüzyon protokolü tarafından gösteriyor. Bu tür ters fazlı buharlaştırma yöntemi 23 olarak etanol enjeksiyon metoduna 24 gibi lipozomlar elde etmek için kullanılan diğer yöntemler, bir çok hidrofilik madde için yüksek bir kapsülleme randımanı olan lipozom preparatı sağlamaktadır. Bununla birlikte, maddenin doğası kapsülleme etkinliğini etkileyebilir haline getirilir. Sonuç olarak,Burada sunulan film, hidrasyon ve ekstrüzyon protokolü DY-676-COOH enkapsülasyonunda en yüksek verimi ortaya çıkardı. Birkaç saat içinde iltihap işlemlerinin çalışmasına izin verir DY-676-COOH, bir zimosan kaynaklı ödem modelinde, lipozomal kapsülleme yararlarını göstermek için kullanılmıştır. Burada, bu kapsüllenmiş DY-676-COOH konsantrasyonu yüksek olan lipozomlar, serbest boya ya da düşük boya konsantrasyonları olmayan söndürüldü lipozom formülasyonuna göre ateşli süreçlerin ve in vivo optik görüntüleme bütün vücut için daha uygun olduğu gösterilmiştir. Böylece, alt protokol söndürüldü floresan lipozomlar ve in vitro ve in vivo olarak hem aktivasyonu ve görüntüleme potansiyelinin doğrulama üretmek için hızlı ve basit bir yöntem temin etmektedir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials and equipments for preparation of liposomes&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>egg phospahtidylcholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051P</td><td>Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)</td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoethanolamine-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880120P</td><td>Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoethanolamine-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145P</td><td>Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml)</td></tr><tr><td>Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)</td><td>Sartorius AG</td><td>Research RC 210 P</td><td>used for weighing the phospholipids</td></tr><tr><td>Rotavapor</td><td>B&amp;uuml;chi Labortechnik AG</td><td>R-114</td><td>used for hydration of phospholipid film</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>B&amp;uuml;chi Labortechnik AG</td><td>R-481</td><td>used for hydration of phospholipid film</td></tr><tr><td>Vacuum Controller</td><td>B&amp;uuml;chi Labortechnik AG</td><td>B-720</td><td>used for hydration of phospholipid film</td></tr><tr><td>Vacobox</td><td>B&amp;uuml;chi Labortechnik AG</td><td>B-177</td><td>used for hydration of phospholipid film</td></tr><tr><td>Circulation Chiller</td><td>LAUDA DR. R. WOBSER&lt;br/&gt; GMBH &amp;amp; CO. KG</td><td>WKL 230</td><td>used for hydration of phospholipid film</td></tr><tr><td>DY-676-COOH</td><td>Dyomics GmbH</td><td>676-00</td><td>Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Applichem</td><td>A1086</td><td>buffer 10 mM, pH 7.4</td></tr><tr><td>Trichlormethan</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>Y015.2</td><td>used for liposome preparation</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Merck Eurolab GmbH</td><td>USR 170 H</td><td>used for liposome preparation</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-0256</td><td>used for liposome preparation</td></tr><tr><td>Sephadex G25 medium&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Europe GmbH</td><td>17-0033-01</td><td>used for liposome purification</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Ferak Berlin GmbH</td><td>505002</td><td>used to destruct liposomes&amp;nbsp; for dye quantification</td></tr><tr><td>LiposoFast-Basic</td><td>Avestin Inc.</td><td></td><td>used for the extrusion of liposomes</td></tr><tr><td>Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)</td><td>VWR</td><td></td><td>used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic</td></tr><tr><td>Fluostar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>used for dye quantification</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td></td><td>used for the determination of liposome size and zetapotential</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>XL 80</td><td>used for concentration of the samples</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>SW 55 TI</td><td>used for concentration of the samples</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae</td><td>Sigma</td><td>Z4250-250MG</td><td>used for induction of inflammation</td></tr><tr><td>Isotonic Saline (0.9%)</td><td>Fresenius GmbH</td><td>PZN-2159621</td><td>used for the dilution of Zymosan-A</td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer</td><td>Ohmeda Isotec 4</td><td></td><td>used for anesthesizing animals</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Actavis GmbH&amp;nbsp;</td><td>PZN-7253744</td><td>anesthesia</td></tr><tr><td>Thermo Mat Pro 20 W</td><td>Lucky Reptile</td><td>61202-HTP-20</td><td>used to keep animals warm during anesthesia</td></tr><tr><td>Omnican-F (1 ml injection)&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td>PZN-3115465</td><td>used for subcutaneous and intravenous application of probes</td></tr><tr><td>Panthenol eye cream</td><td>Jenapharm</td><td>PZN-3524531</td><td>used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia</td></tr><tr><td>Hanks buffered saline solution</td><td>PAA Laboratories /Biochrom AG</td><td>L2045</td><td>w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells</td></tr><tr><td>8-Well chamber slides</td><td>BD Biosciences</td><td>354108</td><td>used for cell culture followed by microscopy&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cell culture flasks</td><td>Greiner BioOne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture media</td><td>Gibco (life technologies GmbH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50&amp;nbsp;ml)</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>used to coat cell culture chamber slides</td></tr><tr><td>Mountant Permafluor</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>S21022-3</td><td>Mounting solution for microscopy</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>AppliChem</td><td></td><td>DNA stain for microscopy</td></tr><tr><td>Hera-Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>sterile work bench used for cell culture</td></tr><tr><td>HERA cell</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>Incubator used for cell culture</td></tr><tr><td>LSM510-Meta</td><td>Zeiss</td><td></td><td>used for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system</td><td>CRi, Woburn</td><td></td><td>used for whole body fluorescence imaging of small animals</td></tr><tr><td>Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>used for measurement of absorption</td></tr><tr><td>Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)</td><td>Jasco</td><td></td><td>used for measurement of fluorescence emission</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Animals&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NMRI mice (8-12 weeks old, male)</td><td>Elevage Janvier, France</td><td></td><td>used for inflammation trials</td></tr></tbody></table>

fluorescence-quenching of a liposomal-encapsulated near-infrared fluorophore as a tool for in vivo optical imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

lipozomlar, sulu iç Burada kullanılan NIRF boya DY676-COOH gibi floresan boyalar yüksek konsantrasyonlarda kapsülleme floresans yüksek bir seviyeye neden olur. Floresan söndürme, yüksek konsantrasyonda birçok floroforlar görülen bir fenomen, hedef alan bir yüksek hassasiyet ve güvenilir algılama talep edilen in vivo görüntüleme uygulamalarında çeşitli istismar edilebilir. Lipozomların kullanımı, aynı zamanda, in vivo uygulamalar için gerekli olan boya koruma sağlar. L...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging at JoVE.com

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

fluorescence-quenching-liposomal-encapsulated-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

16.2K Görüntüleme.  Jena University Hospital. The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity. 

Video: Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely manipulate neural firing, hormonal secretion and genetically-reprogrammed cells. However, the translation of this technology for medical applications is currently hampered by a lack of biophysical mechanisms by which targeted tissues sense and respond to LIPUS. A suitable approach to identify these mechanisms would be to use optical biosensors in combination with LIPUS to determine underlying signaling pathways. However, implementing LIPUS to a fluorescence microscope may introduce undesired mechanical artefacts due to the presence of physical interfaces that reflect, absorb and refract acoustic waves. This article presents a step-by-step procedure to incorporate LIPUS to commercially-available upright epi-fluorescence microscopes while minimizing the influence of physical interfaces along the acoustic path. A simple procedure is described to operate a single-element ultrasound transducer and to bring the focal zone of the transducer into the objective focal point. The use of LIPUS is illustrated with an example of LIPUS-induced calcium transients in cultured human glioblastoma cells measured using calcium imaging.

Low-Intensity Pulsed Ultrasound Stimulation (LIPUS) is a modality for non-invasive mechanical stimulation of endogenous or engineered cells with high spatial and temporal resolution. This article describes how to implement LIPUS to an epi-fluorescence microscope and how to minimize acoustic impedance mismatch along the ultrasound path to prevent unwanted mechanical artefacts.

Çoğullama ultrason stimülasyon floresans mikroskobu ile odaklı

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Mühendislik

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

Floresan SapC-DOPS Nanovesicles kullanma Beyin Tümörleri ve Artrit Vivo Optik Görüntüleme

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Tıp

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery (BCS). Optical imaging, in particular near-infrared fluorescence (NIRF) imaging, might reduce the frequency of positive surgical margins following BCS by providing the surgeon with a tool for pre- and intraoperative tumor localization in real-time. In the current study, the potential of NIRF-guided BCS is evaluated using tissue-simulating breast phantoms for reasons of standardization and training purposes.
Breast phantoms with optical characteristics comparable to those of normal breast tissue were used to simulate breast conserving surgery. Tumor-simulating inclusions containing the fluorescent dye indocyanine green (ICG) were incorporated in the phantoms at predefined locations and imaged for pre- and intraoperative tumor localization, real-time NIRF-guided tumor resection, NIRF-guided evaluation on the extent of surgery, and postoperative assessment of surgical margins. A customized NIRF camera was used as a clinical prototype for imaging purposes.
Breast phantoms containing tumor-simulating inclusions offer a simple, inexpensive, and versatile tool to simulate and evaluate intraoperative tumor imaging. The gelatinous phantoms have elastic properties similar to human tissue and can be cut using conventional surgical instruments. Moreover, the phantoms contain hemoglobin and intralipid for mimicking absorption and scattering of photons, respectively, creating uniform optical properties similar to human breast tissue. The main drawback of NIRF imaging is the limited penetration depth of photons when propagating through tissue, which hinders (noninvasive) imaging of deep-seated tumors with epi-illumination strategies.

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Meme Kanseri Cerrahisinde Potansiyel Yakın kızılötesi Floresans Görüntüleme Uygulamaları değerlendirilmesi için Phantom Doku-simüle

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

Non-invaziv<emIn vivo</em&gt; Aktive Edilebilir Floresan Görüntüleme Ajanını Kullanan İnflamatuvar MMP Aktivitesinin Flüoresan Optik Görüntülemesi

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Vitro Lipid tabanlı nano tanecikleri tarafından canlı hücre Chemotherapeutics keşfetmek için Imaging teslim kullanma

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

Fiberoptik Konfokal Lazer Mikroendoskopi Kullanılarak Oküler İlaç Dağıtım Sistemlerinin Spatio-Temporal In Vivo Görüntülemesi

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Biyomühendislik

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Biyoloji

A Bright NIR-II Fluorescence Probe for Vascular and Tumor Imaging

As an emerging imaging technology, near-infrared II (NIR-II, 1000-1700 nm) fluorescence imaging has significant potential in the biomedical field, owing to its high sensitivity, deep tissue penetration, and superior imaging with spatial and temporal resolution. However, the method to facilitate the implementation of NIR-II fluorescence imaging for some urgently needed fields, such as medical science and pharmacy, has puzzled relevant researchers. This protocol describes in detail the construction and bioimaging applications of a NIR-II fluorescence molecular probe, HLY1, with a D-A-D (donor-acceptor-donor) skeleton. HLY1 showed good optical properties and biocompatibility. Furthermore, NIR-II vascular and tumor imaging in mice was performed using a NIR-II optics imaging device. Real-time high-resolution NIR-II fluorescence images were acquired to guide the detection of tumors and vascular diseases. From probe preparation to data acquisition, the imaging quality is greatly improved, and the authenticity of the NIR-II molecular probes for data recording in intravital imaging is ensured.

The present protocol describes a detailed, real-time NIR-II fluorescence imaging operation of a mouse using a NIR-II optics imaging device.

Vasküler ve Tümör Görüntüleme için Parlak Bir NIR-II Floresan Probu

As an emerging imaging technology, near-infrared II (NIR-II, 1000-1700 nm) fluorescence imaging has significant potential in the biomedical field, owing ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ranging from solid-state, O2-sensitive coatings to live animal tissue samples stained with soluble O2-sensitive probes. In particular, the nanoparticle-based near-infrared probe NanO2-IR, which is excitable with a 625 nm light-emitting diode (LED) and emits at 760 nm, was used. The imaging system is based on the Timepix3 camera (Tpx3Cam) and the opto-mechanical adaptor, which also houses an image intensifier. O2 phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) is commonly required for various studies, but current platforms have limitations in their accuracy, general flexibility, and usability.
The system presented here is a fast and highly sensitive imager, which is built on an integrated optical sensor and readout chip module, Tpx3Cam. It is shown to produce high-intensity phosphorescence signals and stable lifetime values from surface-stained intestinal tissue samples or intraluminally stained fragments of the large intestine and allows the detailed mapping of tissue O2 levels in about 20 s or less. Initial experiments on the imaging of hypoxia in grafted tumors in unconscious animals are also presented. We also describe how the imager can be re-configured for use with O2-sensitive materials based on Pt-porphyrin dyes using a 390 nm LED for the excitation and a bandpass 650 nm filter for emission. Overall, the PLIM imager was found to produce accurate quantitative measurements of lifetime values for the probes used and respective two-dimensional maps of the O2 concentration. It is also useful for the metabolic imaging of ex vivo tissue models and live animals.

This paper describes the use of a new, fast optical imager for the macroscopic photoluminescence lifetime imaging of long decay emitting samples. The integration, image acquisition, and analysis procedures are described, along with the preparation and characterization of the sensor materials for the imaging and the application of the imager in studying biological samples.

Biyomedikal Uygulamalar için Floresan Ömür Boyu Makro Görüntüleyici

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler