Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 hibe ve RU-1652 / 1-1 ile desteklenmiştir. Biz mükemmel teknik yardım ve destekleri için şirket DYOMICS GmbH, Jena için Doreen Mayıs teşekkür ederiz.

NOT: Tüm işlemler, bölgesel hayvan komitesi tarafından ve hayvanların etik kullanımı ile ilgili uluslararası kurallara uygun olarak onaylanmıştır. Malzeme ve Araçların 1. Hazırlık <ol><li> Kendiliğinden oluşan kese dağılımının hazırlanması (SFV) <ol><li> Aşağıdaki fosfolipidlerin stok çözelti çözülür ve hazırlanması: 214 mg / ml, yumurta fosfatidilkolini (EPC), 134 mg / ml kolesterol, 122 mg / ml 1,2-distearoil, sn -glisero-3-phosphoethanolamine- A ^ - [metoksi (polietilen glikol) -2000] (amonyum tuzu) (mPEG 2000 -DSPE) ve 2 mg / ml 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-phosphoethanolamine- A ^ - (7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4 Cam şişeler içinde kloroform ve mağaza il) (amonyum tuzu) (NBD-DOPE). </li><li> Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, yaklaşık 3 mi kloroform vermek ve EP oluşan lipozomlar elde etmek için yuvarlak dipli bir şişeye fosfolipid stok çözeltisinin uygun hacim transferiC: 3: 0.5 Kol: 6.5 bir mol oranında, mPEG 2000 -DSPE. Lipozomlar çift floresan etiketleme için lipit çözeltisine 0,3 mol% NBD-DOPE ekleyin. </li><li> Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 55 ° C&#39;de indirgenmiş basınç altında (300 mbar) altında organik fosfolipid çözeltisinden kloroform buharlaştırın. </li><li> Homojen bir fosfolipid filmi oluşturulduktan sonra, kalıntı kloroform para çıkarmak için 1-2 saat boyunca 10 mbar basınç azaltır. </li><li> Kloroform buharlaştırılır iken, 10 mM Tris tamponu pH 7.4 içinde DY-676-COOH (6,181 uM) çözülür ve sıvı azot ile birlikte bir Dewar kabı doldururlar. Ultrasonik banyoda açınız ve 50 ° C&#39;ye ayarlanmış. </li><li> DY-676-COOH (6,181 uM) bir kendiliğinden oluşan kese (SFV) dağılım oluşana kadar kuru fosfolipid filmi ve kuvvetli bir şekilde girdap hidrat yuvarlak tabanlı bir şişeye çözeltinin uygun hacmi (0.5-1 mi) aktarın. Fosfolipidlerin tüm lipit kaybını önlemek için dağınık emin olun. </li><li> Dikkatle transfer yuvarlak dipli sıvı azot içine SFV dağılımını içeren şişe ve 3-5 dakika dağılımını dondurma. Daha sonra dağılım çözülme 1-2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde dağılmasını vorteks 50 ° C&#39;de ultrasonik bir banyo içine tabanı yuvarlak bir şişe yerleştirin. Yedi dondurma ve çözülme döngüleri toplam yapım, bu prosedürü altı kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> SFV&#39;nin Ekstrüzyon homojen lipozom veziküller oluşturmak için <ol><li> 1 ml şırınga (enjektör-a) içine SFV dispersiyon aktarın ve şırınga-b bir LiposoFast-Temel ekstrüder kullanılarak 100 nm&#39;lik polikarbonat zardan dispersiyon a&#39;ya. </li><li> Geri şırınga-a içine şırınga-b dağılımını a&#39;ya, sonra döngüden on kez tekrarlayın. Nedeniyle ekstrüzyon, zaman ile belirgin bir dispersiyona bulanık bir görünüm şırınga değişir çözelti. On döngüleri (yirmi tek ekstrüzyon adım) cihazdan şırınga-b kaldırmak ve steril içine şırınga doğrudan son kez dağılımını a&#39;ya sonra1.5 ml&#39;lik tepkime tüpü. </li></ol></li><li> Lipozomal saflaştırılması serbest boyadan DY-676-COOH kapsüllü <ol><li> 10 mM Tris tamponu, pH 7.4 (kolon uzunluğu 28 cm, çap 0.8 sm), batırılmış G25 boncuklar kullanılarak, bir jel kromatografi kolonu hazırlayın. </li><li> Jel matrisi içine örnek drenaj jel yatağa çekilmiş vezikül dağılımı 0.5 ml aktarın ve izin. </li><li> 10 mM Tris tamponu pH 7.4 (Şekil 1A) ile lipozomlar Zehir ve sütun tamamen ücretsiz boya drene kadar sütun yıkayın. Ihtiyaç olması halinde, toplamak ve üreticinin talimatlarına göre tuzsuzlaştırma ve dehidrasyon ile ücretsiz boya geri dönüşüm. </li><li> Daha sonra 10 steril mM Tris tamponu, pH 7.4 içinde yeterli hacim içinde eritilmek, ultra santrifüje (200,000 x g, 8 ° C &#39;de 2 saat) ile elüte lipozomlar konsantre edilir. </li></ol></li><li> Kapsüllenmiş DY-676-COOH konsantrasyonunun miktarının belirlenmesi <ol><li> DY-676-COOH (0, 82, 124 eritilmesi ile bir kalibrasyon eğrisi hazırlamak,, 10 mM Tris tampon maddesi içinde 247, 494, 988 nM), pH 7.4,% 0.1 Triton X100 ihtiva etmektedir. </li><li> Veziküller yok etmek ve kapsüllenmiş boya serbest bırakmak için% 1 Triton X100 içeren 100 ul Tris tamponu içinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca lipozomların, 2 ul (50 mmol / lt stokunun, 100 nmol son lipid) içinde çözülür. Daha sonra% 0.1 bir son Triton-X100 konsantrasyonda 10 mM Tris tamponu, pH 7.4 ile seyreltilmiş numuneleri (h / h) 1 ml&#39;lik bir toplam hacim adrestir. Nüsha halinde tüm örnekleri hazırlayın. </li><li> Bir uyarma λ = 645 nm ve emisyon λ = 700 nm emilimi ve emisyon tüm numunelerin (ücretsiz DY-676-COOH ve Triton-X100 tedavi lipozomlar) ölçün. Kurmak ve kapsüllenmiş boyanın konsantrasyonu belirlemek için serbest bir boya kalibrasyon eğrisi kullanır. </li></ol></li><li> Lipozom karakterizasyonu <ol><li> Dinamik ışık saçılması ile lipozomların boyutları ve zeta potansiyeli belirlemek. Ac steril filtre (0.2 um), 10 mM Tris tamponu, pH 7.4 ile lipozomal örnekleri seyreltin100-300 uM (lipit) olarak oncentration. Düşük hacimli tek kullanımlık bir küvet içinde seyreltilmiş örnekleri aktarın ve üretici talimatlarına göre numune ölçer. </li><li> Standart protokollere göre lipozomal veziküllerin boyutu, bütünlüğünü ve homojenliği kanıtlamak için elektron mikroskobu ile lipozomlar karakterize etmektedir. </li></ol></li></ol> 2. Floresan-söndürme Doğrulama ve Hazırlanmış Liposome&#39;lara Aktivasyon <ol><li> Floresans ve aktivasyon fiziko kimyasal analizi <ol><li> Dudak-Q iki 1.5 ml tüpler ve ücretsiz DY-676-COOH için 2 tüpleri hazırlayın. Aktarım, 100 nmol toplam lipitler uygun tüplere (kapsül haline DY-676-COOH 138 ug / ml içeren 42 mmol / L olarak Dudak-S stok çözeltisi 2.38 ul). Dudak-Q boya içeriği (138 ug / 1.000 ul kullanılan Dudak-Q ul x 2.38 örneğin sonuçları 0.38 mikrogram) ücretsiz DY-676-COOH eşdeğer aktarın. Bir küvet inkübe4 ° C &#39;de her bir prob e ve -80 ° C&#39;de gece boyunca (16 saat), ikinci boru dondurma. </li><li> 30 ° C bir ısıtma bloğu ısıtın. Ezilmiş buz ile soğutma kutusu doldurun ve oda sıcaklığına kadar, 10 mM Tris tampon maddesi pH 7.4 bir kısım dengeye getirin. </li><li> 4 ° C ila probları çıkarın ve 5 dakika boyunca 30 ° C &#39;de -80 ° C ila problar (ışıktan korunması için bir alüminyum folyo ile sarılmış) ve hızlı bir şekilde çözülme oda sıcaklığında dengeye getirin. (Ayrıca ışıktan korumak için aliminyum folyoya sarılmıştır), oda sıcaklığında aktarmadan önce 1 dakika boyunca buz üzerinde eritildi probları soğutun. </li><li> 100 ul son hacim olması için sondaların her biri için, 10 mM Tris tampon (pH 7.4) ilave edilir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bütün sondalar dengeye getirin. </li><li> Pipet 80 düşük hacimli cam küvetin içine her sonda ul ve bir spektrometre üzerinde 400-900 nm her sonda emilimini ölçmek. Bunlara karşılık gelen tüplere probu dönün. </li><li> Uygun bir cam küvet içinde her bir prob 80 ul transferve 674 nm heyecan verici prob tarafından spektroflorometre floresan emisyon ölçümü ve 694-800 nm floresan ölçüm. </li></ol></li><li> Bir hücresel kabul etme ve floresan aktivasyon <ol><li> Standart koşullar (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nemlendirilmiş atmosfer içinde) &#39;e uygun mukabil kültür ortamı aşağıdaki hücre çizgileri almak ve kültür. Burada, mürin makrofaj hücre çizgisi J774A.1 kullanımı (Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı,% 10 (h / h) fetal dana serumu ile takviye edilmiş), insan glioblastoma hücre çizgisi olan U-118 mg (temel vitaminler ve% 10 gliserol içeren MEM (h / h) fetal dana serumu) ve insan fibrosarkoma hücre çizgisi, HT-1080 (% 5 FCS ile RPMI). </li><li> Poli-L-lisin ile kaplayın 8 oyuklu bölmeli lamlar (her bir oyuğa 100 ul% 0.001 poli-L-lisin ilave edin ve 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Aspire çözeltisi ve bölmeli lamlar en az 4 için kuruması steril bir tezgah üzerinde oda sıcaklığında saat. odacık slaytları durulayın 3gerekli kadar 200 ul Hank tamponlu salin solüsyonu ile katı daha sonra 4 ° C de parafin, alüminyum folyo ve mağaza ile kapatın. </li><li> Odası slaytlar kuruyor iken gerekli kadar, 4 ° C&#39;de lipozomlar ve boya çözüm ve mağaza filtre sterilize. </li><li> In vivo, NIR floresan görüntüleme sisteminde tüm vücutla sistemi alım analizi için 3 test hücre çizgilerinin her biri için 5, küçük kültür şişeleri (toplam 15 şişeler) hazırlanması. Tohum, 2 x 10 6 J774A.1 U-118 mg ve (beşe olarak) ilgili kültür ortamına 5 ml kültür şişesi başına HT-1080 hücreleri ve 16-24 saat süre ile büyür. , Kültür şişeleri paralel sırasıyla odası slayt 2 kuyuları her hücre hattı (J774A.1 ve HT-1080) veya 20.000 hücreleri (U-118 mg) 30.000 hücrelerini tohum ve 16-24 saat 500 ul kültür ortamında büyümek . </li><li> Bir sonraki gün, hücre hattı başına slaytı üzerinde her bir hücre hattı bir oyuğuna 2 şişelere Dudak-Q, 100 nmol (nihai yağ miktarı) ekleyin.Hemen 1 4 ° C&#39;ye hücre hattı başına şişeyi geri inkübatör ikinci şişeyi aktarmak. NOT: odacık slaytlar üzerinde konsantrasyon yapma, prob hacmi şişelere ilave ve oda slaytlar aynı 10 kat daha yüksek (5 ml 500 ul kültür ortamı için). Mikroskobik algılama şişeler hücre topakları görüntülü NUR floresan görüntüleme sistemi daha az duyarlı olduğu için bu gereklidir. </li><li> Hücre hattı başına slaytı üzerinde her bir hücre hattı bir oyuğuna 2 şişelerinde hücrelere Dudak-Q boya içeriğinin eşdeğer bir konsantrasyonda serbest DY-676-COOH eklenmekte, daha sonra, hemen hücre çizgisi başına 1 bir balona 4 ° C&#39;de (enerji tüketimi) ve arka inkübatör slaytı ile birlikte başka bir şişeye alın. Karşılık gelen koşullar altında, 24 saat süre ile, tüm hücreleri inkübe edin. prob olmadan şişede hücreler işlemden geçirilmemiş kontrol vermektedir. </li></ol></li><li> NIRF görüntüleme ve yarı-kantitatif analizi <ol><li> 24 saatlik bir bekletme süresinden sonra, Hanks ile hücreler 2 defa yıkayarak şişelerinde hücreler hasat 500 ul tüplerinde tuz çözeltisi (HBSS), daha sonra santrifüj (200 xg 5 dakika) ile 500 ul HBSS içinde hücreleri ve pelet kazıma tamponlu. </li><li> Uyarma (615-665 nm) ve emisyon (&gt; 700 nm olarak kesme) için hücre pelet (ve HBSS) bir NIRF görüntüleyici ve görüntü kullanarak filtreleri tüpleri yerleştirin. </li><li> Otofloresans düşeriz ve üretici talimatlarına göre otofloresansı karşı hedefin yoğunluğunu değerlendirmek. Bu ölçümler birbirleri arasında karşılaştırılabilir, böylece pozlama süresi, kamera kazanç, binning ve bit derinliği ölçeklendirme sonra sayım düzeylerini temsil eden ortalama sinyali olarak floresan yoğunluğu (ölçekli sayım / sn), yarı-kantitatif seviyelerini verecektir. </li></ol></li><li> Konfokal mikroskopik analizler <ol><li> 24 saat inkübasyondan sonra, 500 ul HBSS ile 2 kez yıkayarak odası slaytlar üzerinde hücreleri hasat. </li><li> Ce Fix200 ul HBSS, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 3.7 (h / h) formaldehid içeren rf. </li><li> Fiksasyon devam ederken, DNA leke montaj çözümü ile, Hoechst-33258 01:50 sulandırmak. </li><li> Tespit edildikten sonra, daha sonra HBSS ile hücreleri 2 kez yıkayın cam slaytlar gelen odaları ayrı. Kamara slayt kuyulara gelen her yerinde DNA leke içeren 50 ul montaj çözümü ekleyin. RT (karanlık) saydam tırnak cilası ve havada kurumaya 10 dakika boyunca kenarları mühür, cam kapak slipleri ile hücreleri örtün. </li><li> Uygun bir floresan mikroskop veya konfokal mikroskop görüntü hücreleri. Çekirdekler (Hoechst-33258: Uyarma 405 nm, emisyon 420-480 nm) karşılık gelen bileşenlerin görünüm için aşağıdaki uyarma ve emisyon ayarlarını kullanın. NBD-DOPE (lipozom, lipid: eksitasyon 488 nm, emisyon 530 nm). DY-676-COOH (NUR floresan boya: Uyarma 633-645 nm, emisyon 650-700 nm). NOT: emin olun floresan mikroskop birgurupları yüksek 630 nm&#39;den daha dalga boylarının uyarılma ve emisyon izin uygun filtreler ile donatılmıştır. </li></ol></li></ol> 3. iltihabın canlı Floresans görüntülenmesi Lipozom temelli <ol><li> Hayvanlar ve malzemelerin hazırlanması <ol><li> Ev 8-12 haftalık yiyecek ve su ad libitum ile, standart koşullar altında, yaklaşık 36 g ağırlığında, erkek NMRI fareleri. </li><li> Yedi gün önce deney başlamadan önce, doku otoflüoresan azaltmak için tüm fareler düşük pheophorbide diyet verir. </li><li> Yirmi dört saat, her bir deney başlamadan önce, arzu edilen alanda, fareler tıraş (örneğin, arka ayak ödemi görüntüleme arzu edildiği takdirde, tüm arka bölge). </li><li> Hayvanlar tartılır ve prob miktarını hesaplamak Dudak-Q kullanılan içeriğini boya ağırlık ve ücretsiz DY-676-COOH (eşdeğeri kg başına) 10 ľmol (lipit konsantrasyonda fare (Dudak-Q ve Dudak-dK&#39;un başına enjekte edilecek) . </li><li> Resim hayvanlardaHücre pelet için kullanılan aynı ayarlarla bir tüm vücut NUR Floresan görüntüleyici. Bu ölçüm, hayvanların otoflüoresanı içerir. </li><li> 1 ml izotonik tuzlu su çözeltisi, 10 mg zimosan-A çözülür ve 4 ° C de bir gece boyunca muhafaza ediniz. </li></ol></li><li> Enflamasyon ve in vivo NIRF görüntüleme İndüksiyon <ol><li> Aşağıdaki çözümleri içeren fare başına 3 şırınga hazırlayın. 50 ul zimosan-bir (10 mg / ml) ve 50 ul izotonik tuzlu su çözeltisi ile ikinci şırınga ile bir şırınga doldurun. Kontrol hayvanlar için Dudak-Q ve Dudak-dK (10 mmol / kg ağırlık (lipit)) (Dudak-Q gibi konsantrasyon) deney hayvanlarında ve ücretsiz DY-676-COOH için belirlenmiş sayede sondalar, üçüncü şırınga doldurun. Sondalar 150 ul son hacim olması için steril HBSS ile seyreltildi olduğundan emin olun. </li><li> (Kuruluğu önlemek ve derinden uykuda kadar% 2 izofluran ile hayvanları uyutmak ve pençeleri üzerinde dokunulduğunda tepki yok etmek için hayvanların gözleri göz kremi uygulayınBu) yaklaşık 2 dakika sürer. </li><li> (Hala anestezi altında) sıcak minder üzerinde fareyi yerleştirin ve sağ arka bacağında zimosan-A çözüm deri altına ve sol arka bacak üzerinde tuzlu su çözeltisi enjekte. (T 0 saat = gibi) enjeksiyonu / ölçüm kayıt süresi hemen intravenöz prob enjekte ve daha sonra sonra görüntü hayvan. Görüntü küp olarak ortaya çıkan görüntüleri kaydetmek ve tüm diğer hayvanlar ve ilgili problar için yukarıdaki adımları tekrarlayın. </li><li> Görüntü hayvanlar ölçüm odasının aşaması (örneğin, altında sıcak mat koyarak) sıcak olduğundan emin her 10 saat sonrası enjeksiyon için 2 saat ve daha sonra 24 saat sonrası enjeksiyon, hipotermi önlemek için. Her ölçümden sonra, yiyecek ve su ad libitum bir kafese hayvanları yerleştirin ve ılıman bir hayvan odasında kafes yerleştirin. Hayvanlar artık dokunmak tepki kadar, daha sonra, 5-10 dakika boyunca karbon dioksit ile euthanize yapma% 2 izofluran ile ilk anestezi ile hayvanlar EuthanizeEmin hayvanlar tamamen nefes durdurmak ve rigor mortis oluşur. </li><li> Standart çevrimiçi değerlendirilebilir protokoller (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) ve görüntü organları göre fareler parçalara ayır. </li><li> İlk hayvanlarda (karışmama) (serum fizyolojik ile arka bacak sol) otofloresansı ilgi ve iltihaplı bölgenin hedef floresan (zimosan-A ile sağ arka bacak) sonra atama bölgelerin genel floresan indirilmesiyle üreticinin talimatlarına göre ölçüm sonuçlarını değerlendirmek. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Lipozomlar aynı zamanda flüoresan boyalar için iletim sistemleri olarak kullanılabilir olduğundan, bunlar hedef hastalıklar görüntüleme sağlar. örneğin NIRF boya, burada kullanılan DY676-COOH, gibi floresan boyalar yüksek konsantrasyonlarda kapsülleme tutulmuş boyanın flüoresan söndürme yüksek düzeyde olur. Floresan söndürme, yüksek konsantrasyonda birçok floroforlar görülen bir olgu hedef alan bir yüksek hassasiyet ve güvenilir algılama talep edilen in vivo görüntüleme uygulam...

Lipozomlar, yoğun bir şekilde araştırılmıştır ve klinik uygulamalarda 1,2 en, biyo-uyumlu biyomedikal ilaç verme sistemlerinden biri olarak hizmet edilmiştir. Bunlar ağırlıklı olarak doğal hücre zarlarının bölümleri taklit eden biyolojik olarak uyumlu bileşikler, her ikisi de fosfolipidler ile kolesterol, oluşmaktadır. Hidrofilik maddelerin sulu iç kısım içinde kalan edilebilir iken, lipofilik maddeler, lipozomal fosfolipid çift-katlı 3 içine dahil edilebilir. Lipozomların, sulu iç kısmında maddelerin kapsüllenmesi, in vivo bozulmaya karşı koruma sağlar ve aynı zamanda tümör hücreleri yok etmeyi amaçlayan, örneğin kemoterapi için hastalıkların tedavisi için kullanılan sitotoksik ilaçların toksik etkileri ana sistemi engeller. polietilenglikole gibi polimerler ile lipozomal yüzeyinin modifikasyonu (PEGylation) ayrıca nedeniyle sterik stabilizasyon 4 in vivo lipozomal kan dolaşımı süresini uzatır. Moreover, lipozomlar gibi proteinler 5,6, hidrofil maddeler 7,8 ve enzimler 9 gibi çeşitli maddelerin yüksek konsantrasyonları çekilmek olabilir. Bu nedenle kanser tedavisi 4 doksorubisin gibi sitotoksik ilaçların verilmesi için onların onayını hak güvenilir klinik tedavi ve tanı araçları hizmet vermektedir. Dolayı esneklik, lipozomlar da teşhis ve görüntü kılavuzluğunda cerrahi amaçlı fluorochromes ile yüklenebilir. Floresan görüntüleme sağlayan bir maliyet-etkin ve ancak, bazı temel gereksinimleri talep in vivo teşhis aracı non-invaziv. Bu, in vivo görüntüleme için en uygun fluorokromun ışık dağılımı ve saçılma yanı sıra sudan kaynaklanan doku otofloresansı ve hemoglobin düşük aralıkta karakteristik absorpsiyon ve emisyon maksimum seviyesine sahip olduğu gösterilebilir. Böylece, bu tür sondalar 650 nm ve 10 900 arasında kendi abs / em maxima var.<html> Opsonizasyon ve hızlı temizleme büyük ölçüde, in vivo görüntüleme 11 için bunların uygulanmasını kısıtlar; gibi bu yanı, in vitro ve in vivo olarak florokromlar stabilitesi çok önemlidir. Bu tür zayıf kararlılık ve düşük hassasiyet ya da indosiyanin yeşilinin (ICG) 12-16 görüldüğü gibi hedef organlarda üzerinde sitotoksik etkiler gibi diğer etkiler, istenmeyen ve in vivo görüntüleme için sondalar tasarlarken dikkate alınması gerekir. Bu gözlemler, birçok ön-klinik NIR florokromlar, nanopartiküller olarak enflamatuar süreçler, kanser, in vivo görüntüleme ve görüntü kılavuzlu ameliyat 17-20 için yeni teknikler aktif gelişmesine yol açmıştır. En klinik öncesi NIRF (yakın kızıl ötesi floresan) stabilitesi rağmen boyalar in vitro karaciğer ve böbrek yoluyla hızlı bir perfüzyon ve temizlik hastalıkları ve inflamatuar süreçlere in vivo optik görüntüleme kullanılmasını engellemektedir. ntent &quot;&gt; Bu nedenle örneğin florokrom kapsüllenmesi için bir protokol mevcut iyi karakterize yakın kızılötesi lipozomlar içinde oldukça yüksek konsantrasyonlarda 21 kendi kendini söndürme eğiliminden bilinen fluoresan boya DY-676-COOH. Yüksek konsantrasyonlarda H dimer oluşumu ve / veya bir pi-istiflenmesi, flüorofor molekülleri artışı arasındaki düşük bir konsantrasyonda. alan florokrom moleküller arasında Förster rezonans enerji transferi (FRET) birbirlerinin Förster yarıçapı sonucu içinde bulunan florofor molekülleri arasındaki etkileşimi ve böylece bir pi-istifleme etkileşimi önleme ve &#39;H-dimer oluşumu ve yüksek floresan emisyonu. Yüksek ve düşük konsantrasyonu ve eşlik eden floresans ve aktivasyonu arasında geçiş optik görüntüleme 22 yararlanılabilir gelecek vaat eden bir stratejidir. NIRF boyanın yüksek konsantrasyonlarda Bu bağlamda, sarma Lipozomlar, sulu iç DY-676-COOH daha falıdırserbest boya daha in vivo görüntüleme için vorable. Yöntemin meydan boya yüksek konsantrasyonlarda kapsüllenmesi kaynaklanan faydaların doğrulama, ikincisi doğru kapsülleme tüm ilk ve yatıyor. Boya düşük konsantrasyonlarda olmayan bir söndürüldü lipozom formülasyonu ile ücretsiz boya o ile söndürüldü lipozomlann görüntüleme özelliklerinin karşılaştırılması ve vazgeçilmezdir. Biz lipozomlarda DY-676-COOH söndürme konsantrasyonlarının kapsülleme mümkündür alternatif donma ve çözülme döngüleri ile birlikte basit, ama son derece etkili bir film hidrasyon ve ekstrüzyon protokolü tarafından gösteriyor. Bu tür ters fazlı buharlaştırma yöntemi 23 olarak etanol enjeksiyon metoduna 24 gibi lipozomlar elde etmek için kullanılan diğer yöntemler, bir çok hidrofilik madde için yüksek bir kapsülleme randımanı olan lipozom preparatı sağlamaktadır. Bununla birlikte, maddenin doğası kapsülleme etkinliğini etkileyebilir haline getirilir. Sonuç olarak,Burada sunulan film, hidrasyon ve ekstrüzyon protokolü DY-676-COOH enkapsülasyonunda en yüksek verimi ortaya çıkardı. Birkaç saat içinde iltihap işlemlerinin çalışmasına izin verir DY-676-COOH, bir zimosan kaynaklı ödem modelinde, lipozomal kapsülleme yararlarını göstermek için kullanılmıştır. Burada, bu kapsüllenmiş DY-676-COOH konsantrasyonu yüksek olan lipozomlar, serbest boya ya da düşük boya konsantrasyonları olmayan söndürüldü lipozom formülasyonuna göre ateşli süreçlerin ve in vivo optik görüntüleme bütün vücut için daha uygun olduğu gösterilmiştir. Böylece, alt protokol söndürüldü floresan lipozomlar ve in vitro ve in vivo olarak hem aktivasyonu ve görüntüleme potansiyelinin doğrulama üretmek için hızlı ve basit bir yöntem temin etmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Materials and equipments for preparation of liposomes</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">egg phospahtidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880120P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810145P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)</td>
			<td>Sartorius AG</td>
			<td>Research RC 210 P</td>
			<td>used for weighing the phospholipids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Rotavapor</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-114</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Waterbath</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-481</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacuum Controller</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-720</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacobox</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-177</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Circulation Chiller</td>
			<td style="width:179px;">LAUDA DR. R. WOBSER 
			GMBH &#38; CO. KG</td>
			<td>WKL 230</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DY-676-COOH</td>
			<td>Dyomics GmbH</td>
			<td>676-00</td>
			<td>Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1086</td>
			<td>buffer 10 mM, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichlormethan</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>Y015.2</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>Merck Eurolab GmbH</td>
			<td>USR 170 H</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)</td>
			<td>Scientific Industries Inc.</td>
			<td>SI-0256</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sephadex G25 medium&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Europe GmbH</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td>used for liposome purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X100</td>
			<td>Ferak Berlin GmbH</td>
			<td>505002</td>
			<td>used to destruct liposomes&#160; for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LiposoFast-Basic</td>
			<td>Avestin Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluostar Optima</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the determination of liposome size and zetapotential</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">XL 80</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Rotor</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">SW 55 TI</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:309px;">Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z4250-250MG</td>
			<td>used for induction of inflammation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isotonic Saline (0.9)</td>
			<td style="width:179px;">Fresenius GmbH</td>
			<td style="width:119px;">PZN-2159621</td>
			<td>used for the dilution of Zymosan-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Ohmeda Isotec 4</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for anesthesizing animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane</td>
			<td>Actavis GmbH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PZN-7253744</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Mat Pro 20 W</td>
			<td style="width:179px;">Lucky Reptile</td>
			<td style="width:119px;">61202-HTP-20</td>
			<td>used to keep animals warm during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Omnican-F (1 ml injection)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3115465</td>
			<td>used for subcutaneous and intravenous application of probes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Panthenol eye cream</td>
			<td style="width:179px;">Jenapharm</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3524531</td>
			<td>used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Hanks buffered saline solution</td>
			<td style="width:179px;">PAA Laboratories /Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">L2045</td>
			<td>w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">8-Well chamber slides</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354108</td>
			<td>used for cell culture followed by microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Cell culture flasks</td>
			<td style="width:179px;">Greiner BioOne</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture media</td>
			<td colspan="2">Gibco (life technologies GmbH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-Lysine solution (0,01% - 50&#160;ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4832</td>
			<td>used to coat cell culture chamber slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mountant Permafluor</td>
			<td>ThermoScientific&#160;</td>
			<td>S21022-3</td>
			<td>Mounting solution for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hoechst-33258</td>
			<td style="width:179px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA stain for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hera-Safe</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile work bench used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HERA cell</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Incubator used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">LSM510-Meta</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system</td>
			<td style="width:179px;">CRi, Woburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for whole body fluorescence imaging of small animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of absorption</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)</td>
			<td style="width:179px;">Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of fluorescence emission</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Animals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMRI mice (8-12 weeks old, male)</td>
			<td style="width:179px;">Elevage Janvier, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for inflammation trials</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-quenching of a liposomal-encapsulated near-infrared fluorophore as a tool for in vivo optical imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

lipozomlar, sulu iç Burada kullanılan NIRF boya DY676-COOH gibi floresan boyalar yüksek konsantrasyonlarda kapsülleme floresans yüksek bir seviyeye neden olur. Floresan söndürme, yüksek konsantrasyonda birçok floroforlar görülen bir fenomen, hedef alan bir yüksek hassasiyet ve güvenilir algılama talep edilen in vivo görüntüleme uygulamalarında çeşitli istismar edilebilir. Lipozomların kullanımı, aynı zamanda, in vivo uygulamalar için gerekli olan boya koruma sağlar. L...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging at JoVE.com

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

fluorescence-quenching-liposomal-encapsulated-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

16.1K Görüntüleme.  Jena University Hospital. The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity. 

Video: Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Biyomühendislik

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Hücre Fusion Tespit Cre-ETOX P Rekombinasyon Yaklaşım In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

Doğallığı Kollajen Tellerinin Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kafesli Kollajen Mimetik Peptidlerinin Fotoğraf-tetiklenen Hybridization yoluyla

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Bir Yakın Kızılötesi Photoimmunotherapy Tekniği Karışık 3D Kültür seçici hücre Eliminasyon

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.