This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.

1. Optik Kalibrasyon: Ölçme Işık Çıkışı <ol><li> Işık teslim aparatı hazırlamak için, geniş bant ışık kaynağı bağlamak (örneğin, Xenon veya tungsten lamba) uygun bir güç kaynağına. Işık, birleştirilmiş ışını üretmek için, ışık kaynağının önünde bir kolimatör lensi yerleştirin. Işık demeti gelen ısının çoğunu çıkarmak için bir sıvı ısı filtre içinden ışık geçirir. Uygulamaya bağlı olarak, ışığın daha esnek teslimat (örn., Bir kuluçka makinesi içine) sağlayan bir sıvı ışık kılavuzunun giriş açıklığı, üzerine birleştirilmiş ışın odak. </li><li> Sıvı ışık kılavuzunun diğer ucunda, ikinci bir kolimatör lensi ve daha sonra müdahale ve nötral yoğunluk filtreleri için bir tutucu yerleştirin. Bu düzenleme istenen dalga ve yoğunlukta bir ışık eşit aydınlatılmış nokta üretir olmadığını kontrol edin. Not: Işık rehber ve örnek uçağın sonu arasındaki mesafe bağlı olarak değişebilir gerekebilirIşıklı, ancak gereken alan ışık kılavuzu artar ucundan mesafe olarak, ışık şiddeti azalacak unutmayın. Bu çalışmada, bu mesafe, 14cm ve eşit oranda 96 oyuklu bir plaka üzerinde 3x3 alan iyi aydınlatan bir kiriş kesite üretir. </li><li> Lamba ve ilişkili optik bileşenleri bu sokak ışığı olun numune ulaşmak mümkün. </li><li> Sıvı ısı filtresi su soğutucusu açın ve filtre ceket suyun değişimi olduğundan emin olunuz. Lamba güç kaynağı açın ve stabilize genişbant ışık kaynağı için en az 5 dakika bekleyin. Not: su soğutucu kullanılması cihazın aşırı ısınmasını önlemek için gereklidir. </li><li> Aydınlatma istenen dalga bandını oluşturmak için (genellikle yarım maksimum (FWHM) bant genişliği kendi merkez dalga boyu, tepe geçirgenlik ve tam genişliği tarafından açıklanan) bir dar girişim filtre seçin. Not: Bu çalışmada kullanılan dar girişim filtreleri 4 idi42 nm, 550 nm, 671 nm ve 810 nm. </li><li> Numune tedavi sırasında yerleştirilmiş olan düzlemde lamba tarafından üretilen ışık ölçülür. Üreticinin talimatlarına uygun olarak uygunluk yazılımı kullanılarak, uygun bir spektrorayometrenin bağlı kalibre edilmiş bir ışık şiddeti prob (kosinüs kolektörü) kullanılarak ışık ölçülür. </li><li> İstenilen çıkış elde edilene kadar ışık yoğunluğunu ayarlamak için nötral yoğunluk filtreleri kullanın. Not: Bu çalışmada, her bir girişim filtresi tarafından geçirilen ışığın yoğunluğu dört tedavi dalgaların her birinde eşit quantal çıkış verecek şekilde ayarlanır. Bu lamba çıkışı değişebilir gibi, düzenli kalibrasyon kontrol etmek önemlidir. Not: aparatın set up takiben, hücreler ışıklı hazır 1 çalışmada kullanılan ışık teslim aygıtının bir temsildir.. </li></ol><img alt="Şekil 1,"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52221 / 52221fig1.jpg&quot; /&gt; Işık teslim aparatı. Resimli Şekil 1. Görüntü ışık güç kaynağı, konut, collimating lens, su filtresi, giriş açıklığı, sıvı ışık kılavuzu, ikinci kolimatör lens, filtre tutucu, tedavi çerçevesi ve mat siyah kart ile xenon lamba vardır. Dar dalga boyu ve yoğunluğu filtreleri gösterilmez unutmayın. 2. Hücre Hazırlanması <ol><li> açıklandığı gibi R / NIR LT dağıtım yöntemi, herhangi bir hücre tipi ya da in vitro model sisteminde uygulanabilir; Hücre kültürü, aşağıdaki tanımları, kültür feokromositoma (PC12), Müller (rMC1) ve primer karma retina hücreleri tarafından iyi bilinen teknikler kullanılarak, genel olarak. </li><li> Işık tedavisi ve oksidatif stres tahlilinde hücre ekim önce kültür T75 flas uygun ekler (örn., FBS, antibiyotikler) ihtiva eden ilgili büyüme ortamında hücrelerin ölümsüz% 70-80, birbirine karışana kadar ks. </li><li> Örneğin test edilecek hücre tipi için uygun yöntemi kullanarak, T75 şişelerinden ölümsüzleştirdi hücreleri ayırmak., Tripsin. Gerekirse, 96 oyuklu tahlil plâkalarında hücrelerin tohumlama ile devam etmeden önce, kaplama bir deney plakası (PC 12 hücreleri için, örneğin.) 1 saat için 10 ug / mL poli-L-lizin ile kuyu veya 10 ug / ml poli-L-lizin için 10 ug olan bir O / N inkübasyon, ardından 1 saat / mL, laminin (ör., karışık retina hücreleri için). </li><li> Santrifüj hücreleri (örn., PC12 hücreleri için 405 x g ya da rMC1 hücreleri için 218 x g&#39;de 10 dakika sonra 3 dakika) uygun toplamak için, uygun hücre kültür ortamı içinde 8 ml supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> Karışık retinal hücreler kullanılacak ise, tespit edilmiş işlemler 19&#39;a göre enzimatik sindirme (papain) ile P0-5 yenidoğan sıçan yavrularından hazırlanması </li><li> Bir hemositometre kullanılarak,% 0.4 (a / h), tripan mavi boya hariç canlı hücre sayısı. </li><li> Hücre yoğunluğu suc ayarlamaHücreler, kültür içinde 24 ya da 48 saat sonra yaklaşık olarak% 70-80 konfluent olacak s. (PC 12 hücreleri için tohum yoğunluğu rMC1 hücreleri için, bu, 2.5 x 10 5 canlı hücre / ml ve karışık retina hücreleri için 8 x 10 5 canlı hücre / ml, 4.0 x 10 5 canlı hücre / ml). Hücreleri ilave edildikten sonra ya da uygun bir büyüme ortamı, 100 ul, (H2O 2 veya DCFH-DA deneyi için sırasıyla kullanılır) açık ya da siyah 96 oyuklu plakalar, plaka 37 ° C&#39;de, 5 düz bir yüzey üzerinde oturmasına olanak sağlamak için % CO2 hücre yapışmasını sağlamak için en az 24 saat boyunca (ya da koşullar, belirli bir hücre tipi için uygun). </li><li> Uygun 96 gözlü tepsiler içinde büyüme ortamı içinde kültür hücreleri% 70-80 konfluent (PC12 ve rMC1 hücreleri için 24 saat karıştırılmış retina hücreleri için 48 saat) kadar. </li></ol> 3. Hücreleri Glutamat stresördür ekleme <ol><li> Uygun tam yetişmektedir 0-10mM L-glutamik asit monosodyum tuzu, hidratı stres konsantrasyonları hazırlamakinci kültür ortamı. </li><li> Hücrelerden ortamı çıkarın ve yavaşça PBS (PC12) veya HBSS (rMC1 ve karışık retina hücreleri) ile hücreler 3 kez yıkayın. Yıkamadan sonra, / göz 100 ul toplam hacmine glutamat içeren ortamı eklenir. </li></ol> Işık Tedavi 4. İlk dozları <ol><li> Hemen glutamat ya da tercih edilen stres eklenmesi ile hazırlanan ışık verme cihazının altına yerleştirilerek, istenen dalga boylarında ve yoğunluklarda ışık tedavisi hücrelerin maruz kalmaktadır. Dalga boyuna bağlı olarak nötral yoğunluk filtreleri kurulan kombinasyonları kullanılarak ışık demetinin quantal çıkışını yönetilen değiştirmek emin olun. Not: Mevcut deneylerde, 3 dakika boyunca ışık tedavisi hücreleri maruz 37 o C ısı yastığı 96 kuyu plakaları dinlenme sıcaklığını korumak. Gerekli tedavi süresi değişebilir. <ol><li> 96-wel bitişik kuyulara yansıtan ışık önlemek için hücrelerin altında bir mat siyah kart yerleştirinl tepsisi diğer tedavi parametreleri için belirlenen. </li></ol></li><li> Tedavi süresi, daha uzun için arzu edildiği takdirde, uygun olan ya da koşulları hücre kültür ortamının pH&#39;ının muhafaza edilmesi ya da, ideal olarak% 5 CO2 ayarlandı CO2 konsantrasyonuna sahip bir kuluçka makinesi içinde cihaz ve tedavi plakaları yerleştirmek için 25 mM Hepes tampon eklemek özel bir hücre tipi için. </li><li> Işık tedavisi tamamlandıktan sonra, düz bir yüzeye yerleştirin ve hücreleri 37 ° C ve% 5 CO 2 inkübe 24 saat için (ya da koşullar ne olursa olsun hücre tipi için en uygun). Not: Yukarıda tarif edildiği gibi, istenen R / NIR LT ek dozlar uygulanabilir. </li></ol> ROS Işık Tedavi ve Algılama 5. Nihai Doz <ol><li> Işık tedavisi son turu yapmadan önce, reaktifler ROS tespiti için kullanılacak hazırlamak. 2 O 2 algılama reaktif çalışma 50mM sitrat tamponu (pH 6.0), Triton X100 ve H hazırlayınçözeltisi (1: 2: 10 mM H2O 2 saptama reaktif maddesi stok çözeltisi 97 oranı, 10 U / ml yaban turpu peroksidaz, 50 mM soyum sitrat (pH 6.0)). Uygun bir ortamda 100uM nihai konsantrasyon DCFH-DA hazırlayın. Not: PC 12 hücreleri için DCFH-DA reaktif RPMI ortamı içinde olan, rMC1 hücreleri için DCFH-DA reaktif DMEM ortamı. Piyasada mevcut algılama reaktifleri özel ROS diferansiyel hassasiyetleri var ve reaktifler bir bireysel başvuru için istenen bilgileri temin etmek dikkatle seçilmelidir unutmayın. </li><li> Aşama 4.1-4.1.2 tarif edildiği gibi, hücrelere ışık tedavisi uygulayın. Emin olun hücreler ışık istenen etkilenirler / dalga boyları ile tedavi ediliyor. </li><li> Hemen glutamat içeren ortamını çıkarın ve uygun tampon çözeltisi ile iki kez yıkanır, ışık tedavisi aşağıdaki gibidir (PC 12 hücreleri için, PBS kullanılır ve rMC1 hücreleri için, HBSS kullanılır). Aşağıdaki gibi hücreler üzerinde ROS tahlilleri gerçekleştirin: <ol><li> H2O 2 </sub&gt; deneyi: kuyuların herbirine 50 mM sitrat tampon maddesi (pH 6.0) ve 5 ul Triton X100, 45 ul ekle. Yavaşça, 30 saniye için bir orbital çalkalayıcıda hücreler, çalkalama 15 dakika boyunca CO2 37 ° C&#39;de inkübe etmek ve% 5. H 50 ul H2O 2 algılama çalışma çözeltisi eklenir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. 530nm bir eksitasyon dalga boyu ve 480nm emisyon dalga boyu olan bir plaka okuyucusu kullanılarak floresan ölçülür. </li><li> DCF deneyi: bölümlerinin her birine DCFH-DA, 100 uM çözeltisi 100 ul ve 37 ° C&#39;de 30 dakika% 5 CO2 inkübe edilir. 100 uM DCFH-DA içeren Ortamı çıkarın ve (yukarıda anlatıldığı gibi) iki kez uygun bir tampon çözeltisi ile yıkanır. Kuyusunun herbirine, tampon çözeltisi ve 10 ul Triton X100, 90 ul ekleyin ve yavaşça 37 ° C&#39;de 30 saniye 15 önce dakika kuluçkalama için bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. 480nm bir eksitasyon dalga boyu ve emisyon Wavel bir plaka okuyucusu kullanılarak DCF edilen floresan ölçülür530nm ve ength. </li><li> Hızlı ROS mg protein hesaplamak için standart bir eğri değini ile, üreticinin talimatlarına uygun olarak protein konsantrasyonunu belirlemek için kolorimetrik bir kit kullanılarak, oyuklarda kalan hücrelerin protein konsantrasyonu ile ilgili değerler. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+reactive+oxygen+species+an+evolution+in+function.">Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function.</a> Circulation research. 97, 302-304 (2005).</li><li>Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+Ca2++signaling.">Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).</li><li>Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondria and reactive oxygen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).</li><li>Coyle, J. T., Puttfarcken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+glutamate,+and+neurodegenerative+disorders.">Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders.</a> Science. 262, 689-695 (1993).</li><li>Doble, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+excitotoxicity+in+neurodegenerative+disease:+implications+for+therapy.">The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy.</a> Pharmacology &amp; therapeutics. 81, 163-221 (1999).</li><li>Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+therapies+for+acute+spinal+cord+injury.">Antioxidant therapies for acute spinal cord injury.</a> Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+spinal+cord+injury+and+antioxidant-based+intervention.">Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention.</a> Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).</li><li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red/near-infrared+irradiation+therapy+for+treatment+of+central+nervous+system+injuries+and+disorders.">Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders.</a> Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).</li><li>Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=670-nm+light+treatment+reduces+complement+propagation+following+retinal+degeneration.">670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration.</a> J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).</li><li>Eells, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+photobiomodulation+for+methanol-induced+retinal+toxicity.">Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).</li><li>Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+670+nm+light+up+regulates+cytochrome+C+oxidase+expression+and+reduces+inflammation+in+an+age-related+macular+degeneration+model.">Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model.</a> PloS one. 8, e57828 (2013).</li><li>Byrnes, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+promotes+regeneration+and+functional+recovery+and+alters+the+immune+response+after+spinal+cord+injury.">Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury.</a> Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).</li><li>Liang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiomodulation+partially+rescues+visual+cortical+neurons+from+cyanide-induced+apoptosis.">Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis.</a> Neuroscience. 139, 639-649 (2006).</li><li>Zivin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+safety+of+transcranial+laser+therapy+for+acute+ischemic+stroke.">Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke.</a> Stroke. 40, 1359-1364 (2009).</li><li>Lapchak, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+near-infrared+laser+therapy+applied+to+promote+clinical+recovery+in+acute+and+chronic+neurodegenerative+diseases.">Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases.</a> Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuts+and+bolts+of+low-level+laser+(light)+therapy.">The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy.</a> Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Level+Laser+Therapy+for+Closed-Head+Traumatic+Brain+Injury+in+Mice:+Effect+of+Different+Wavelengths.">Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths.</a> Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).</li><li>Hashmi, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+low-level+laser+therapy+in+neurorehabilitation.">Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation.</a> PM&amp;R. 2, S292-S305 (2010).</li><li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein-IIA+promotes+neurite+growth+via+the+megalin+receptor.">Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor.</a> Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).</li><li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+infrared+light+reduces+oxidative+stress+and+preserves+function+in+CNS+tissue+vulnerable+to+secondary+degeneration+following+partial+transection+of+the+optic+nerve.">Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve.</a> Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).</li><li>Ando, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-level+laser+therapy+for+spinal+cord+injury+in+rats:+effects+of+polarization.">Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization.</a> Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).</li><li>Lanzafame, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocity+of+exposure+time+and+irradiance+on+energy+density+during+photoradiation+on+wound+healing+in+a+murine+pressure+ulcer+model.">Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model.</a> Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).</li><li>Castano, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-level+laser+therapy+for+zymosan+induced+arthritis+in+rats:+Importance+of+illumination+time.">Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time.</a> Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Biz başarıyla R / NIR-LT in vitro optimizasyonu çalışması için bir mekanizma sağlamak için kesin ve kalibre ışık iletim sistemini adapte var. R Dalgaboyu ve yoğunluk parametreleri / NUR-LT, bu sistemi kullanarak doğru ve etkili bir şekilde manipüle edilmesi mümkün bulunmaktadır. ROS test edilen hücre tiplerinde, Verilen dalga boylarında ve dozajlarda düşük değil, ancak biz, hücre ölümüne yol açmamıştır hücrelerininkine ışık tedavisi kurulmuştur. 670nm (20.11W / m 2)</s...

Reaktif oksijen türleri (ROS) sinyal transdüksiyon yollar ve nöro-1 de dahil olmak üzere, hücresel metabolizmanın normal reaksiyonlar, bir dizi gereklidir. Endojen antioksidan mekanizma ROS üretimini kontrol edemiyoruz Ancak, hücreler oksidatif strese 2,3 yenik düşebilir. MSS yaralanma sonrasında, ROS ve oksidatif stres varlığında ilişkili artışlar hasar 4,5 ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Değerlendirilmiştir oksidatif stres zayıflatmaya yönelik stratejiler geniş olmasına rağmen, nörotravma 6 aşağıdaki klinik kullanımda ROS üretimini ve ilişkili oksidatif stresi zayıflatmaya yönelik hiçbir tamamen etkili, klinik açıdan önemli bir anti-oksidan stratejileri şu anda. Bu nedenle oksidatif stres zayıflama terapötik müdahale 7 için önemli bir hedef olmaya devam etmektedir. İyileştirmeler takiping R / NIR LT yaralanmalar ve belki de oksidatif stres azaltarak miyokard enfarktüs boyutu, diyabet renal ve hepatik komplikasyonlar, retinal dejenerasyon, merkezi sinir sistemi hasarı ve inme 8 azalmalar da dahil olmak üzere geniş bir hastalık aralığında bildirilmiştir. MSS yaralanması, özellikle ilgili olarak, 670nm ışık etkinliğinin klinik öncesi çalışmalar, retinal dejenerasyon 9-11, omurilik yaralanması, 12 nöronal ölüm 13 modellerinde iyi etki gözlemlenmemiştir. Klinik çalışmalar, ancak bu çalışmaların sonuçları 15 parametreleri etkin tedavi istihdam belki de bir arıza, umut verici görünmüyor, bağlı makula dejeneresansı kuru yaş için yapılan ve inme 14 şu anda devam etmektedir edilmiştir. Gibi, R / NIR-LT yaygın bir non-invaziv, yönetmek kolay ve nispeten ucuz bir tedavi olmasına rağmen, nörotravmada normal klinik pratikte bir parçası olarak kabul edilmemiştir. Klinik çeviri Engeller bir cl eksikliği,Erken bir standart etkili tedavi protokolü 16,17 eylem ve yokluğu mekanizmasını anladım. Işık tedavisi ile ilgili güncel literatür ışınlama kaynaklarına göre (LED veya lazer), dalga boyu (örneğin, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), ışınlama toplam dozu (joule / tedavi parametrelerinin varyasyon bir bolluk ortaya birim alan), süresi (maruz kalma süresi), zamanlama (öncesi veya sonrası hakaret), tedavi sıklığı ve doğum şekli () darbeli veya sürekli 8. çalışmalar arasında tedavi parametreleri değişkenlik karşılaştırma zorlaştırır ve etkinliği 16 ilişkin şüphecilik katkıda bulunmuştur. Bu nedenle, R / NIR-LT optimizasyonu açıkça birden değişkenleri karşılaştırmak için gerekli yüksek verimli tarama mekanizması sağlamak mümkün hücre kültürü sistemleri, gereklidir. Ancak wa üzerinde yeterli esneklik ve kontrol sağlayabilir birkaç piyasada mevcut aydınlatma sistemleri vardırvelength ve yoğunluğu gibi optimizasyon deneyleri gerçekleştirmek için. Ticari olarak temin edilebilen cihazlar genel olarak ışık yoğunluğu, sadece farklı olabilir, farklı üreticiler tarafından birden çok LED elemanları içeren araştırmacılar olarak elde edilen çoklu dalga ya da yoğunlukları, teslim etmek mümkün değil, aynı zamanda yayılan ışığın dalga boyu spektrumu değildir. Biz böylece R / NIR-LT parametrelerinin yakın, doğru kontrol sağlayan, dalga boyu ve ışık akıcılıklarda bir dizi üreten, dar girişim filtreleri ile filtre geniş bant Xenon ışık kaynağı kullanılarak bu konuya değindik. Bu tedavinin terapötik doz R / NIR LT durumunda sitokrom C oksidaz (COX) 18 olduğu kabul edilmektedir, photoacceptor (kromofor) ile etkileşim fotonların sayısı ile tanımlanır dikkat etmek önemlidir. Teslim foton enerjisi dalga boyu ile değişir; farklı dalga boylarında enerji eşit dozlarda anlam com olacakfotonların farklı sayılar ödüllü. Bu nedenle, cihazdan çıkan ışık, test edilecek seçilmiş dalga boylarının her biri için bir foton eşit sayıda yaymak üzere kalibre edilmiştir. Biz in vitro hücrelere dalga boyu ve yoğunlukları aralığında R / NIR-LT sunmak için kullanılabilecek bir sistem geliştirildi ve tabi hücrelerde ROS üretimi üzerinde teslim R / NIR-LT etkilerini ölçmek yeteneği göstermiştir glutamat stres.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>STA-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed Reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Watt Xenon Arc Lamp</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>6258</td>
			<td>Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB4000-FL Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#956;m diameter quartz fibre optic</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraSuite Spectroscopy Platform</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2300 EnSpire Multimode Plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Acute toxicity, wear gloves when handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142-47-2 (anhydrous)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-2522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinal Muller (rMC1) cells</td>
			<td>University of California, San Diego</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75cm2 Flasks</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>B4-BE-353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-134</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>165U Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well plates, clear bottom, black</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07-200-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>Standard lab epuipment</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Standard lab epuipment</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Density Filter Paper (0.3)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>442nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FL441.6-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>550nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB550-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>670nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB670-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>810nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB810-10e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE02B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE03B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE05B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE06B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE10B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for the assessment of effects of a range of wavelengths and intensities of red/near-infrared light therapy on oxidative stress in vitro

Lazer veya ışık yayan diyot (LED) tarafından teslim Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık tedavisi (R / NIR-LT), muhtemelen oksidatif stresi azaltarak in vivo merkezi sinir sistemi yaralanmaları, bir dizi fonksiyonel ve morfolojik sonuçlar geliştirir. Bununla birlikte, oksidatif stres R / NIR LT etkileri dalga boyu ya da ışının yoğunluğuna bağlı olarak değişecektir gösterilmiştir. Tedavi parametreleri karşılaştıran çalışmalar nedeniyle vitro optimizasyon çalışmalarında koymak yoluyla yüksek uygun çoklu dalga boylarını veya yoğunluklarını, teslim piyasada mevcut cihazların olmaması nedeniyle, eksiktir. Bu protokol belirli bir yaralanma modeli için gerekli olan terapötik dozları optimize etmek için dalga boyu ve yoğunluk aralığında ışık iletimi için bir yöntem açıklanır. Bu dalga boyu ve yoğunluk parametreleri kolayca değiştirilebilir hangi ışık sağlamaya yarayan bir yöntem olup, reaktif oksijen türleri azaltmak için Ar / NIR LT optimal dozunun belirlenmesini kolaylaştırmak ileri sürdülerIn vitro (ROS). Düzensiz Xenon lambası değişen dalga boylarında (440, 550, 670 merkezi dalga boylarının ve 810nm) ve akızamanları sağlamak için dar bantlı girişim filtreleri içinden süzülmüş (8.5 x 10 -3 3.8 x 10 -1 J / cm2) ışık kültür hücreleri. Aygıtından Işık çıkışı, her dalga boyunda ışık, terapötik anlamda ilgili, eşit quantal doz yayılmasını sağlamak için kalibre edilmiştir. Glutamat DCFH-DA ve H2O 2 duyarlı fluoresan boyalar kullanılarak ışık ile muamele edilmiş hücreler stresli reaktif türleri tespit edilmiştir. Başarıyla MSS yaralanması modeli olarak glutamata maruz kültür hücreleri, ilgili dalga boylarında ve yoğunlukları, fizyolojik ve terapötik bir aralığında ışık vermiştir. Kültürlenmiş hücreler tarafından üretilen ROS üzerinde bir etki gösterebilir değil mevcut çalışmada kullanılan R / NIR LT akıcılıklarda birlikte, ışık uygulama yöntemi için diğer syst için geçerlidirems daha fizyolojik mitokondri veya ilgili organotipik dilim kültür modelleri izole dahil, ve oksidatif metabolizma sonucu önlemlerinin bir dizi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

670nm bir dalga boyunda, iletilen ışığın, önceden in vivo üretimi (0.3 J / cm2), 20 olarak yararlı olduğu gösterilmiştir 670nm ışık dozu kapsayan akıcılıklarda bir dizi hücre ışın tedavisi amacıyla nötr yoğunluk filtreleri kullanılarak kalibre edilmiştir. Artan ışık kaynağının önünde nötral yoğunluk filtreleri sayısı arttıkça, yoğunluk (W / m 2) daha az ışık hedef alana geçmek için izin düşmüştür. Tablo 1, bir dalga boyu filtre ta...

Watch this Scientific Journal Video about Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro at JoVE.com

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Dalga boyundaki ve Oksidatif Stres Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık Terapisi şiddetler bir Range Etkilerinin Değerlendirilmesi için Yöntemi<em&gt; İn Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

method-for-assessment-effects-range-wavelengths-intensities-rednear

Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

8.6K Görüntüleme.  The University of Western Australia. Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Video: Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biyoloji

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 oyuklu mikrotiter plakalarında

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

3D-FRAP Mikroskopisi ile Gap Birleşimine Bağlı MiRNA Transferinin Analizi

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

Bakteriyosin Etkilerini Farenin Bağırsak Mikrobiyolojisi Üzerine Etkileyen Bir Yöntem

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Zararlı etkileri, düşük basınç plazma sterilizasyon Bacillus subtilis sporlar kullanarak canlı cep mikroskobu sağkalıma soruşturma

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...