This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.

1. כיול אופטי: מדידת תפוקת אור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את מנגנון מסירת האור, להתחבר למקור אור בפס רחב (למשל, קסנון או מנורת טונגסטן) לאספקת חשמל מתאימה. מקם עדשת collimating מול מקור האור כדי לייצר קרן collimated של אור. להעביר את האור דרך מסנן חום נוזלי כדי להסיר ביותר של החום מקרן האור. בהתאם ליישום, למקד את אלומת collimated על צמצם הכניסה של מדריך אור נוזלי, אשר מספק למסירה גמישה יותר של האור (לדוגמא., לחממה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצה השני של ספר אור הנוזלי, למקם את העדשה שנייה collimating ולאחר מכן בעל להפרעות ומסנני צפיפות ניטראליים. בדוק שהסדר זה מייצר מקום מואר באופן שווה של אור של תחום הגלים ועוצמה הרצויים. הערה: המרחק בין סוף ספר האור ומטוס הדגימה ייתכן שיהיה צורך להשתנות בהתאם להאזור זה חייב להיות מואר, אך יש לזכור כי ככל שהמרחק מהקצה של עליות מדריך אור, עוצמת אור תקטן. במחקר הנוכחי, מרחק זה הוא 14cm ומייצר חתך קורה שבאופן שווה מאיר אזור היטב 3x3 על צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שאור תועה מהמנורה והרכיבים אופטיים הקשורים הוא לא הצליח להגיע לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מתקן המים הקרים למסנן החום הנוזלי ולהבטיח שיש חילופי מים דרך מסנן המעיל. הפעל את מקור כוח המנורה ולחכות לפחות 5 דקות למקור אור בפס רחב לייצוב. הערה: השימוש במים הקריר נדרש כדי למנוע חימום יתר של המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מסנן התערבות צר (בדרך כלל שתואר על ידי אורך הגל שלהם המרכז, העברת שיא ורוחב חצי מקסימום רוחב פס (FWHM)) על מנת ליצור את תחום הגלים הרצויים של תאורה. הערה: מסנני ההתערבות צר ששמשו במחקר הנוכחי היו 442 ננומטר, 550 ננומטר, 671 ננומטר ו810 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את האור המיוצר על ידי המנורה במטוס שבו הדגימה היא להיות ממוקמת במהלך טיפול. למדוד אור באמצעות בדיקה מכוילת irradiance (אספן קוסינוס) מחוברת לspectroradiometer מתאים, באמצעות תוכנת תקינות לפי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במסנני צפיפות ניטראליים כדי להתאים את עוצמת האור עד התפוקה הרצויה מתקבלת. הערה: במחקר הנוכחי, את עוצמת האור שנתקבל בכל מסנן התערבות מותאמת לתת תפוקת quantal שווה בכל אחד מארבעת תחומי תדרי הטיפול. חשוב לבדוק את הכיול באופן קבוע, כפלט המנורה עשוי להשתנות. הערה: בעקבות ההגדרה של המנגנון, התאים מוכנים להיות מואר איור 1 הוא ייצוג של מנגנון אספקת האור השתמש במחקר הנוכחי.. </li></ol><img alt="איור 1"src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,221 / 52221fig1.jpg&quot; /&gt; תמונת איור 1. של מנגנון משלוח האור. אילוסטרייטד היא מקור כוח האור, מנורת קסנון עם דיור, עדשת collimating, מסנן מים, צמצם כניסה, מדריך אור נוזלי, עדשת collimating שנייה, בעל מסנן, מסגרת טיפול ושחור כרטיס מט. שים לב כי מסנני אורך הגל ועוצמת צרי אינם מוצגים. 2. תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטת ההצגה המתוארת R / NIR-LT יכולה להיות מיושמת על כל סוג תא או במערכת מודל חוץ גופית; כתיאורים של תרבית תאים כגון הבאים הם כלליים, תוך שימוש בטכניקות מבוססות היטב לpheochromocytoma התרבות (PC12), Müller (rMC1) ותאי רשתית מעורבים עיקריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני זריעת תאים לטיפול באור וassay סטרס חמצונים, התרבות הנציחה תאים בתקשורת הצמיחה שלהם המכילות תוספים מתאימים (לדוגמא., FBS, אנטיביוטיקה) בflas T75ks עד מחוברות 70-80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים הונצחו מצלוחיות T75, תוך שימוש בשיטה מתאימה לסוג התא להיבדק למשל., טריפסין. אם יש צורך, לפני שתמשיך עם הזריעה של תאים ב96-גם צלחות assay, בארות צלחת assay המעיל עם 10μg / poly-L ליזין מיליליטר עבור 1h (למשל., לתאי PC12) או 10μg poly-L ליזין / מ&quot;ל ל 1H ואחריו O / דגירה N עם 10μg / ml laminin (למשל., לתאי רשתית מעורבים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה כדי לאסוף מתאימים כ( למשל., 3 דק &#39;ב 405 XG לתאי PC12 או 10 דקות ב 218 XG לתאי rMC1), להסיר את supernatant וגלול ב8 מיליליטר של תקשורת בתרבות התא המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תאים ברשתית מעורב הם לשמש, להכין מגורי חולדה ילוד P0-5 על ידי עיכול אנזימטי (פפאין) על פי נהלים שנקבעו 19 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר תאי קיימא בניכוי 0.4% (w / v) צבע כחול trypan, באמצעות haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם suc צפיפות תאיםh כי תאים יהיו כ 70-80% ומחוברות לאחר 24 או 48 שעות בתרבות. (לתאי PC12 צפיפות הזריעה היא 4.0 x 10 5 תאים / מיליליטר קיימא, לתאי rMC1, זה 2.5 x 10 5 תאי קיימא / מיליליטר ולתאי רשתית מעורבים זה 8 x 10 5 תאים / מיליליטר קיימא). לאחר הוספת תאים לאו 96-גם צלחות ברורות או שחורות (המשמשות לH 2 O 2 או assay DCFH-DA בהתאמה), בתקשורת של צמיחה המתאימה 100 μl, לאפשר צלחת לשבת על משטח שטוח על 37 מעלות צלזיוס, 5 % CO 2 (או מה תנאים מתאימים לסוג תא המסוים) לפחות 24 שעות כדי לאפשר לדבקות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים בתקשורת צמיחה במגשי 96 גם המתאימים עד שהם ומחוברות 70-80% (24 שעות לPC12 ותאי rMC1, 48h לתאי רשתית מעורבים). </li></ol> 3. הוספת גלוטמט לחץ לתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריכוזי לחץ מימה מלח L-גלוטמית מונוסודיום החומצה של 0-10mM בgrow המלא המתאיםתקשורת ותרבות ה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהתאים ולשטוף בעדינות תאים 3 פעמים עם PBS (PC12) או HBSS (rMC1 ותאי רשתית מעורבים). לאחר שטיפה, להוסיף מדיה המכיל גלוטמט להיקף כולל של 100 μl / טוב. </li></ol> 4. ראשית מינונים של טיפול אור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד עם תוספת של גלוטמט או הלחץ של בחירה, חושף את התאים לטיפול באור באורכי הגל והעוצמות הרצויים על ידי הצבת תחת מנגנון אספקת האור מוכן. הקפד לשנות את פלט quantal של קרן האור באמצעות שילובים הוקמו במסנני צפיפות ניטראליים בהתאם לאורך הגל להיות מנוהלת. הערה: בניסויים הנוכחיים, חושף את התאים לטיפול באור 3 דקות לשמור על הטמפרטורה על ידי נח 96 הצלחות גם על משטח חום C 37 o. זמן טיפול עשוי להיות מגוון, כנדרש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שחור מט כרטיס מתחת לתאים כדי למנוע אור המשקף לבארות סמוכות ב96-welמגש l מיועד לפרמטרים טיפול אחרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הטיפול הוא רצוי לאורכי זמן ארוכים יותר, להוסיף למאגר 25mm Hepes לשמור pH של התקשורת בתרבות תא או באופן אידיאלי, במקום צלחות המנגנון וטיפול בתוך חממה עם ריכוז CO 2 המוסדרים עד 5% CO 2, או תנאים שהם אופטימליים לסוג תא המסוים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת הטיפול באור, למקם את התאים על משטח ישר ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (או מה תנאים אופטימליים לסוג התא) ל24h. הערה: מינונים נוספים של R / NIR-LT יכולים להינתן כמתואר לעיל, כרצונכם. </li></ol> 5. סופי מינון של אור טיפול ואיתור של ROS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע הסיבוב של טיפול באור האחרון, להכין את חומרים כימיים שישמשו לזיהוי ROS. הכן חיץ 50mm ציטרט (pH6.0), טריטון X100, וH 2 O 2 מגיב זיהוי עובדפתרון (1: 2: 97 יחס של 2 O 2 פתרון מניות מגיב זיהוי 10mm H; 10 U / peroxidase חזרת מיליליטר; נתרן ציטרט 50mm (pH 6.0)). הכן DCFH-DA בריכוז סופי של 100μM בתקשורת מתאימה. הערה: מגיב DCFH-DA לתאי PC12 הוא בתקשורת RPMI, מגיב DCFH-DA לתאי rMC1 הוא בתקשורת DMEM. שים לב שיש לי ריאגנטים זיהוי זמינים מסחרי רגישויות ההפרש לROS הספציפי ויש לבחור ריאגנטים בקפידה כדי לספק את המידע מבוקש עבור יישום בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל טיפול באור לתאים, כמתואר בשלב 4.1-4.1.2. מטופלים להבטיח את התאים עם fluences / אורכי הגל הרצויים של אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר טיפול באור, להסיר את המדיה המכיל גלוטמט ולשטוף פעמיים עם פתרון חיץ מתאים (לתאי PC12, PBS משמש ולתאי rMC1, HBSS משמש). לבצע את מבחני ROS בתאים באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H 2 O 2 </sub&gt; assay: להוסיף 45 μl של חיץ 50mm ציטרט (pH 6.0) ו -5 μl טריטון X100 לכל אחד מהבארות. נער בעדינות את התאים בייקר מסלולית למשך 30 שניות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 במשך 15 דקות. הוסף 50 μl של H 2 O 2 פתרון עובד איתור ודגירה של 30 דקות ב RT. למדוד הקרינה באמצעות קורא צלחת עם גל עירור של 530nm ואורך גל פליטה של ​​480nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay DCF: להוסיף משל DCFH-DA הפתרון 100 מיקרומטר לכל אחד מהבארות 100 μl ו דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הסר את המדיה המכילה 100 מיקרומטר DCFH-DA ולשטוף עם פתרון חיץ מתאים (כמתואר לעיל) פעמיים. להוסיף 90 μl של פתרון חיץ ו -10 μl טריטון X100 לכל אחד מהבארות ובעדינות לנער על שייקר מסלולית למשך 30 שניות לפני 15 דקות דגירה על 37 מעלות צלזיוס. למדוד הקרינה נגזרה DCF באמצעות קורא צלחת עם גל עירור של 480nm וwavel פליטהength של 530nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Express ROS ערכים ביחס לריכוז החלבון של תאים שנותרו בבארות, באמצעות ערכת colorimetric לכמת ריכוז חלבון על פי הוראות יצרן, תוך התייחסות לעקומה סטנדרטית לחישוב חלבון מ&quot;ג. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+reactive+oxygen+species+an+evolution+in+function.">Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function.</a> Circulation research. 97, 302-304 (2005).</li><li>Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+Ca2++signaling.">Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).</li><li>Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondria and reactive oxygen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).</li><li>Coyle, J. T., Puttfarcken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+glutamate,+and+neurodegenerative+disorders.">Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders.</a> Science. 262, 689-695 (1993).</li><li>Doble, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+excitotoxicity+in+neurodegenerative+disease:+implications+for+therapy.">The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy.</a> Pharmacology &amp; therapeutics. 81, 163-221 (1999).</li><li>Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+therapies+for+acute+spinal+cord+injury.">Antioxidant therapies for acute spinal cord injury.</a> Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+spinal+cord+injury+and+antioxidant-based+intervention.">Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention.</a> Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).</li><li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red/near-infrared+irradiation+therapy+for+treatment+of+central+nervous+system+injuries+and+disorders.">Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders.</a> Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).</li><li>Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=670-nm+light+treatment+reduces+complement+propagation+following+retinal+degeneration.">670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration.</a> J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).</li><li>Eells, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+photobiomodulation+for+methanol-induced+retinal+toxicity.">Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).</li><li>Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+670+nm+light+up+regulates+cytochrome+C+oxidase+expression+and+reduces+inflammation+in+an+age-related+macular+degeneration+model.">Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model.</a> PloS one. 8, e57828 (2013).</li><li>Byrnes, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+promotes+regeneration+and+functional+recovery+and+alters+the+immune+response+after+spinal+cord+injury.">Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury.</a> Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).</li><li>Liang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiomodulation+partially+rescues+visual+cortical+neurons+from+cyanide-induced+apoptosis.">Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis.</a> Neuroscience. 139, 639-649 (2006).</li><li>Zivin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+safety+of+transcranial+laser+therapy+for+acute+ischemic+stroke.">Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke.</a> Stroke. 40, 1359-1364 (2009).</li><li>Lapchak, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+near-infrared+laser+therapy+applied+to+promote+clinical+recovery+in+acute+and+chronic+neurodegenerative+diseases.">Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases.</a> Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuts+and+bolts+of+low-level+laser+(light)+therapy.">The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy.</a> Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Level+Laser+Therapy+for+Closed-Head+Traumatic+Brain+Injury+in+Mice:+Effect+of+Different+Wavelengths.">Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths.</a> Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).</li><li>Hashmi, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+low-level+laser+therapy+in+neurorehabilitation.">Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation.</a> PM&amp;R. 2, S292-S305 (2010).</li><li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein-IIA+promotes+neurite+growth+via+the+megalin+receptor.">Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor.</a> Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).</li><li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+infrared+light+reduces+oxidative+stress+and+preserves+function+in+CNS+tissue+vulnerable+to+secondary+degeneration+following+partial+transection+of+the+optic+nerve.">Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve.</a> Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).</li><li>Ando, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-level+laser+therapy+for+spinal+cord+injury+in+rats:+effects+of+polarization.">Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization.</a> Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).</li><li>Lanzafame, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocity+of+exposure+time+and+irradiance+on+energy+density+during+photoradiation+on+wound+healing+in+a+murine+pressure+ulcer+model.">Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model.</a> Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).</li><li>Castano, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-level+laser+therapy+for+zymosan+induced+arthritis+in+rats:+Importance+of+illumination+time.">Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time.</a> Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

יש לנו להתאים בהצלחה מערכת אספקת האור מדויקת ומכוילת לספק מנגנון למחקר של אופטימיזציה של R / NIR-LT במבחנה. פרמטרים אורך גל ועוצמת R / NIR-LT מסוגלים לטפל בצורה מדויקת ויעיל באמצעות מערכת זו. אנחנו קבענו כי טיפול באור של התאים לא הובילו למוות של תאים, אם כי ROS לא הוקטן באו?...

מיני חמצן מגיבים (ROS) נדרשים למגוון רחב של מסלולי העברת אותות ותגובות נורמליות של חילוף חומרים תאיים, כוללים אלה של neuroprotection 1. עם זאת, כאשר המנגנון נוגד חמצון אנדוגני אינו מסוגלים לשלוט בייצור של ROS, תאים עשויים להיכנע ללחץ חמצוני 2,3. בעקבות פגיעה במערכת העצבים המרכזי, העליות הקשורות בנוכחות של ROS וסטרס חמצונים הם חשבו לשחק תפקיד משמעותי בהתקדמות נזק 4,5. למרות המספר הרב של אסטרטגיות להחלשת לחץ חמצוני שכבר העריך, אין כיום, אסטרטגיות נוגדת חמצון רלוונטיים קליני יעילות לחלוטין להחלשת ייצור ROS וסטרס החמצונים הקשורים בשימוש קליני הבא neurotrauma 6. לכן הנחתה של סטרס חמצונים נשארה מטרה חשובה להתערבות טיפולית 7. שיפורי מעקבR ing / NIR-LT כבר דיווח במגוון רחב של פציעות ומחלות, כולל הפחתה בגודל Cardial אוטם, סיבוכי כליות וכבדים בסוכרת, ניוון רשתית, פגיעה במערכת העצבים המרכזית ושבץ 8, אולי על ידי הפחתת לחץ חמצוני. בהתייחס בפרט לפגיעה במערכת העצבים המרכזית, מחקרים פרה-קליניים של יעילות של 670nm אור הראו השפעות טובות במודלים של ניוון רשתית 9-11, פגיעה בחוט השדרה 12, מוות עצבי 13. ניסויים קליניים שנערכו לגיל יבש הקשורים ניוון מקולרים והם מתנהלים כיום לשבץ 14, אולם התוצאות של ניסויים אלה אינם מופיעים מבטיחות, אולי בשל כשל להעסיק טיפול יעיל פרמטרים 15. ככזה, R / NIR-LT לא אומץ באופן נרחב כחלק מפרקטיקה קלינית רגילה בneurotrauma, למרות היותו קל לניהול, לא פולשנית וטיפול זול יחסית. חסמים לתרגום קליני כוללים חוסר CLמוקדם הבין מנגנון פעולה והיעדר 16,17 פרוטוקול טיפול יעיל סטנדרטי. ספרות הקיימת לגבי טיפול באור מגלה שפע של וריאציה בפרמטרי טיפול ביחס למקורות קרינה (LED או לייזר), גל (לדוגמא, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), מינון כולל (ג &#39;אול של קרינה / יחידת שטח), משך (זמן חשיפה), תזמון (עלבון מראש או שלאחר), תדירות טיפול ובמצב האספקה ​​(דופק או מתמשך) 8. ההשתנות בפרמטרי טיפול בין המחקרים עושה השוואה קשה ותרמה לספקנות לגבי יעילות 16. לכן, אופטימיזציה של R / NIR-LT בבירור נדרשת, עם מערכות תרבית תאים מסוגלים לספק את מנגנון הקרנת התפוקה הגבוהה הדרוש כדי להשוות את המשתנים המרובים. עם זאת יש מערכות תאורה זמינות מסחרי כמה שיכול לספק גמישות מספקת ושליטה על wavelength ועוצמה לבצע ניסויי אופטימיזציה כזה. מסחרי התקני LED זמינים הם בדרך כלל לא מסוגלים לספק אורכי גל מרובים או עוצמות, וכתוצאה מכך חוקרי העסקת התקני LED מרובים של יצרנים שונים, אשר עשוי להשתנות לא רק בעצמה, אלא גם את הספקטרום של אורך גל של האור הנפלט. יש לנו לטפל בבעיה זו על ידי שימוש במקור אור בפס רחב קסנון המסונן דרך מסנני התערבות צר, ובכך לייצר מגוון רחב של אורכי גל וfluences של אור, המאפשר שליטה הדוקה, מדויקת של הפרמטרים של R / NIR-LT. חשוב לציין כי המינון הטיפולי של טיפול מוגדר במספר הפוטונים אינטראקציה עם photoacceptor (chromophore), אשר, במקרה של R / NIR-LT הנחה היא להיות מונואמין ג ציטוכרום (COX) 18. אנרגיית פוטון נמסרה משתנה עם אורך גל; כלומר מינונים שווים של אנרגיה באורכי גל שונה יהיה comיקר של מספרים שונים של פוטונים. לכן, האור הנפלט מהמכשיר כויל לפלוט מספר שווה של פוטונים לכל אחד מאורכי הגל שנבחרו להיבדק. פיתחנו מערכת שיכול לשמש כדי לספק R / NIR-LT במגוון של אורכי גל ועוצמות לתאים במבחנה והפגנתי היכולת למדוד את ההשפעות של R מועבר / NIR-LT על ייצור ROS בתאים נתון ל לחץ גלוטמט.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>STA-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed Reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Watt Xenon Arc Lamp</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>6258</td>
			<td>Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB4000-FL Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#956;m diameter quartz fibre optic</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraSuite Spectroscopy Platform</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2300 EnSpire Multimode Plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Acute toxicity, wear gloves when handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142-47-2 (anhydrous)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-2522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinal Muller (rMC1) cells</td>
			<td>University of California, San Diego</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75cm2 Flasks</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>B4-BE-353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-134</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>165U Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well plates, clear bottom, black</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07-200-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>Standard lab epuipment</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Standard lab epuipment</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Density Filter Paper (0.3)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>442nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FL441.6-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>550nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB550-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>670nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB670-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>810nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB810-10e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE02B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE03B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE05B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE06B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE10B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for the assessment of effects of a range of wavelengths and intensities of red/near-infrared light therapy on oxidative stress in vitro

Red טיפול / אור האינפרה-אדום קרוב (R / NIR-LT), מועבר על ידי לייזר או אור דיודה (LED), משפר את התוצאות תפקודיות ומורפולוגיים במגוון של פציעות של מערכת עצבים מרכזיות בגוף חי, ככל הנראה על ידי הפחתת לחץ חמצוני. עם זאת, השפעות של R / NIR-LT על סטרס חמצונים הוכחו להשתנות בהתאם לאורך גל או עוצמת הקרינה. מחקרים שהשוו בין פרמטרים טיפול חסרים, בשל העדר מכשירים זמינים מסחרי המספקים אורכי גל מרובים או עוצמות, מתאימים לגבוהה דרך-לשים במחקרי אופטימיזציה מבחנה. פרוטוקול זה מתאר טכניקה למסירה של אור בטווח של אורכי גל ועוצמות כדי לייעל את המינונים טיפוליים הנדרשים למודל פציעה נתון. חוקרים שערנו כי שיטה להעברת אור, שבו בקלות אפשר לשנות פרמטרים אורך גל ועוצמת, יכולה להקל על קביעת מינון אופטימלי של R / NIR-LT להפחתת מיני חמצן מגיבים(ROS) במבחנה. אור קסנון ללא קוהרנטית היה מסונן דרך מסנני התערבות פס צר כדי לספק אורכי גל שונים (אורכי גל מרכז 440, 550, 670 ו810nm) וfluences (8.5 x 10 -3 ל -3.8 x 10 -1 J / 2 סנטימטר) של אור לתאים בתרבית. תפוקת אור מהמנגנון כוילה לפלוט מינונים רלוונטיים טיפולי, שווים quantal של אור בכל אורך גל. מינים תגובתי אותרו בגלוטמט הדגיש תאים שטופלו באור, באמצעות DCFH-DA וH 2 O 2 צבעי ניאון רגישים. אנחנו בהצלחה נמסרו אור בטווח של אורכי גל רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית וטיפולי ועוצמות, לתאים בתרבית נחשפו לגלוטמט כמודל של פגיעה במערכת העצבים המרכזית. בעוד fluences של R / NIR-LT השתמש במחקר הנוכחי לא להפעיל השפעה על ROS שנוצר על ידי התאים בתרבית, השיטה של ​​מסירת אור ישימה למערכות חלקות אחרותEMS לרבות מבודד מיטוכונדריה או יותר מבחינה פיזיולוגית מודלים תרבות הפרוסה organotypic רלוונטיות, ויכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות על מגוון של מדדי תוצאה של מטבוליזם חמצוני.

הפלט של אור נמסר באורך גל של 670nm כויל באמצעות מסנני צפיפות ניטראליים כדי להקרין תאים עם מגוון רחב של fluences מקיף מינון של 670nm אור הראה בעבר להיות מועיל in vivo (0.3 J / cm 2) 20. ככל שמספר מסנני צפיפות ניטראליים מול מקור האור גדל, עוצמת (W / m 2) ירד, מה שמאפשר פחות אור ל...

Watch this Scientific Journal Video about Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro at JoVE.com

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני<em&gt; במבחנה</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

method-for-assessment-effects-range-wavelengths-intensities-rednear

Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

8.6K Views.  The University of Western Australia. Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Video: Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; בצלחות microtiter 96-היטב

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

שיטה להעריך אפקטים Bacteriocin על מיקרוביוטה המעיים של עכברים

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...