This work was supported by the KU Leuven PF &#8216;IMIR&#8217;, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.

NOT: Tüm hayvan deneyleri KU Leuven (proje numarası 090/2013) etik komitesi tarafından onaylanmıştır. KÜ Leuven hayvan bakım talimatlarına uygun olarak hayvanları koruyun. 1. C. albicans Büyüme <ol><li> Yirmi dört saat hayvan deneyinde başlatılmasından önce, maya özü, Taneli 10 g, bakteriyolojik pepton 20 g ve granüle agar 15 g ekleyerek YPD plakaları hazırlamak. Milli-Q su ve otoklav ile 900 ml sesini olun. </li><li> Steril% 40 glikoz, 50 ml ilave edilir. İyice karıştırın ve Petri kutularına dökün. Soğumaya ve katılaşmaya agar bırakın. NOT: Bu çalışmada, iki suşları, yani vahşi tip C kullanın albicans SC5314 - glukozit negatif (WT olarak anılacaktır) soyu ve C. Bir vahşi tip C olan albicans SKCA23 suşu SKCA23- bir adında suşu (.in Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmid 22 ile transforme albicans SC5314CTgLuc) glukozit (bu promotör mantar büyümesinin yanısıra hipal aşaması, maya aktif) ACT1 (aktin) promoterinin kontrolü altında endojen PGA59 geni ile kaynaştırılır. Bu suş Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belçika laboratuvar talep edilebilir. Plazmid Clp10 :: Act1p-gLUC59 plazmid 22 nazik Prof. C. d&#39;Enfert, Pasteur Enstitüsü&#39;nde, Paris, Fransa tarafından bağışlanmıştır. </li><li> -80 ° C&#39;de gliserol stoku ve deposunda hem suşları koruyun. </li><li> Bir YPD plaka üzerine herhangi bir deney çizgi suşları önce. Gece boyunca 37 ° C&#39;de plaka inkübe edin. </li></ol> 2. Kateter adet Hazırlık <ol><li> Deneyden önce, gerekli olan kaç kateterler belirler. Bu fare başına 6 adet kateter (solda 3 kateterler ve hayvan (Şekil 2A&#39;da sağ tarafında 3 kateter) kadar implant mümkündür. </li><li> Yirmi dört saat hayvan cerrahisi öncesinde, paketi açmakbiyolojik güvenlik kabini altında üçlü lümen kateter içeren yaşı. Steril bir bisturi ile kateter bağlı kısmını steril bir cımbız ile tüm gereksiz parçalar çıkarın ve kesti. Plastik paketi altında cetvel yerleştirin ve cetvel üzerinde ölçek (Şekil 1) &#39;e göre tam 1 ​​cm poliüretan kateter parçaları kesti. NOT: Bu kateter parçasının bu tip fosforlu ve BL 18,19 nedenle uygun olmadığını belirtmek önemlidir. </li><li> 2 ml mikrosantrifüj tüpler içine 15 kesilmiş kateter parçaları (adım. 2.2) maksimum yerleştirin. Daima yapışma süre sonra cihaz üzerinde takılı Candida hücrelerinin miktarını numaralandırmak için kullanılan ekstra 3 adet, hazırlamak. </li><li> Yaklaşık 1.8 ml% 100 fetal sığır serumu (FBS) eklenmiştir ile kateterler Ek. </li><li> Şiddetle vorteks ve% 100 FBS ek 100-200 ul ekleyin. Tamamen serum Tüm kateter parçaları kapsamaktadır. </li><li> Gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li&gt; </ol> 3. Hayvanlar ve Bağışıklık Sistemi Bastırma <ol><li> Standart gıda ve su ad libitum ücretsiz erişim ile bireysel havalandırılan filtre üst kafeslerde dişi BALB / c fareleri (yaş yaklaşık 8 hafta) tutun. </li><li> Hayvanların içme suyuna deksametazon (0.4 mg / L) ilave edilerek, hayvan cerrahi öncesi bağışıklık sistemi 24 saat bastırılmasını başlatın. Ev sahibi herhangi bir bakteri kirlenmesini önlemek amacıyla, bir antibiyotik ile içme suyu ilave, örneğin, ampisilin, sodyum tozu (0.5 gr / L). </li><li> (6 güne kadar) tüm deney sırasında hayvanların bağışıklık tutun. </li></ol> 4. ex vivo C. albicans Yapışma FBS kaplı Poliüretan Yüzeyler <ol><li> Taze 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içine her serum kaplı kateter parçası aktarın. </li><li> Bazı C. kazıyarak albicans hücreleri YPD kapları (Aşama 1) üzerinde büyütüldü ve PBS, 1 ml askıya. </li><li> Seyreltik CanAyrı bir mikrosantrifüj tüpü içinde: ggmmok hücreleri (100 1). Seyreltilmiş örnek 10 ul alın ve bir hücre sayımı odasının üzerine uygulayın. En az 16 küçük kareler sayın. </li><li> 5 x 10 4 hücre / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona RPMI 1640 ortamı Candida hücreleri (her biri ayrı ayrı suş) hazırlayın. </li><li> Her serum kaplı kateter birim hücre süspansiyonu 1 ml ilave edilir. </li><li> Şiddetle girdap ve kateterler, ortam içine ve üstünde yüzen değildir emin olun. </li><li> 90 dakika için 37 ° C (yapışma süresi) en kateterler inkübe edin. </li><li> Steril cımbız ile kateterler çıkarın ve PBS 1 ml ile iki kez yıkayın. Bu adım sırasında yıkama sıvısı çok nazikçe kateter yıkama sırasında dikey konumda kateter tutarak lümen yoluyla gider emin olun. Önemli bir şekilde, birleşmiş hücrelerin çıkarılması yol açabilir güçlü bir akış kullanmayın. </li><li> Tu başına temiz bir mikrosantrfuj tübü (tek parça her yıkandı, kateter aktarma) olmak. </li><li> Buz üzerinde yerleştirin ve ameliyat kadar orada tutun. </li></ol> 5. Anestezi <ol><li> Medetomidin, 100 ul (1 mg / ml) ve steril tuzlu su içinde 825 ul ketamin 75 ul (100 mg / ml) ile karıştırmak suretiyle anestezi hazırlayın. 45-60 mg / kg ketamin ve 0.6-0.8 mg / kg medetomidin dozunda elde edilen 10 g vücut ağırlığı başına anestetik kokteyli intraperitonal (ip), 60-80 ul uygulayın. </li><li> Anestezi ters için, 0.5 mg / kg&#39;lık bir dozda elde edilen, panzehir olarak IP uygulanması, 4.95 mi tuzlu su içinde 10 g vücut ağırlığı başına 100 ul 50 ul atipamezol (5 mg / ml) seyreltin. </li><li> Anestezi enjeksiyonundan sonra, ayrı bir kafes içine hayvan koyun ve tamamen uykuda kadar bekleyin. </li><li> Açık ten tutam ve cilde herhangi bir zarar vermez ayak tutam, hayvansal uygun anesthetization onaylayın. Gözlemlenen hareket hayvan yeterli ameliyat için anestezi olduğunu gösterir. Bu durumda, bir cou bekleyinuzun hayvanın kadar dakika ple deri veya ayak tutam üzerine hareket herhangi bir belirti göstermez. </li></ol> 6. Hayvan Cerrahisi <ol><li> Aktarım ısıtma pedi üzerine yerleştirilmiş temiz bir doku üzerine kafes hayvan anestetize, 37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış (Şekil 2A, (1)). NOT: Daha ucuz bir alternatif elektrikle ısıtılan battaniye kullanmaktır. Hayvan ameliyat öncesinde mikrodalga fırında ısıtılan gereken izotermik yastıkları, kullanmak da mümkündür. </li><li> Gözleri oftalmik merhem sürün. </li><li> Elektrikli ustura ile hayvanın alt arka Tıraş. Tüm hayvan tüyleri ve temiz bir dokusu üzerinde hayvan aktarın. (% 1 iyot izopropanol ya da% 70 alkol içinde% 0.5 klorheksidin ile, örneğin), cilt dezenfekte ve yaklaşık olarak 1 dakika boyunca kurumaya dezenfekte bölgeyi terk (Şekil 2A (2)). </li><li> (Deride yaklaşık 0.5 (hayvanın sağ tarafında solda) diğeri küçük bir kesi yapmak ve# 8211; 1 cm) (Şekil 2A, (3)). </li><li> İki deri altı tünelleri oluşturmak için bir makas ile subcutis ayır. Her bir tünel yaklaşık 1.5 cm uzunluğunda ve 1 cm genişliğinde olacaktır. </li><li> Her tünelde, daha önce Candida ile enfekte üç kateter parçaları, yerleştirin. Kateterler yatay düzende birbirine yalan emin olun ve toplam altı kateter parçalarının implantasyonu sağlamak için birbirlerine kapatmayın ki (Şekil 2A (4)). </li><li> Sütür ile kesiler kapatın. Alternatif olarak, yarayı kapatmak için Dermabond kullanın. </li><li> % 70 alkol veya iyot izopropanol (% 1) ile çok yavaşça% 0.5 klorheksidin ile yarayı dezenfekte edin. </li><li> Doğrudan yaranın üzerine lokal anestezi (xylocaine jel,% 2) uygulayın. </li><li> Anestezi tersine (protokolünü 5, adım 2) yönetme: intraperitoneal 100 ul 10 başına g vücut ağırlığı. </li><li> Temiz bir kafes transfer hayvan, daha önce bir ısıtıcı plaka üzerine yerleştirilmiştir. Hayvan tutunAyrı ve sıcak hayvan tamamen uyanık kadar. Bu arada, bir sonraki hayvanın operasyon ve implant ile devam ediyor. Bir kez tüm çalışan hayvanlar tamamen uyanık. Bir kafese transfer. Düzenli hayvanları izleyin. </li></ol> 7. Biyoparlaklık Görüntüleme: coelenterazine (CTZ) hazırlanması G. için, Yüzey princeps lusiferaz <ol><li> Asidifiye etanol içinde 5 mg / ml CTZ çözülmesi ya da imalatçının talimatlarına göre taze coelenterazine (CTZ) stok çözelti hazırlayın. </li><li> Steril PBS içinde stok çözelti 1:10 seyreltilmesiyle 1.2 mM&#39;lik çalışma çözeltisi hazırlayın. NOT: kateterleri çevredeki 100 ul CTZ çalışma çözümleri deri altına enjekte edilir. CTZ ve deri altına enjeksiyon için, insülin şırınga kullanın. </li><li> Her zaman karanlıkta CTZ tutmak (örneğin, alüminyum folyo ile CTZ içeren mikrosantrifüj tüpler kapak). Deneyler süresince -80 ° C&#39;de stok solüsyonu saklayın. </li></ol&gt; 8. Biyoparlaklık Görüntüleme <ol><li> BLI Fotoğraf makinesini sıfırlayın. </li><li> Bir indüksiyon kutusunu kullanarak hayvanları uyutmak. % 2-3, oksijen N2 O / O 2, veya hava izofluran bir gaz karışımı kullanın. </li><li> Indüksiyon sonrası, indüksiyon kutusunda ve% 1.5-2 olarak görüntüleme odasında anestezi korumak. </li><li> Görüntüleme oturumu başlamadan önce, 10 cm FOV karşılık A konumunda görüntüleme plaka, yerleştirin. Emin olun kutusuna bir uyku hayvan koyarak anestezi çıkışları ve hayvanın doğru pozisyonda olduğunu. </li><li> Hayvan hakkı kamera altında FOV içinde, istenen görüntüleme konuma gelene kadar birkaç fotoğraf çekin. </li><li> İnsülin şırınga CTZ hazır çözelti, her biri 100 ul hazırlayın. </li><li> Bankta bir hayvan koyun ve gaz anestezi sağlayan bir burun konisi vasıtasıyla uykuda tutmak. </li><li> Kateterler deri çevreleyen bir yerde şırınga iğneleri getirin ve enjekteCTZ aynı anda kateter üstüne. </li><li> Enjeksiyondan hemen sonra, kamera kutusu sıcak plaka üzerinde hayvan koyun ve biyoışıldama görüntü alımı başlatabilirsiniz. </li><li> 20 maksimum sinyal yoğunluğu ulaşana kadar 60 saniye (sinyal yoğunluğuna bağlı olarak) arasında değişen satın alma süreleri ile ardışık taramaları Edinme. Bir sonraki karenin alımı sırasında, bu ROI ile foton akı her kateterler üçlü üzerinde bir yatırım getirisi yerleştirerek ve ölçerek, daha önce edinilmiş kare BLI sinyal yoğunluğunu ölçmek. </li><li> Bir sonraki hayvanın (ler) için 7. adımdan tekrarlayın. </li><li> Görüntüleme sonra, kendi kafesine hayvanları dönün. Biyofilm oluşumu uzunlamasına, non-invaziv takip için bir deney sırasında BLI tekrarlayın. </li><li> Yaşam Görüntü yazılımı kullanılarak BLI verileri analiz. Her kateter üçlüsü üzerinde sabit boyutta bir dikdörtgen ROI ve her ROI ile foton akı (parlaklık) ölçün. Her hayvan için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> RaporSaniyede foton akı olarak her kateter üçlüsü BLI sinyal yoğunluğu. Ortalama ve her grup için saniyede foton akı SD çizerek logaritmik ölçekte BLI verileri temsil. Günlük 10 dönüştürülmüş veriler üzerinde istatistiksel analiz. </li></ol> 9. Kateter Eksplantasyon <ol><li> Her kateter cihaz için PBS, biri 1 ml içeren mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. </li><li> Servikal dislokasyon ile hayvanlar öldürülür (Şekil 2B, (1)). </li><li> % 70 alkol içinde ya da iyot izopropanol (% 1) ile% 0.5 klorheksidin ile sırtın deri dezenfekte. </li><li> Kateter üzerinde bir kesi (yaklaşık 3 cm) yapın. </li><li> Deri altı doku kesin ve steril cımbız kullanarak deri altı doku altına birer kateter fragmanlarını birini kaldırmak (Şekil 2B, (2)). </li><li> Dikey konumda yavaşça kateter işlemek ve steril 1 ml PBS ile iki kez yıkanır. Her kateter yerleştirinAyrı bir mikrosantrifüj tüpü içine bir parça (Kademe 1 de elde edilmiş). </li></ol> Koloni Oluşturma Birimleri Kont (CFU) ve Sonuçlar İstatistiksel Analizler tarafından 10. Niceliklendirilmesi Biyofilm ilişkili Hücreler <ol><li> Sonikasyon kateterler, daha önce bir su banyo sonikatörü içinde 40,000 Hz 10 dakika için 1 ml PBS içine yerleştirilir ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Sonikasyonun sonra, şiddetle buz üzerinde tekrar 30 sn ve yer girdap. </li><li> PBS 900 ul ihtiva eden iki ek mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. </li><li> Orijinal numunenin (kateter içeren bir) 100 dilüsyonları ve buz üzerinde tüm mikrosantrifüj tüpleri tutmak: 01:10 ve 1 yapın. </li><li> Plaka, orijinal numune, 100 ul, 1:10 ve 1: iki kez YPD agar plakaları üzerinde 100 seyreltme. </li><li> 37 ° C&#39;de 2 gün süreyle inkübe edin ve CFU sayısı. </li><li> YPD agar plakaları üzerinde büyüyen kolonilerin (kolonilerin sayılabilir miktarda, maksimum 300 koloni / plaka) Sayım ve uygun Dilu bunları çarpınyon faktörü (1x-orijinal, 10x veya 100x seyreltme). Ayrıca kateter içeren 1 ml tüp kolonilerin son miktarına tekabül 10x her kateter parça, çarpın. 10 hücre / standart sapma (SD) kateter parçası oturum kolonilerin son miktarda getirin. SD ± olarak veri Express. </li><li> Yukarıda belirtilen hesaplamalar ve istatistiksel analizler gerçekleştirmek için, bir elektronik tablo ve / veya istatistik programına her kateter ve belirli bir grup için tüm değerleri yerleştirin. Karşılaştırmak için özel gruplar belirtiniz, yani WT vs mutant ya da 2 gün vs. 6 gün biyofilm oluşumu ve log10-dönüştürülmüş veriler Tukey post-testi ile bağımsız gruplar t-testi ve ANOVA gerçekleştirin. <ol><li> Bir p değerine göre anlamlılık düzeyini ifade eder. Olarak temsil p değeri &lt;0.05, şu, bu çalışmada önemi gösterir: * p &lt;0.05, ** p &lt;0.005, *** p &lt;0.0005. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Yapar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+invasive+candidiasis.">Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis.</a> Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).</li><li>Tournu, H., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+biofims+and+the+host:+models+and+new+concepts+for+eradication.">Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication.</a> Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).</li><li>Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Candida+biofilm+drug+resistance.">Mechanisms of Candida biofilm drug resistance.</a> Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).</li><li>Math&#233;, L., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+Candida+albicans+biofilm+resistance+mechanisms.">Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms.</a> Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).</li><li>Kuchar&#237;kov&#225;, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activities+of+systematically+administered+echinocandins+against+in+vivo+mature+Candida+albicans.+biofilms+developed+in+a+rat+subcutaneous+model.">Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).</li><li>Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+susceptibility+of+Candida+biofilms:+Unique+efficacy+of+amphotericin+B+lipid+formulations+and+echinocandins.">Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).</li><li>Ramage, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+amphotericin+B+displays+rapid+dose-dependent+activity+against+Candida+albicans+biofilms.">Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).</li><li>Andes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vivo+central+venous+catheter+Candida+albicans+biofilm+model.">Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model.</a> Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).</li><li>Schinabeck, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+model+of+Candida+albicans+biofilm+infection:+liposomal+amphotericin+B+antifungal+lock+therapy.">Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).</li><li>Lazzell, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+Candida+albicans+biofilms+with+caspofungin+in+a+novel+central+venous+catheter+murine+model+of+candidiasis.">Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis.</a> J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).</li><li>Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+an+in+vivo+Candida+albicans+biofilm+denture+model.">Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model.</a> Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).</li><li>Wang, X., Fries, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+catheter+associated+Candiduria.">A murine model for catheter associated Candiduria.</a> J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).</li><li>Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+forms+biofilms+on+the+vaginal+mucosa.">Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa.</a> Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characerterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4, e7976 (2009).</li><li>Ricicov&#225;, M., Kuchar&#237;kov&#225;, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujd&#225;kov&#225;, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+formation+in+a+new+in+vivo+rat+model.">Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model.</a> Microbiol. 156, 909-919 (2010).</li><li>Kuchar&#237;kov&#225;, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+efficacy+of+anidulafungin+against+Candida+albicans+mature+biofilms+in+a+novel+rat+model+of+catheter-associated+candidiasis.">In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).</li><li>Bink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonsteroidal+antiinflammatory+drug+diclofenac+potentiates+the+in+vivo+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms.">The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).</li><li>Van de Velde, G., Kuchar&#237;kov&#225;, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence.">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).</li><li>Van de Velde, G., Kuchar&#237;kov&#225;, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+fungal+biofilm+development+in+live+animals.">Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals.</a> Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).</li><li>Gahan, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+lux+reporter+system:+applications+in+bacterial+localisation+studies.">The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies.</a> Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).</li><li>Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fungal+infections+in+living+mice+using+bioluminescent+pathogenic+Candida+albicans+strains+transformed+with+the+firefly+luciferase+gene.">Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene.</a> Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).</li><li>Enjalbert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+synthetic+Gaussia+princeps+luciferase+reporter+for+live+imaging+of+Candida+albicans+infections.">A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).</li><li>Mosci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bioluminescence+mouse+model+for+monitoring+oropharyngeal+candidiasis+in+mice.">A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice.</a> Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).</li><li>Van Wijngaerden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign+body+infection:+a+new+rat+model+for+prophylaxis+and+treatment.">Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment.</a> J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

konak bağışıklık sistemi in vitro modeller için hesap edemez biyofilm oluşumunda önemli bir faktör olarak mikrobiyal biyofilm adanmış çalışmalar için hayvan modellerinde, özellikle kemirgen modellerin kullanılması çok önemlidir. Bu çalışmada, oldukça basit bir deri altı C tarif Kolayca bir araştırma laboratuvarında kabul edilebilir ve güçlü teknik beceri gerektirmez albicans biyofilm fare modeli. Bu model, ilk olarak bir sıçanın 24 epidermidis</...

Candida albicans, deri üzerinde ya da gastrointestinal ve vajinal florasının bir parçası olarak, örneğin, sağlıklı bireylerin farklı yerlerde bulunan bir ortakçı bir organizmadır. Bununla birlikte, içinde yatan ve özellikle immünokompromize hastalar, bu enfeksiyonların 1 geniş bir neden olabilir. Bu tür kişilerde, bağışıklık sisteminin zayıflamasına Candida hücreleri kan dolaşımına yaymak ve yaşamı tehdit eden enfeksiyonlara neden olan derin dokuları istila sağlar. Buna ek olarak, örneğin merkezi venöz ve idrar sondaları gibi abiyotik alt-tabakaların mevcudiyeti, suni kalp kapakçıkları ve eklemler, Candida ek 2 için bir niş sağlayabilir. Bu tür substratlara yapışma esas polisakaritlerin 2 oluşan hücre dışı bir polimerik malzeme içinde gömülü maya ve hifal hücre katmanı temsil daha biyofilm gelişimi için bir ön koşuldur. C albicans kateter enzimi yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde enfeksiyonlaryüksek mortalite ile ilişkilidir. Biyofilm genel karakteristiği gibi azollerin 3,4 olarak bilinen antifungal, onların azalmış duyarlılık olduğunu. Bu tür ekinokandinler ve amfoterisin B lipozom formülasyonu olarak antifungal ilaçların yalnızca yeni sınıflar, kateter ilişkili enfeksiyonların 5-7 karşı aktif olduğunu kanıtladı. Için anti-fungal maddeler ile biyofilm esneklik terapötik yaklaşımlar çok sık kateter çıkarılması ve tek çözüm olarak daha sonraki değiştirilmesine yol açacak şekilde sınırlıdır. C bizim mevcut anlayış çoğu albicans biyofilm geliştirme, yukarıda belirtilen aygıtlar, örneğin, silikon, poliüretan, 2 imalatında kullanılan abiyotik polistiren gibi substratları ya da plastik üzerinde in vitro çalışmalar kaynaklanır. Bu modeller oldukça gelişmiş ve mümkün olduğunca yakından in vivo durumu taklit deneyin. Bununla birlikte, bu sistemler, sürekli bir kan akışı ve t içermeyenO konağın bağışıklık sistemi. Bu tür santral venöz kateter (SVK) modeli 8-10, oral kandidiyazis 11 protez stomatit modeli ve kateter ilişkili kandidüri 12 için bir fare modelinde olarak in vivo model sistemlerinde, geliştirme sonuçlandı. Buna ek olarak, C albicans biyofilm gelişimi vajina 13 ve ağız 14 gibi mukozal yüzeyler üzerinde in vivo incelenmiştir. Laboratuvarımız deri altı C kurulması ile katkıda Sprague Dawley sıçanların 15 arkasındaki enfekte kateter adet implant dayanmaktadır albicans biyofilm modeli. Bu model başarılı diklofenak ve Kaspofungin 17 kombinasyon tedavisinin etkisini incelemek için, uyuşturucu 5,16 Flukonazole biyofilm duyarlılığı test etmek ve ekinokandin bizim laboratuvarda kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, BALB / c farelerinde 18,19 kullanmak için bu uyum sağlamıştır. Içindein vivo modellerde diğer ile karşılaştırılması, bu deri altı modelin ana avantajı implante kateter adet lümen içinde geliştirilen hayvan başına birden fazla biyofilm çalışma imkanı vardır. Deney hayvanlarının sayısını azaltmak için, biz C gelişimini incelemek için bu modeli adapte olması albicans biyoışıldama görüntüleme (BLI) 18,19 kullanılarak non-invaziv biyofilm. Bu yöntem, hayvan kurban kaçınarak, (bu durumda implant kateterlerin bölge) ilgi bölgesi spesifik BLI bir işaret ölçülerek biyofilm ölçmek için kullanılabilecek etkili bir teknik olduğunu kanıtladı. C de dahil olmak üzere bağlı bir özel lux operon&#39;u 20 giriş geni ve biyoışıldama reaksiyon için gerekli olan alt-tabakanın her iki ifade bakterilerin göre, içinde, en ökaryotik organizmalar, albicans, ile birlikte bir lusiferaz geninin heterolog ekspresyonu bağlıdırD-luciferase veya koelenterazin 21 gibi belirli bir substrat, dış yönetim. Muhtemelen, fungal hücre duvarı ve C varlığına albicans morfonogenezi, lusiferaz enzim için substrat hücre içi teslimat ana zorluk 21 oldu. Bu sorunu çözmek için, Enjalbert ve ark. 22, bir yük tasarlanmış burada sentetik C doğal salgılanan Gaussia princeps lusiferaz için bir gen (glukozit) albicans kodon-optimize edilmiş türden C ile kaynaştırılır albicans PGA59 geni, bir GPI- hücre duvarı protein demirli. Çünkü hücre duvarındaki lusiferaz varlığı, substrat hücre içi temin edilebilirliğine ilişkin sorunlar önlenebilir. Bu özel sistem C&#39;nin neden olduğu yüzeysel enfeksiyonları incelemek için kullanılan albicans 22. Çok yakın, BLI da orofaringeal kandidiyazis ve possibl ilerlemesini izlemek için kullanılmıştıre tedavisi 23. Bu bulgular serbest yaşayan hücreler aynı zamanda cihazın ilişkili enfeksiyonların yol açtığı enfeksiyonları incelemek için umut verici bir yöntem olarak BLI kullanımını desteklemektedir. Bu çalışmada, C tarif BL kullanılan poliüretan kateter, BALB / c farelerinde parçaları ve nicelenmesine albicans biyofilm gelişimi. Biz canlı hayvan farelerde implantasyon ve sonraki biyofilm gelişimi takip yapışma döneminde poliüretan kateter in vitro kolonizasyonu ayrıntılı bir protokol sağlar. Apart C. tarafından yayılan BLI sinyalini ölçerek gelen albicans hücreleri, biz de biyofilm mantar yük ölçümü için standart tekniği ile karşılaştırma için birimleri oluşturan koloni belirler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Yeast extract granulated</td>
			<td style="width:199px;">Merck</td>
			<td style="width:113px;">MERC1.03753.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:199px;">Oxoid</td>
			<td style="width:113px;">LP037B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Agar granulated</td>
			<td style="width:199px;">Difco</td>
			<td style="width:113px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">D-(+)-glucose</td>
			<td style="width:199px;">Fluka</td>
			<td style="width:113px;">49159-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Prepared in the laboratory</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">R6504-1L</td>
			<td>Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">M1254</td>
			<td>MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">BBraun</td>
			<td style="width:113px;">CV-15703</td>
			<td>Polyurethane part cut into 1 cm pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:199px;">Fagron SAS, France</td>
			<td style="width:113px;">611139</td>
			<td>Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Duchefa Biochemie, The Netherlands</td>
			<td style="width:113px;">A0104</td>
			<td>Antibacterial prophylaxis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Ketamine 1000</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">804 119</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Domitor</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">134737-1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Antisedan</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">134783-2</td>
			<td>Reversal of anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Xylocaine gel (2%) - this is Linisol</td>
			<td style="width:199px;">AstraZeneca</td>
			<td style="width:113px;">352 1206</td>
			<td>Local anesthetic for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>To prevent drying and infection of eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Coelenterazine&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Prolume (Nanolight)</td>
			<td style="width:113px;">NF-CTZ-FB</td>
			<td>Light sensitive agent (must be kept in the dark)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodine isopropanol (1%)</td>
			<td style="width:199px;">3M&#8482; DuraPrep&#8482;&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Disinfectant for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.&#160;&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Cedium</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Disinfectant for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Cell counting chamber</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Insulin syringes (0.3 ml)</td>
			<td style="width:199px;">Terumo Myjector 29G</td>
			<td style="width:113px;">324826</td>
			<td>For injection of coelenterazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Electric razor</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Sterile surgical tools</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Heating pad</td>
			<td style="width:199px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">14042321474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Skin suture</td>
			<td style="width:199px;">Johnson&#38;Johnson</td>
			<td style="width:113px;">K890H</td>
			<td>Surgical thread, needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath sonicator</td>
			<td>Branson 2210</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">BLI camera (IVIS Spectrum)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Perkin Elmer, Alameda</td>
			<td style="width:113px;">IVISSPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Living Image software&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Perkin Elmer, Alameda</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>(version 4.2)&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging

Biyotik ve / veya abiyotik yüzeylerde Candida albicans biyofilm gelişimi yatan hastalar için özel bir tehdit oluşturmaktadır. Şimdiye kadar, C albicans biyofilm in vitro ağırlıklı incelenmiştir, ancak, in vivo koşullar altında bu dinamik işlemin daha iyi anlaşılması için önemli bir ihtiyaç vardır. Biz C çalışma bir in vivo deri altı sıçan modeli geliştirdi albicans biyofilm oluşumu. Bizim modelde, (9&#39;a kadar) birden Candida enfekte olan cihazlar hayvanın arka kısmına implante edilir. Bize bir hayvanda birçok bağımsız biyofilm çalışma sağlar gibi bu santral venöz kateter modeli sistemi üzerinden bize büyük bir avantaj sağlıyor. Son zamanlarda, biz C incelemek için bu modeli adapte BALB / c farelerine albicans biyofilm gelişimi. Bu modelde, C olgun albicans biyofilm 48 saat içinde geliştirmek ve tipik üç-boyutlu biyofilm mimarisi göstermektedir. mantar biyofilm ölçümügeleneksel analiz otopsi ve ev sahibi fedakarlık gerektirir. Bu kinetik çalışmalar yapmak birçok hayvan kullanımını gerektirdiğinden, biz uzunlamasına olgun in vivo takip C&#39;ye non-invaziv biyoluminesans görüntüleme (BLI) uygulanan albicans, bizim deri altı modeli gelişmekte biyofilm. C albicans hücreleri hücre duvarına bağlı Gaussia princeps lusiferaz geni (glukozit) ifade etmek için tasarlanmış edildi. biyoışıldama sinyali ölçülebilir ışık ilave edilmiş substrat koelenterazin dönüştürür lusiferaz tarafından üretilir. BLI sinyal Eksplante kateter elde edilen hücre sayımları benziyordu. In vivo biyofilm oluşumu ölçülmesi için Non-invaziv görüntüleme daha iyi anlamak için, burada katkı yanı sıra konak-patojen etkileşimleri dayalı çalışmalar için in vivo koşullarda tarama ve antifungal ilaçların doğrulama için acil uygulamalar sağlarKateter ilişkili enfeksiyonların patogenezi ing.

Bu çalışmada, bir farede in vivo olarak, C. albicans biyofilm gelişimi sırasında kateterin implant ve eksplant cerrahi bir işlemi göstermektedir. Ayrıca, klasik CFU numaralandırma tarafından değil, aynı zamanda BLI tarafından değil, sadece olgun biyofilm miktarının görüntüler. Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi, olmayan fosforlu poliüretan kateter adet 1 sm cihazları halinde kesilir ve daha sonra serum ile kaplandı. Candida hücrele...

Watch this Scientific Journal Video about Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

candida-albicans-biofilm-development-on-medically-relevant-foreign

Research

JoVE Journal

Medicine

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

12.9K Görüntüleme.  Institute of Botany and Microbiology, VIB, KU Leuven. We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Video: Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence imaging using IVIS Spectrum was employed to monitor the distribution and development of the tumor cells following the delivery procedure including DLIT reconstruction to measure the tumor signal and its location.
Development of metastatic lesions to the bone tissues triggers osteolytic activity and lesions to tibia and femur were evaluated longitudinally using micro CT. Imaging was performed using a Quantum FX micro CT system with fast imaging and low X-ray dose. The low radiation dose allows multiple imaging sessions to be performed with a cumulative X-ray dosage far below LD50. A mouse imaging shuttle device was used to sequentially image the mice with both IVIS Spectrum and Quantum FX achieving accurate animal positioning in both the bioluminescence and CT images. The optical and CT data sets were co-registered in 3-dimentions using the Living Image 4.1 software. This multi-mode approach allows close monitoring of tumor growth and development simultaneously with osteolytic activity.

An experimental mouse model of bone metastasis was established following intracardiac delivery of luciferase expressing mammary tumor cells. Tumor development and resulted osteolytic lesion were monitored longitudinally with bioluminescence and micro CT imaging.

Biyoparlaklık ve Micro CT Görüntüleme Tümör Metastazlari ve osteolitik Lezyonlar İzleme

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

Tıp

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 months. It is critical to have suitable animal models to mimic the hemodynamic spread of the metastatic cells in the clinical scenario. Here, we are introducing the use of small animal ultrasound imaging to guide an accurate injection of brain tropical breast cancer cells into the left ventricle of athymic nude mice. Longitudinal MRI is used to assessing intracranial initiation and growth of brain metastases. Ultrasound-guided intracardiac injection ensures not only an accurate injection and hereby a higher successful rate but also significantly decreased mortality rate, as compared to our previous manual procedure. In vivo high resolution MRI allows the visualization of hyperintense multifocal lesions, as small as 310 &#181;m in diameter on T2-weighted images at 3 weeks post injection. Follow-up MRI reveals intracranial tumor growth and increased number of metastases that distribute throughout the whole brain.

A breast cancer brain metastasis mouse model is established with ultrasound imaging-guided intracardiac injection of MDA-MB231/Br-GFP cells. Development of multifocal intracranial metastases has been monitored longitudinally using high-resolution 9.4 T MRI.

Boyuna MRG Ardından Meme Kanseri Beyin Metastaz bir Fare Modeli geliştirmek için ultrason görüntüleme eşliğinde intrakardiyak enjeksiyon

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Boyuna İki foton görüntüleme ile takip Farelerde Akut Beyin Travma

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Bir deri altı tümör modelinde tümör-süzücü lökosit subsetleri Değerlendirilmesi

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Glioblastoma&#39;nın için bir Immünkompetan Hayvan Modeli Biyoparlaklık Görüntüleme

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Bir Yenidoğan Fare Omurilik Sıkıştırma Yaralanması Modeli

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

İzometrik Contractility ölçüm tel Myography kullanarak fare mezenterik arter

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...