This work was supported by the KU Leuven PF &#8216;IMIR&#8217;, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der KU Leuven (Projektnummer 090/2013) genehmigt. Pflegen Tiere im Einklang mit den KU Leuven Tierpflege-Richtlinien. 1. C. albicans Wachstum <ol><li> Vierundzwanzig Stunden vor der Einleitung der Tierexperiment vorbereitet YPD-Platten durch Zugabe von 10 g Hefeextrakt granuliert, 20 g bakteriologischer Pepton und 15 g granuliertes Agar. Make-up Volumen auf 900 ml mit Milli-Q-Wasser und Autoklaven. </li><li> 50 ml sterile 40% Glucose. Gründlich mischen und in Petrischalen gießen. Verlassen Agarplatten abzukühlen und zu verfestigen. HINWEIS: In dieser Studie verwenden zwei Stämme, nämlich Wildtyp C. albicans SC5314 - Gluc negativen Stamm (als WT bezeichnet) und C albicans SKCA23-Stamm, der ein Wildtyp C ist albicans SC5314 mit Clp10 :: Act1p-gLUC59 Plasmid 22 .In diesem Stamm (benannt SKCA23- Eine transformierteCTgLuc) Gluc wurde unter die Kontrolle des ACT1 (Aktin) Promotor des endogenen PGA59 Gens fusioniert (dieser Promotor aktiv in der Hefe sowie hyphalen Stufe des Pilzwachstums). Dieser Stamm kann aus dem Labor von Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgien beantragt werden. Plasmid Clp10 :: Act1p-gLUC59 Plasmid 22 wurde freundlicherweise von Prof. C. d&#39;Enfert, Institut Pasteur, Paris, Frankreich gespendet. </li><li> Halten Sie beide Stämme in Glycerin Lager und bei -80 ° C. </li><li> Vor jeder Versuch Streifen Stämme auf eine YPD-Platte. Inkubieren Platte bei 37 ° C über Nacht. </li></ol> 2. Katheter Stück Vorbereitung <ol><li> Vor dem Versuch, zu bestimmen, wie viele Katheter benötigt werden. Es ist möglich, den Katheter 6 Stück pro Maus (3-Katheter an der linken und 3 Katheters auf der rechten Seite des Tieres (2A) bis zu implantieren. </li><li> Vierundzwanzig Stunden vor der Tierchirurgie, öffnen Sie die PackungAlter, die Triple-Lumen-Katheter unter der biologischen Sicherheitsschrank. Alle nicht benötigten Teile mit einer sterilen Pinzette entfernen und schneiden Sie die mit einem sterilen Skalpell an den Katheter angebracht Teil. Zeigen Herrscher unter dem Kunststoffgehäuse und schneiden Polyurethan Katheter Stücke aus genau 1 cm nach der Skala auf dem Lineal (Abbildung 1). Hinweis: Es ist wichtig zu erwähnen, dass diese Art von Katheter Stück nicht phosphoreszierenden und daher für BLI 18,19. </li><li> Legen Sie ein Maximum von 15 Schnitt Katheterstücke (Schritt. 2.2) in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Immer bereiten 3 Stück zusätzliche, die verwendet werden, um die Menge der beigefügten Candida-Zellen auf dem Gerät nach Ablauf der Haft aufzuzählen. </li><li> Ergänzen Kathetern mit etwa 1,8 ml 100% igem fötalem Rinderserum (FBS). </li><li> Kräftig vortexen und zusätzliche 100 bis 200 ul 100% FBS. Decken Sie alle Katheterstücke mit Serum. </li><li> Bei 37 ° C über Nacht. </li&gt; </ol> 3. Tiere und Unterdrückung des Immunsystems <ol><li> Halten weiblichen BALB / c-Mäuse (ca. 8 Wochen alt) in einzeln belüfteten Filterober Käfigen mit freiem Zugang zu Standard-Futter und Wasser ad libitum. </li><li> Initiieren Suppression des Immunsystems 24 h vor Tierchirurgie durch Zugabe von Dexamethason (0,4 mg / L), um dem Trinkwasser der Tiere. Um jede bakterielle Kontamination des Wirts zu vermeiden, ergänzen das Trinkwasser mit einer Antibiotika, beispielsweise Ampicillin Natriumpulver (0,5 g / L). </li><li> Halten Immunsuppression von Tieren während des gesamten Experiments (bis 6 Tage). </li></ol> 4. Ex vivo C. albicans Haftung auf FBS beschichtet Polyurethan-Substrate <ol><li> Übertragen Sie jede Serum beschichteten Katheter Stück in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Kratzen Sie einige C albicans Zellen auf YPD-Platten (Schritt 1) angebaut und suspendieren diese in 1 ml PBS. </li><li> Verwässern können,dida Zellen (1: 100) in einem separaten Reaktionsgefäß. Nehmen Sie 10 ul der verdünnten Probe und wenden es auf eine Zelle Zählkammer. Zählen Sie mindestens 16 kleine Quadrate. </li><li> Bereiten Candida-Zellen (jeder Stamm separat) in RPMI 1640-Medium auf eine Endkonzentration von 5 x 10 4 Zellen / ml. </li><li> 1 ml der Zellsuspension in jede Serum beschichteten Katheterstück. </li><li> Kräftig vortexen und sicherzustellen, dass die Katheter in das Medium eingetaucht und nicht oben schwimmen. </li><li> Katheter bei 37 ° C für 90 min (Zeit der Adhäsion). </li><li> Katheter mit einer sterilen Pinzette entfernen und zweimal waschen Sie sie mit 1 ml PBS. Während dieses Schrittes wird sicherstellen, dass die Waschflüssigkeit geht durch den Hohlraum, indem der Katheter in der vertikalen Position während sehr sanft Spülen der Katheter. Wichtig ist, nicht mit einem starken Strömung, die auf die Entfernung von anhaftenden Zellen führen kann. </li><li> Übertragen Sie jede gewaschen Katheter in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen (ein Stück pro tusein). </li><li> Zeigen auf Eis und dort zu halten, bis der Operation. </li></ol> 5. Anästhesie <ol><li> Bereiten Anästhesie durch Mischen von 75 ul von Ketamin (100 mg / ml) mit 100 ul Medetomidin (1 mg / ml) und 825 &amp; mgr; l steriler Kochsalzlösung. Verabreichen intraperitoneal (ip) 60-80 ul Narkosecocktail pro 10 g Körpergewicht, was einer Dosis von 45-60 mg / kg Ketamin und 0,6-0,8 mg / kg Medetomidin. </li><li> Zum Umlegen der Anästhesie, verdünnter 50 ul Atipamezol (5 mg / ml) in 4,95 ml Kochsalzlösung, zu verabreichen ip 100 ul pro 10 g Körpergewicht als Antidot, was in einer Dosis von 0,5 mg / kg. </li><li> Nach dem Einspritzen der Anästhesie, legen Sie das Tier in einen separaten Käfig und warten Sie, bis es vollständig eingeschlafen. </li><li> Überprüfen Sie die Betäubung des Tieres durch helle Haut und Zehen Prise Prise, die Schäden an der Haut verursachen. Jeder beobachtete Bewegung zeigt an, dass das Tier nicht ausreichend betäubt eine Operation durchzuführen. Wenn dies geschieht, warten Sie eine couB. von Minuten länger, bis das Tier keine Anzeichen für eine Bewegung auf der Haut oder Zehen Prise zu zeigen. </li></ol> 6. Tierchirurgie <ol><li> Transfer narkotisiert Tieres aus dem Käfig auf einer sauberen Gewebes auf Heizkissen gelegt, auf 37 ° C vorgewärmt (2A, (1)). ANMERKUNG: Eine billigere Alternative ist es, elektrisch beheizten Decken benutzen. Es ist auch möglich, isotherme Pads, die in der Mikrowelle vor dem Tierchirurgie erwärmt werden muss verwenden. </li><li> Bewerben Augensalbe auf die Augen. </li><li> Rasieren Sie den unteren Rücken des Tieres mit einem elektrischen Rasierer. Entfernen Sie alle Tierhaare und übertragen Tier auf einem sauberen Tuch ab. Desinfizieren Sie die Haut (zB mit 1% Jod Isopropanol oder 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol) und lassen Sie das desinfizierte Bereich für etwa 1 min trocknen (2A, (2)). </li><li> Einen kleinen Einschnitt in der Haut (eine auf der linken und auf der rechten Seite des Tieres) (ungefähr 0,5 &amp;# 8211; 1 cm) (2A, (3)). </li><li> Präparieren Sie die Unterhaut mit einer Schere auf zwei subkutanen Tunnel zu erstellen. Jeder Tunnel ist ca. 1,5 cm lang und 1 cm breit sein. </li><li> Legen Sie drei Katheterstücke, die zuvor mit Candida infiziert ist, in jeden Tunnel. Sicherzustellen, dass die Katheter liegen nebeneinander in einer horizontalen Anordnung und dass sie sich nicht gegenseitig abdecken, um die Implantation von sechs Katheter Fragmente insgesamt ermöglichen (2A, (4)). </li><li> Schließen Sie die Schnitte mit Nähten. Alternativ können Sie Dermabond, um die Wunde zu schließen. </li><li> Desinfizieren Sie die Wunde sehr vorsichtig mit 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol oder mit Jod Isopropanol (1%). </li><li> Bewerben Lokalanästhetikum (Xylocain-Gel, 2%) direkt auf die Wunde. </li><li> Verabreichen Umkehr Anästhesie (Protokoll 5, Schritt 2): intraperitoneal 100 &amp; mgr; l pro 10 g Körpergewicht. </li><li> Übertragungs Tier in einen sauberen Käfig zuvor auf eine Heizplatte gelegt. Halten Sie das Tiergetrennte und warm, bis das Tier ganz wach. Inzwischen weiterhin mit dem Betrieb und Implantat der nächste Tier. Sobald alle operierten Tiere sind ganz wach. Transfer zu einem Käfig. Überwachen Tiere regelmäßig. </li></ol> 7. Biolumineszenz Imaging: Darstellung von Coelenterazin (CTZ), dem Substrat für G. princeps Luciferase <ol><li> Bereiten Sie frische Coelenterazin (CTZ) Stammlösung durch Auflösen von 5 mg / ml in CTZ angesäuert Ethanol oder nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bereiten 1,2 mM Arbeitslösung durch Verdünnen der Stammlösung 1:10 in steriler PBS. HINWEIS: Injizieren Sie 100 ul CTZ Arbeitslösungen subkutan in der Umgebung der Katheter. Verwenden Insulinspritzen zur subkutanen Injektion von CTZ. </li><li> Halten Sie CTZ im Dunkeln (zB decken Mikrozentrifugenröhrchen, die CTZ mit Aluminiumfolie). Speicherung der Stammlösung bei -80 ° C für die Dauer der Experimente. </li></ol&gt; 8. Biolumineszenz Imaging <ol><li> Initialisieren Sie die BLI-Kamera. </li><li> Betäuben die Tiere unter Verwendung eines Induktionsfeld. Verwenden eines Gasgemisches von Isofluran in Sauerstoff, N 2 O / O 2 oder Luft bei 2-3%. </li><li> Nach der Induktion, Aufrechterhaltung einer Narkose in der Induktionsfeld und in der Abbildungskammer bei 1,5-2%. </li><li> Vor dem Start des Bildgebungssitzung, legen Sie die Speicherfolie in Position A, die zu einem Sichtfeld von 10 cm entspricht. Stellen Sie sicher, dass die richtige Position der Anästhesie Stellen und Tier, indem Sie einen Schlaf Tier in der Box. </li><li> Nehmen einige Fotografien bis Tier in der gewünschten Abbildungsstellung, in der FOV direkt unter der Kamera. </li><li> Bereiten Sie zwei Insulinspritzen mit je 100 ul der CTZ Arbeitslösung. </li><li> Legen Sie ein Tier auf der Bank und halten Sie sie schläft mit Hilfe einer Nasenkegel Bereitstellung Gasnarkose. </li><li> Bringen Sie die Nadel der Spritze in einem Ort umgebenden Katheter subkutan und spritzenCTZ gleichzeitig auf der Oberseite der Katheter. </li><li> Unmittelbar nach der Injektion, legen Sie das Tier auf der Warmhalteplatte in der Kamera Box und starten Sie die Bild Biolumineszenz Erwerb. </li><li> Erwerben aufeinanderfolgenden Scans mit Erfassungszeiten von 20 bis 60 s (abhängig von der Signalintensität), bis die maximale Signalintensität erreicht wird. Bei der Übernahme des nächsten Rahmens, messen Sie die BLI Signalintensität der zuvor erworbenen Rahmen, indem Sie einen ROI in jedem Katheter Trio und die Messung der Photonenfluss durch diese ROI. </li><li> Wiederholen Sie ab Schritt 7 für das nächste Tier (e). </li><li> Nach der Bilderzeugung zurück Tiere in ihren Käfig. Wiederholen BLI im Verlauf eines Experiments zur Längs, nicht-invasive Verfolgung von Biofilm-Bildung. </li><li> Analysieren Sie die BLI Daten mit Wohnzimmer Bild-Software. Legen Sie eine rechteckige ROI fester Größe auf jedem Katheter Trio und Messung der Photonenfluss (Ausstrahlung) durch jede ROI. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Tier. </li><li> Berichtdie BLI-Signal Intensität jedes Katheters Trio als Photonenfluss pro Sekunde. Stellen die BLI-Daten auf einer logarithmischen Skala, indem die Mittelwerte und Standardabweichungen von der Photonenfluss pro Sekunde für jede Gruppe. Statistische Analyse an den log 10 transformierten Daten. </li></ol> 9. Katheter Explantation <ol><li> Bereiten Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml PBS, eine für jede Kathetervorrichtung und halten sie auf Eis. </li><li> Euthanize die Tiere durch Genickbruch (2B) (1). </li><li> Desinfizieren Sie die Haut des Rückens mit 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol oder mit Jod Isopropanol (1%). </li><li> Einen Einschnitt (ca. 3 cm) über den Katheter. </li><li> Schneiden subkutane Gewebe und entfernen Sie den Katheter Fragmente eins nach dem anderen unter Verwendung einer sterilen Pinzette das subkutane Gewebe (2B, (2)). </li><li> Griff Katheter vorsichtig in vertikaler Position und waschen Sie ihn zweimal mit 1 ml sterilem PBS. Setzen Sie jeden KatheterStück in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen (hergestellt in Schritt 1). </li></ol> 10. Die Quantifizierung der Biofilm-assoziierte Zellen durch Koloniebildende Einheiten Count (KBE) und statistische Analysen der Ergebnisse <ol><li> Mit Ultraschall-Katheter zuvor in 1 ml PBS für 10 min bei 40.000 Hz in einem Wasserbad Beschallungsgerät platziert und sie auf Eis. </li><li> Nach der Ultraschallbehandlung kräftig für 30 Sekunden und Platz vortexen wieder auf Eis. </li><li> Bereiten Sie zwei weitere Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 ul PBS. </li><li> Achten 1:10 und 1: 100 Verdünnungen von Ihrem ursprünglichen Probe (die, die den Katheter enthält) und alle Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis zu halten. </li><li> Platte 100 ul der ursprünglichen Proben, 1:10 und 1: 100 Verdünnungen auf YPD-Agar-Platten in zweifacher Ausfertigung. </li><li> Inkubation erfolgt für 2 Tage bei 37 ° C und zählen KBE. </li><li> Zählen Sie die auf YPD-Agarplatten Kolonien (zählbare Menge von Kolonien, maximal 300 Kolonien / Platte) und multiplizieren Sie sie mit der richtigen DiluFaktors (1x-Original, 10x oder 100x Verdünnung). Ferner multiplizieren jedes Katheters Stück 10x, die der endgültigen Höhe der Kolonien in 1 ml Röhrchen mit dem Katheter entspricht. Bringen Sie die endgültige Höhe der Kolonien bis 10 Zellen / Katheterstück mit Standardabweichung (SD) anmelden. Express-Daten als Mittelwert ± SD. </li><li> Legen Sie alle Werte für jeden Katheters und spezifische Gruppe in eine Tabellenkalkulation und / oder statistischen Programms, um die oben erwähnten Berechnungen und statistischen Analysen durchzuführen. Geben Sie an, bestimmte Gruppen zu vergleichen, dh WT vs. Mutante oder 2 Tage vs. 6 Tage die Biofilmbildung und führen ungepaarter t-Test und ANOVA mit Tukey post-Test auf den log10-transformierten Daten. <ol><li> Express das Signifikanzniveau von einem p-Wert. In dieser Studie zeigen, Bedeutung, wenn p-Wert &lt;0,05, wie folgt vertreten: * p &lt;0,05, ** p &lt;0.005, *** p &lt;0,0005. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Verwendung von Tiermodellen und insbesondere Nagermodellen, für Studien zur mikrobiellen Biofilmen gewidmet ist sehr wichtig, da die Host-Immunsystem ist ein wesentlicher Faktor für die Bildung von Biofilmen, die in vitro-Modelle nicht erklären kann. In dieser Studie wurde eine relativ einfache subkutane C. beschreiben wir albicans Biofilm Mausmodell, die leicht in einem Forschungslabor angenommen werden kann und keine starke technische Fähigkeiten. Dieses Modell wurde ursprünglich en...

Candida albicans ist ein kommensalen Organismus, der an verschiedenen Stellen von gesunden Personen auf der Haut oder als ein Teil des Magen-Darm- und Vaginalflora gefunden werden kann, zum Beispiel. Jedoch bei stationär und insbesondere immungeschwächten Patienten kann es zu einer Vielzahl von Infektionen 1. In solchen Individuen, ermöglicht die Schwächung des Immunsystems Candida-Zellen in die Blutbahn zu verbreiten und die tieferen Gewebe eindringen verursacht lebensbedrohliche Infektionen. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von abiotischen Substrate wie zentralvenöse und Blasenkathetern kann künstliche Herzklappen und Gelenke eine Nische für Candida Anlage 2. Die Haftung an solchen Substraten ist eine Voraussetzung für die weitere Entwicklung von Biofilmen, die eine Schicht aus Hefe und Hyphenzellen in extrazellulären polymeren Material eingebettet darstellt, die hauptsächlich aus Polysacchariden. 2 C. albicans Katheter-assoziierte Infektionensind mit hohen Sterblichkeit verbunden. Ein allgemeines Merkmal von Biofilmen ist ihre verminderte Empfindlichkeit gegenüber bekannten Antimykotika, wie Azole 3,4. Nur neuere Klassen von Antimykotika, wie Echinocandine und liposomale Formulierung von Amphotericin B bewiesen gegen Katheter-assoziierten Infektionen 5-7 aktiv zu sein. Aufgrund der Biofilm Widerstandsfähigkeit gegenüber Antimykotika, therapeutische Ansätze sehr begrenzt, oft Katheterentfernung und die anschließende Austausch als alleinige Lösung führt. Die meisten unserer aktuellen Verständnis C. albicans Biofilmentwicklung aus in vitro-Untersuchungen über abiotischen Substrate wie Polystyrol oder Kunststoffen zur Herstellung von oben genannten Geräte, das heißt, Silikon, Polyurethan 2 verwendet. Diese Modelle sind schon recht weit fortgeschritten und versuchen, die Situation in vivo so eng wie möglich zu imitieren. Allerdings sind diese Systeme nicht den kontinuierlichen Blutfluss und t bedeutener das Immunsystem des Wirts. Dies führte zur Entwicklung von in-vivo-Modellsysteme, wie beispielsweise die Zentralvenenkatheter (CVC) Modell 8-10, der Prothesenstomatitis Modell orale Candidiasis 11 und einem Mausmodell für katheterassoziierten Candidurie 12. Zusätzlich C. albicans Biofilmentwicklung wurde in vivo an den Schleimhautoberflächen, wie sie aus der Scheide 13 und der Mundhöhle 14 untersucht. Unser Labor trug mit der Einrichtung einer subkutanen C. albicans Biofilm Modell, das auf dem Implantat von infizierten Katheters Stücke auf der Rückseite des Sprague-Dawley-Ratten 15 basiert. Dieses Modell wurde erfolgreich im Labor verwendet, um Biofilmanfälligkeit Fluconazol testen und Echinocandin Arzneimittel 5,16, um die Wirkung der kombinatorischen Behandlung von Diclofenac und Caspofungin 17 zu studieren. In jüngerer Zeit hat dieses System, angepasst zur Verwendung in BALB / c-Mäusen, 18,19. InVergleich mit anderen in-vivo-Modellen ist der Hauptvorteil dieser subkutanen Modell die Möglichkeit, mehrere Biofilmen pro Tier innerhalb des Lumens des Katheters implantiert Stücke entwickelt studieren. Um die Anzahl der Versuchstiere zu reduzieren, haben wir dieses Modell, um die Entwicklung von C studieren angepasst albicans Biofilme nicht-invasiv mit Hilfe Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) 18,19. Dieses Verfahren erwies sich als ein leistungsfähiges Verfahren, das verwendet werden kann, um Biofilme durch Messung der spezifischen BLI Signal an dem interessierenden Bereich (in diesem Fall der Bereich des implantierten Katheter) zu quantifizieren, die Vermeidung Tier zu opfern. Im Vergleich zu Bakterien, die sowohl das Gen als auch das für die Biolumineszenz-Reaktion erforderlich Substrat aufgrund der Einführung eines spezifischen lux-Operon 20 exprimieren kann, werden die meisten eukaryotischen Organismen, einschließlich C. albicans, sind abhängig von der heterologen Expression eines Luciferase-Gens in Verbindung mit derexterne Verabreichung eines spezifischen Substrats, wie D-Luciferin oder Coelenterazin 21. Wahrscheinlich aufgrund der Gegenwart der pilzlichen Zellwand und C. albicans Morphogenese, die intrazelluläre Abgabe des Substrats für die Luciferase-Enzym war eine Hauptaufgabe 21. Um dieses Problem zu lösen, Enjalbert et al. 22 entwickelt eine Spannung, wo ein synthetisches C. albicans codon-optimierte Version des Gens für das natürlich sezerniert Gaussia princeps Luciferase (Gluc) wurde zu der C verschmolzen albicans PGA59 Gen, verankert ein GPI-Zellwandprotein. Wegen der Anwesenheit von Luciferase in der Zellwand, könnte Probleme hinsichtlich der intrazellulären Verfügbarkeit des Substrats vermieden werden. Dieses spezielle System wurde verwendet, um oberflächliche Infektionen durch C. verursacht studieren albicans 22. Vor kurzem BLI wurde auch verwendet, um das Fortschreiten von oropharyngealen Candidosen und seine possibl folgene-Behandlung 23. Diese Ergebnisse unterstützen die Verwendung von BLI als vielversprechende Technik, um Infektionen, die durch frei lebende Zellen, sondern auch geräteassoziierte Infektionen verursacht studieren. In dieser Studie beschreiben wir die C. albicans Biofilmentwicklung auf Polyurethankatheterstücke in BALB / c-Mäuse und ihre Quantifizierung mittels BLI. Wir stellen ein ausführliches Protokoll der in vitro Besiedlung von Polyurethankathetern während der Dauer der Anhaftung, gefolgt von der Implantation in Mäuse und anschließende Entwicklung von Biofilmen in lebenden Tieren. Neben der Messung der BLI-Signal von der C emittiert albicans-Zellen, ermitteln wir die Kolonie bildenden Einheiten für den Vergleich mit der Standardtechnik zur Biofilmpilzbelastung Quantifizierung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Yeast extract granulated</td>
			<td style="width:199px;">Merck</td>
			<td style="width:113px;">MERC1.03753.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:199px;">Oxoid</td>
			<td style="width:113px;">LP037B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Agar granulated</td>
			<td style="width:199px;">Difco</td>
			<td style="width:113px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">D-(+)-glucose</td>
			<td style="width:199px;">Fluka</td>
			<td style="width:113px;">49159-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Prepared in the laboratory</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">R6504-1L</td>
			<td>Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">M1254</td>
			<td>MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">BBraun</td>
			<td style="width:113px;">CV-15703</td>
			<td>Polyurethane part cut into 1 cm pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:199px;">Fagron SAS, France</td>
			<td style="width:113px;">611139</td>
			<td>Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Duchefa Biochemie, The Netherlands</td>
			<td style="width:113px;">A0104</td>
			<td>Antibacterial prophylaxis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Ketamine 1000</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">804 119</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Domitor</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">134737-1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Antisedan</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">134783-2</td>
			<td>Reversal of anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Xylocaine gel (2%) - this is Linisol</td>
			<td style="width:199px;">AstraZeneca</td>
			<td style="width:113px;">352 1206</td>
			<td>Local anesthetic for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>To prevent drying and infection of eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Coelenterazine&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Prolume (Nanolight)</td>
			<td style="width:113px;">NF-CTZ-FB</td>
			<td>Light sensitive agent (must be kept in the dark)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodine isopropanol (1%)</td>
			<td style="width:199px;">3M&#8482; DuraPrep&#8482;&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Disinfectant for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.&#160;&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Cedium</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Disinfectant for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Cell counting chamber</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Insulin syringes (0.3 ml)</td>
			<td style="width:199px;">Terumo Myjector 29G</td>
			<td style="width:113px;">324826</td>
			<td>For injection of coelenterazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Electric razor</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Sterile surgical tools</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Heating pad</td>
			<td style="width:199px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">14042321474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Skin suture</td>
			<td style="width:199px;">Johnson&#38;Johnson</td>
			<td style="width:113px;">K890H</td>
			<td>Surgical thread, needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath sonicator</td>
			<td>Branson 2210</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">BLI camera (IVIS Spectrum)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Perkin Elmer, Alameda</td>
			<td style="width:113px;">IVISSPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Living Image software&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Perkin Elmer, Alameda</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>(version 4.2)&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging

Candida albicans Biofilm Entwicklung auf biotischen und / oder abiotischen Oberflächen stellt eine besondere Bedrohung für Krankenhaus-Patienten. Bisher C. albicans Biofilme überwiegend in vitro untersucht worden, aber es ist eine dringende Notwendigkeit für ein besseres Verständnis dieser Dynamik unter in vivo-Bedingungen. Wir entwickelten eine in vivo subkutanen Rattenmodell zu studieren C. albicans Biofilm-Bildung. In unserem Modell mehrere (bis zu 9) Candida infizierten Vorrichtungen zum Hinterteil des Tieres implantiert. Das gibt uns einen großen Vorteil gegenüber der zentralen Venenkatheter Modellsystem, da es erlaubt uns, mehrere unabhängige Biofilmen in ein Tier zu studieren. Vor kurzem hat dieses Modell, um C zu studieren wir angepasst albicans Biofilmentwicklung in BALB / c Mäusen. In diesem Modell reifen C. albicans Biofilme entwickeln innerhalb von 48 Stunden und zeigen die typische dreidimensionale Biofilmarchitektur. Die Quantifizierung von Pilz BiofilmTraditionell untersucht post mortem und erfordert Host Opfer. Da dies erfordert die Verwendung von vielen Tieren, um kinetische Untersuchungen durchzuführen, wandten wir nicht-invasiv Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) in Längsrichtung folgen in vivo reifen C. albicans Biofilme entwickeln in unserem Unterhautmodell. C. albicans-Zellen wurden entwickelt, um die Gaussia princeps Luciferasegen (Gluc) an die Zellwand gebunden auszudrücken. Die Biolumineszenz-Signal wird von der Luciferase, die das zugegebene Substrat Coelenterazin in Licht, das gemessen werden kann, wandelt hergestellt. Die BLI-Signal glich Zellzahlen aus explantierten Katheter erhalten. Nicht-invasive Bildgebung zur Quantifizierung von in vivo die Bildung von Biofilmen bietet sofortigen Anwendungen für das Screening und Validierung von Antimykotika unter in vivo Bedingungen, als auch für Studien, die auf Wirt-Pathogen-Interaktionen, hiermit einen Beitrag zu einem besseren Verständnising der Pathogenese der Katheter-assoziierten Infektionen.

In dieser Studie zeigen wir, das chirurgische Verfahren der Katheter-Implantat und Explantat während der in vivo C. albicans Biofilmentwicklung in einer Maus. Darüber hinaus zeigen wir die Quantifizierung der reife Biofilme nicht nur durch klassische KBE Aufzählung, sondern auch von BLI. Wie in 1A gezeigt, wurden nicht-phosphoreszierend Polyurethankatheter in Stücke von 1 cm geschnitten Vorrichtungen und anschließend mit Serum beschichtet. Dieser Schritt ist se...

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Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

12.9K Aufrufe.  Institute of Botany and Microbiology, VIB, KU Leuven. We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Serie: Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence imaging using IVIS Spectrum was employed to monitor the distribution and development of the tumor cells following the delivery procedure including DLIT reconstruction to measure the tumor signal and its location.
Development of metastatic lesions to the bone tissues triggers osteolytic activity and lesions to tibia and femur were evaluated longitudinally using micro CT. Imaging was performed using a Quantum FX micro CT system with fast imaging and low X-ray dose. The low radiation dose allows multiple imaging sessions to be performed with a cumulative X-ray dosage far below LD50. A mouse imaging shuttle device was used to sequentially image the mice with both IVIS Spectrum and Quantum FX achieving accurate animal positioning in both the bioluminescence and CT images. The optical and CT data sets were co-registered in 3-dimentions using the Living Image 4.1 software. This multi-mode approach allows close monitoring of tumor growth and development simultaneously with osteolytic activity.

An experimental mouse model of bone metastasis was established following intracardiac delivery of luciferase expressing mammary tumor cells. Tumor development and resulted osteolytic lesion were monitored longitudinally with bioluminescence and micro CT imaging.

Überwachung Tumormetastasen und Osteolysen mit Biolumineszenz und Micro-CT Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

Forschung

Medizin

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 months. It is critical to have suitable animal models to mimic the hemodynamic spread of the metastatic cells in the clinical scenario. Here, we are introducing the use of small animal ultrasound imaging to guide an accurate injection of brain tropical breast cancer cells into the left ventricle of athymic nude mice. Longitudinal MRI is used to assessing intracranial initiation and growth of brain metastases. Ultrasound-guided intracardiac injection ensures not only an accurate injection and hereby a higher successful rate but also significantly decreased mortality rate, as compared to our previous manual procedure. In vivo high resolution MRI allows the visualization of hyperintense multifocal lesions, as small as 310 &#181;m in diameter on T2-weighted images at 3 weeks post injection. Follow-up MRI reveals intracranial tumor growth and increased number of metastases that distribute throughout the whole brain.

A breast cancer brain metastasis mouse model is established with ultrasound imaging-guided intracardiac injection of MDA-MB231/Br-GFP cells. Development of multifocal intracranial metastases has been monitored longitudinally using high-resolution 9.4 T MRI.

Ultraschall-Imaging-guided Intra Injection zur Entwicklung eines Mausmodells von Brustkrebs Hirnmetastasen durch Längs MRI Gefolgt

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Akute Brain Trauma in Mäusen Gefolgt durch Längs Zwei-Photonen-Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Biolumineszenz-Bildgebung von einem immunkompetenten Tiermodell für Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...