Biz HeLa kültürleme ve transfeksiyon ona teknik destek için hNSCs hazırlanmasında yardımcı olmak için Julie Heward ve Lavaniya Thanabalasundaram kabul.

Üç Boyutlu (3D) Kültür 1. HNSC farklılaşması NOT: izole ve bir önceki yayında 2 açıklanan etik onaylanmış dokudan gelen, hNSCs elde. Bu prosedürü takip ederken etik ve kurumsal yönergeleri takip edin. 1.1) 3D Kültür 12-kuyu Plate Kullanımı <ol><li> Prosedür boyunca aseptik tekniği kullanın. Biyolojik güvenlik kabininde / göz% 70 etanol içinde 2 ml ilave etmek suretiyle yeniden hidrat iskeleleri sulama (WFIr) su kullanılarak hazırlanabilir. Her bir duvarı aşağı% 70 etanol dağıtarak iskeleleri dokunmaktan kaçının. </li><li> Dikkatle% 70 etanol aspire ve hemen 2 ml / DMEM ile iskeleleri yıkayın: 1 dakika F12. Iki kez yıkama işlemi tekrarlayın. Dikkatle DMEM aspire: F12 son yıkamadan sonra. </li><li> F12: DMEM laminin 2 mi / oyuk (10 ng / ml) ile kaplayın iskeleleri. % 5 CO2 uğultu 37 ° C &#39;de plaka inkübe2 saat içinde en az idified kuluçka makinesine kondu. Sıcak DMEM ile Plakayı: F12. </li><li> RMM + GF 150 ul bir hacim içinde, yaklaşık 500,000 hNSCs her iskelesi Seed. </li><li> Hücre iskeleleri yerleşmeye izin vermek için, bir% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 3 saat plaka inkübe edin. </li><li> Iskeleleri hücreleri çıkarmak için değil, her iyi alarak bakım RMM 3.5 ml ekleyin. </li><li> 7 gün boyunca plaka inkübe; 1 gün (birinci besleme) sonra (3.5 ml / çukur) ve RMM orta yerine tekrar birinci besleme 2-3 gün sonra yapıldı. </li><li> 7 gün sonra, ortam çıkarın ve immunositokimya (ICC) için% 4 paraformaldehit (PFA) ile hücrelerin saptamak ve / veya iyi bir toplam RNA ekstraksiyonu için, liziz reaktif maddesi 500 ul (≤ -80 ° C&#39;de saklayın levha veya toplam RNA ekstraksiyonu devam) . </li></ol> Akson Süreci kıbet 1.2) ölçümü <ol><li> % 4 PFA standart ICC protokolü 20 kullanılarak β göre farklılaştırılmış hNSCs sabit Leke3-tubulin (TUBB3) bir florokrom konjuge sekonder antikor ile belirlenmiştir birincil antikor. Hoechst (1 uM) ile Counterstain hücre çekirdekleri. </li><li> Bir floresan mikroskop kullanılarak β3-tubulin lekeli hücrelerin temsili görüntüler yakalayın; tiff veya jpeg olarak kaydedin. Bir yazılım ölçüm aracı (örn Resim-Pro Plus) kullanarak akson süreci akıbet Tedbir. </li><li> Görüntüyü, araç çubuğunda seçin ölçümler seçeneğini açın ve iz özelliğini seçin. </li><li> Izlemeyi başlatmak için, fare düğmesini tıklayarak akson akıbet üzerinde başlangıç ​​noktasını belirleyin. Akson büyümesinin tüm uzunluğu boyunca izini; Doğru, her iz bitirmek için tıklayın. Görüş alanındaki tüm akson outgrowthswith ölçmek için tekrarlayın. </li><li> Piksel veya mikron (beklemede kalibrasyon kurmak) gibi ölçümleri ifade eder. Örnek karşılaştırmalı ve istatistiksel analiz için bir elektronik tablo programı İhracat uzunluğu ölçümleri. </li></ol> 2. Mirna İfade bir Kök Hücreler kullanma veGelişim Yolları Odaklı miRNA PCR Dizisi 2.1) miRNA toplam RNA ekstraksiyon <ol><li> Iskeleleri ve 2D yetiştirilen numuneler üzerinde miRNA çıkarma gerçekleştirin (farklılaşmış ve farklılaşmamış, hNSC kontrolü). </li><li> Gerekirse Çözülme iskeleleri, 12 plaka takılı. Nihai hacim, liziz reaktif maddesi 1 ml aynı 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içinde 2 kuyu liziz reaktif içeriğini (500 ul) birleştirin. Kuyudaki iskele bırakmak özen gösterin. </li><li> Daha önce toplanan kuru hücre topaklandı 2D yetiştirilen numuneler (farklılaştırılmış hNSC 2D kültürleri ve farklılaşmamış kontrol) için parçalama reaktifi 1 ml ekleyin ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine içeriğini aktarmak. </li><li> Bir tane 1 ml&#39;lik şırınga ve bir tane kısa 20-25 ölçü iğne kullanılarak, her bir test örneği homojenize edilmiştir. Homojen bir lizat elde edilene kadar, 1 ml 5 kata kadar şırınga kullanılarak bir iğne içinden lizat geçirin. </li><li> Her bir Eppendorf tüpüne, kloroform ve 200 ul ilave edin ve güvenli bir kap. Invert ve vorteks tüpler içiniçerikleri karıştırmak. </li><li> Santrifüj ≥12,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca her biri 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içeren homojenat. </li><li> % 100 etanol içinde 750 ul ihtiva eden yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne (herhangi bir interfaz, pembe renkli bir sıvı geçişini engelleyecek) her numunenin üst sulu faz transfer. Tersine çevirerek iyice karıştırın. </li><li> 2 ml&#39;lik bir toplama tüpü içinde bulunan küçük bir kolon içine, bir çökelti de dahil olmak üzere, her bir test numunesinin 700 ul kadar Pipet. Oda sıcaklığında, yaklaşık 30 saniye boyunca ≥8,000 xg&#39;de kapak ve santrifüj kapatın. Flow-through atın. Numunenin geri kalan kullanarak bu adımı tekrarlayın. </li><li> 15 dakika boyunca bir DNA özet yapın. </li><li> ≥8,000 x g&#39;de yaklaşık 30 saniye için küçük bir sütun ve santrifüj 700 ul tampon RWT ekleyin. Flow-through atın. </li><li> 500 ul tampon RPE eklenmesi ve ≥8,000 x g, yaklaşık 30 saniye için santrifüjleme ile küçük bir sütun yıkayın. Flow-through atın. Tekrar wash.Ce1 dakika boyunca ≥12,000 xg&#39;de ntrifuge ayrıca membran kuru. </li><li> Mini kolonuna RNaz içermeyen su, 40 ul ilave edilmesi ve ≥8,000 x g, 1 dakika için santrifüjleme ile, 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içinde toplam RNA Zehir. Uygun bir spektrofotometre yardımıyla, total RNA konsantrasyonu ölçümü. </li></ol> 2.2) MiRNA cDNA hazırlanması <ol><li> Ters-transkripsiyon ana karışımı hazırlayın. Her numune 5x miScript Hispec tampon 4 ul, 10x Nucleics karışımı 2 ul gerektirir, 2 ul transkriptaz karışımı ters miScript. </li><li> PCR tüpü içinde ana karışımı kısım 8 ul toplam RNA (250 ng), gerekli hacmi ekleyin ve 20 ul bir son hacme kadar, RNaz içermeyen su ilave edin. </li><li> MiScript Ters Transkriptaz Mix inaktive etmek için 95 ° C&#39;de 5 dakika için 37 ° C.Incubate C&#39;de 60 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> -20 ° C de, her biri 20 ul ters transkripsiyon reaksiyonu deposu 200 ul RNaz içermeyen su ilave, ya da gerçek-ti ile devamBeni hemen PCR. </li></ol> 2.3) Kök Hücreler ve Gelişim Yolları miRNA PCR Array Odaklı <ol><li> 2x SYBR yeşil ana karışımı 1375 ul 100 ul MiRNA cDNA hazırlanmasını 10x miScript Evrensel Primer 275 ul ve RNase-barındırmayan su ile (toplam hacim 2750 ul) 1000 ul ekleyerek 15 ml tüp içinde, PCR parçaları karışımı hazırlayın. </li><li> PCR yükleme rezervuar üzerinde PCR bileşenleri karışımını aktarın. Dikkatlice kapalı çantasından 96-plaka PCR dizisini kaldırmak. </li><li> 8 kanallı pipet ya da sadece 8 uçları kullanılarak için 12 kanallı bir pipet kullanılarak, PCR dizisi, her sıra için 25 ul PCR bileşenleri karışımını ekleyin. Kuyular arasındaki çapraz bulaşmayı önlemek için her pipetleme adımı aşağıdaki pipet ipuçlarını değiştirin. </li><li> Kabarcıklarını çıkarmak için oda sıcaklığında (15-25 ° C) 1,000 xg&#39;de 1 dakika için optik yapışkan film ile plaka ve santrifüj kapatın. Görme kabarcıklar kuyularda mevcut sağlamak için alttan plaka kontrol edin. </li><li> Gerçek zamanlı döngüleyici içinde 96 çukurlu levha PCR dizisi yerleştirin. </li><li> Programı buna uygun olarak gerçek zamanlı cycler: 10 dakika ve 95 ° C&#39;de 15 saniye, 45 döngü ve 60 ° C&#39;de 1 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 1 döngü, tek bir (floresans veri toplama) ayarlayın. </li><li> PCR Dizi Veri Analizi Şablon Excel ve web tabanlı yazılım ile kullanılmak üzere boş bir Excel elektronik tüm kuyuları için Ct değerleri verin. NOT: Yazılım mevcuttur <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. Hesaplamalı Analiz miRNA Hedef Tahmin ve Hedef mRNA&#39;larının Doğrulama Reporter plazmid Transfaksiyon ve Ddual Lüsiferaz Testi tarafından. 3.1) miRNA Hedef Tahmin Hesaplamalı Analizi <ol><li> Araştır PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21, miR tanımlanması için online bulunabilirlik algoritmaNA tahmin mRNA&#39;ları hedef. </li><li> &quot;Omurgalılar üzerinde PicTar tahmini için tıklayınız&quot; üzerine tıklayın. Yeni bir sayfa açılacaktır. </li><li> Yeni sayfa, PicTar web arayüzünde, açılan menüde türleri seçmek ve miRNA Kimlik kutusuna ilgi miRNA yerleştirin. Bir miRNA hedefler için arama tıklayınız. </li><li> APicTar skoru göre sıralanmış hedef mRNA&#39;ların bir listesini gözlemleyin. NOT: PicTar verilen UTR seçilmiş miRNA tarafından hedeflenen, ve tohum tamamlayıcılık, termodinamik ve birlikte ifade miRNA&#39;lar 22 setleri ortak hedefler için bir birleştirici tahmine dayalı olacağı olasılığını yansıtan bir puan hesaplar. </li><li> Benzer DIANA-LAB (kullanarak hedef mRNA&#39;ların listesini almak <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23, ve TargetScan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> mevcut hat üzerine) 24, alternatif algoritmaları. </li><li> M karşılaştırmalı tablo DerlemeiRNAs farklı yazılım araçları kullanılarak elde edilen sıralama dayalı. PicTar toplam PCT tarafından ve TargetScan (gürültü oranı ve tahmin sonuçların önemi değerlendirilmesi için bir hassas skoru sinyaline dayalı) hassasiyet ile skoru, DianaLab tarafından rütbeleri (tohum tamamlayıcılık, bağlayıcı termodinamik serbest enerji, koruma üzerinde dayalı Farklı türler), Tablo 1. </li></ol> Muhabir Plazmid Transfaksiyon ve Çift Lusiferaz Testi tarafından hedef mRNA 3.2) Doğrulama. NOT: mRNA olmuştur hedefin doğrulanması için 3 &#39;UTR lusiferaz gazetecilere daha önce 25 nitelendirdi. <ol><li> Transfeksiyon <ol><li> / Oyuk, 24 oyuklu bir plaka içerisinde 10 5 hücre yoğunluğunda Tohum HeLa hücreleri. </li><li> Transfeksiyon tepkin maddesi ve NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTR, plazmid, 100 ng ya da 1.5 ul, aynı zamanda, 20 nM MiRNA taklit (SOX5 3 hsa-miR-96-5p ile 24 saat, ko-transfeksiyonu HeLa hücrelerinde sonra217; Oyuk başına UTR ve hsa-miR-7-5p ve sırasıyla NR4A3 3 &#39;UTR için hsa-miR-17-5p). </li><li> NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmid ve florokrom etiketli negatif kontrol siRNA&#39;lar ile birlikte transfekte edilmesi, kontrol kuyuları. florokrom etiketli negatif kontrol siRNA&#39;lara kontrol kuyuları transfeksiyon transfeksiyon verimliliği değerlendirmeyi sağlar ve taklit miRNA 3&#39;UTR bağlama özgüllüğü hesapları. </li></ol></li><li> Çift Lusiferaz Faaliyetlerinin Ölçülmesi <ol><li> Firefly ve Renilla lusiferaz faaliyetlerinden 24 saat sonrası transfeksiyon ölçün. Hücre büyüme ortamı çıkarın. </li><li> 10 Çözüm I ml içine substrat ben 50 ul ekleyerek çözüme I çalışma hazırlayın; iyice karıştırın. Ben de her 24 içine çözüm çalışma 300 ul ekleyin. </li><li> Iyi bir 96 beyaz plaka 3 kuyuları, her ul 100 içine her 24 içeriğini aktarmak. 10 dakika bekleyin ve ışıldama edinimi için luminometre sette Ateşböceği lusiferazı ölçmek. </li><li> Çalışma solut hazırlayıniyon II çözeltisi II 10 ml alt-tabaka II 50 ul ekleyerek; iyice karıştırın. Zaten çalışma çözeltisi I 100 ul ihtiva eden her 96 oyuğuna hazır çözelti bir 100 ul ekle </li><li> 10 dakika bekleyin ve ışıldama edinimi için luminometre seti Renilla lusiferaz ölçmek. Renilla lusiferaz Firefly lusiferaz gelen ışıma oranını hesaplayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tissue+repair+and+regeneration.">Stem cells in tissue repair and regeneration.</a> J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).</li><li>Pollock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditionally+immortal+clonal+stem+cell+line+from+human+cortical+neuroepithelium+for+the+treatment+of+ischemic+stroke.">A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke.</a> Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).</li><li>Hodges, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+stem+cell+lines+suitable+for+transplantation.">Making stem cell lines suitable for transplantation.</a> Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).</li><li>Smith, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+site+and+lesion+topology+determine+efficacy+of+a+human+neural+stem+cell+line+in+a+rat+model+of+chronic+stroke.">Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke.</a> Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).</li><li>Stroemer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+stem+cell+line+CTX0E03+promotes+behavioral+recovery+and+endogenous+neurogenesis+after+experimental+stroke+in+a+dose-dependent+fashion.">The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion.</a> Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).</li><li>Kalladka, D., Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+repair:+cell+therapy+in+stroke.">Brain repair: cell therapy in stroke.</a> Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+miRNA-mediated+reprogramming+of+mouse+and+human+somatic+cells+to+pluripotency.">Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).</li><li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity.">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction.">The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).</li><li>Buxboim, A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+feel+the+difference.">Stem cells feel the difference.</a> Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).</li><li>Li, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+nanofibrous+scaffold+for+cartilage+tissue+engineering+using+human+mesenchymal+stem+cells.">A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Ortinau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).</li><li>Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+synthetic+materials+to+control+stem+cell+phenotype.">Designing synthetic materials to control stem cell phenotype.</a> Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).</li><li>Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alvetex(R):+polystyrene+scaffold+technology+for+routine+three+dimensional+cell+culture.">Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsion-+templated+porous+polymers+as+scaffolds+for+three+dimensional+cell+culture:+effect+of+synthesis+parameters+on+scaffold+formation+and+homogenity.">Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity.</a> J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+device+enabling+three-dimensional+cell+growth+and+improved+cell+function.">Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function.</a> Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).</li><li>Stevanato, L., Sinden, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+microRNAs+on+human+neural+stem+cell+differentiation+in+two-+and+three-dimensional+cultures.">The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).</li><li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+synapses:+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number.">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li><li>Chen, K., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+selection+on+human+microRNA+binding+sites+inferred+from+SNP+data.">Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data.</a> Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).</li><li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microRNA+target+predictions.">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li><li>Maragkakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+microRNA+target+prediction+correlates+with+protein+repression+levels.">Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels.</a> BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).</li><li>Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+seed+pairing,+often+flanked+by+adenosines,+indicates+that+thousands+of+human+genes+are+microRNA+targets.">Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.</a> Cell. 120 (1), 15-20 (2005).</li><li>Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+targets+of+human+micrornas+with+the+LightSwitch+Luciferase+Assay+System+using+3'UTR-reporter+constructs+and+a+microRNA+mimic+in+adherent+cells.">Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Ponnio, T., Conneely, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nor-1+regulates+hippocampal+axon+guidance,+pyramidal+cell+survival,+and+seizure+susceptibility.">nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility.</a> Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).</li><li>Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+cell+cycle+progression+in+neural+progenitors+by+interfering+with+the+WNT-beta-catenin+pathway.">SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway.</a> EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).</li><li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+postmitotically+regulates+migration,+postmigratory+differentiation,+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons.">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li><li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes.">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li></ol>

Tüm yazarlar çalışanlar, hisse senedi ve / veya ReNeuron Ltd veya ana şirket hisse senedi opsiyon sahipleri vardır. Bu çalışma ReNeuron (RENE.L) tarafından desteklenmiştir.

değerlendirmek ve kök hücrelerin farklılaşmasını geliştirmek için in vitro deneylerde yeni gelişme her zaman işlevleri ve terapötik yetenekleri soruşturma için bir meydan okuma sunmuştur. Uzun vadeli ve in vitro farklılaştırma denemesinde sağlam bir 3D gelişimi için gerekli hNSCs istikrarlı eki, malzeme ve yapıların vadede farklı özelliklere sahip birkaç 3D yüzeylerde test hitap etti. Tahlil gelişmenin bir parçası olarak biz de optimum hücre ekim konsantrasyonunu değerlendirildi ve iskeleler laminin kaplı olması gerekliliğini tespit. Bizim hNSCs kendiliğinden üzerine ayırt rağmen standart 2D farklılaşmış hNSCs göre akson işlemi büyümesinin ile ölçüldüğü gibi 4-OHT ve büyüme faktörü kaldırılması, 3B, kültür sisteminin uygulanması farklılaşma kabiliyeti açısından önemli bir gelişme gösterdi. 3D bağlı differe etkisini araştırmak içinhNSC MiRNA ifadesi üzerindeki ntiation bir PCR dizisi kullanılır. Standart çip mikroarray ile karşılaştırıldığında PCR dizi ilgi miRNA doğrudan ölçümü ve doğrulama avantajlar sunuyor. PCR dizisi, 96 burada daha az, örneğin dizi başına miRNA toplam sayısının vadede sınırlı olsa da, daha önce kök hücre gelişme rapor eden durumunda özellikle ilgi miRNA&#39;lar dahil etmek uygun olabilir. yolu odaklı miRNA&#39;lar ifade farklılaşmamış hNSCs ile karşılaştırıldığında 3D ve 2D farklılaşmış hNSCs profilli edildi. En önemli ölçüde aşağı-regüle miRNA&#39;lar seçilmiş ve çevrimiçi mevcut algoritmaları (DIANA Lab, PicTar ve TargetScans) kullanarak işlevselliğini ve biyolojik yorumunu belirlenmesi amacı ile kendi varsayılan hedef mRNA&#39;ları değerlendirmek için analiz edildi. Tek bir miRNA&#39;ların hedeflerinin yüzlerce kabul edilebilir ve bu nedenle, bir uygun aday olabilir 3 &#39;UTR mRNAsthat ile MiRNA etkileşimleri doğrulanmışxonal düzenleme. NR4A3, HSA miR-7, ve miR-17 ailesinin bir hedef, hipokampal akson farklılaşma, hayatta kalma, apoptoz ve düzenlenmesinde rol olan, ifade düzeylerine bağlı olarak NR4A aile nükleer reseptörlerin bir üyesi olan Rehberlik 26. Benzer SOX5, hsa-miR-96 hedef, sinir atalarıdır 27 akson uzunluğu 28, göç, post-göçmen farklılaşma ve nöronların 29 projeksiyonları hücre döngüsü ilerlemesini kontrol etmek bildirilmiştir. SOX5 ve NR4A3 Hem hsa-miR-96 doğrudan bir hedef mRNA olarak tanımlanan ve çift lusiferaz raportör tahlilleri sırasıyla hsa-miR-7 ve 17 edildi. Çift lusiferaz (Firefly ve Renilla) aynı plazmid iki farklı muhabiri genler dayanır ve optimal transfeksiyon ve tek lusiferaz plazmid sistemi ile karşılaştırıldığında sitotoksik etkileri nedeniyle etkileri normalleşme sağlayan geliştirilmiş bir sistem sunmaktadır. Bizim tahlil gelişmenin bir parçası olarak biz de transfeksiyon conditi optimizesırayla ons yüksek verim elde etmek. protocolsdescribed bundan başka, en iyi duruma getirmek ve ön klinik çalışmalarda ve gelecekte yapılacak klinik uygulamalarda intransplantation protokolleri beimplemented olabilir, in vitro hNSC farklılaşma karakterize etmek için yararlanılabilir.

Kök hücre araştırmaları da doku mühendisliği, gelişimsel hücre biyolojisi, hücresel tedavilerin, gen terapisi disiplinleri yayılan rejeneratif tıp, merkezi bir rol oynar, ve biyomalzemeler (iskeleleri ve matrisler). Kök hücreler, hem Organ GELİŞTİRME doku onarımında önemli; Kök hücreler nasıl çalıştığını anlamak, yeni kök hücre tabanlı tedaviler 1 geliştirmek için çok önemlidir. CTX0E03 birinci trimester insan fetal korteks izole bir klonal, şartlı ölümsüzleştirdi insan nöral kök hücre (hNSC) hattı 2. CTX0E03 iyi imalat uygulamaları (GMP) 3 altında klinik hücre bankacılığı için gerekli olan kalite özellikleri tanımlamıştır. HNSCs kendiliğinden nöronlar, glia, ve oligodentrositlere ayırt edebilir ve fokal iskemi 2,4,5 bir kemirgen modelinde nakledilen zaman nörolojik iyileştirmek için kanıtlanmıştır. CTX0E03 hNSCs inme disabil için klinik deneylerde şu andaSığ (NCT01151124 6 ve NCT02117635, Clinicaltrials.gov). MiRNA uzunluğunda ortalama 22 nükleotid bulunacaktır ve düzenleyici moleküller 7 kanıtlanmış, onlar proteinleri kodlamak değil, daha ziyade proteinler onların istikrar ve çeviri düzenleyen, mRNA 3 asal çevrilmemiş bölge (3&#39;UTR) bağlamak. MiRNA&#39;lar geliştirme, proliferasyon ve farklılaşma 8 de dahil olmak üzere, hücresel süreçlerin bir dizi düzenlenmesinde rol bildirilmektedir. Birkaç miRNA&#39;ların nöral kök hücrelerin 9 kaderi ve şartname düzenleyen suçlanmıştır. Standart kültür ortamı, iki boyutlu (2D) in vivo ortamda karmaşıklığı uyumlu değildir, ve bu nedenle hNSC farklılaşmasının indüksiyonu ve ayarlama optimal değildir. İn vivo koşullarında, hücreler, diğer oluşan bir üç boyutlu (3D) mikro-ortamı tarafından çevrelenmiştir dahil olmak üzere birçok hücre ve hücre-dışı ligandlarkollajenler, laminin, ve diğer matris proteinleri (hücre dışı matris ECM) türleri. Önceki çalışmalar rapor olduğunu ECMs ve onların geometri etkisi, hücre fenotipi ve kader 10-15 taklit malzeme mimari topoğrafyası. Piyasada mevcut 3D iskelelerinin bir dizi vardır; Biz hücreleri istila ve 16-18 ayırt edebilirsiniz içine bir 3D alan sağlayan bir 200 mikron kalınlığında zarı içine iyi tanımlanmış ve düzgün mimarisi ile tasarlanmış bir çok gözenekli polistiren iskelesi kullanılır. Burada 2D ve 3D farklılaşma deneyleri axonprocess gelişimini değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, daha da farklılaşma üzerinde miRNA etkilerini araştırmak için bir klinik sınıf hNSC hattının miRNA ifade profil bir yöntem açıklanmaktadır. gösterilen burada yöntem orjinal 19 açıklananlara dayanmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM:F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>For RMM medium preparation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Albumin Solution&#160;</td>
			<td>Baxter health care limited&#160;</td>
			<td>1501052</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 0.03%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transferrin, Human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putrescine DiHCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 16.2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin, Human recombinant&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6149</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 60 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-24</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Selenite&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">bFGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-188</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-OHT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>AMS Biotech</td>
			<td>3400-010-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypZean/EDTA</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>BE02-034E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water for irrigation</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>UKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alvetex 12 well plate&#160;</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1.00986.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;III tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Development &#38; Differentiation miScript miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen/ SABiosciences</td>
			<td>MIHS-103Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480 white 96 plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480&#160; sealing foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector NR4A3 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT019538-MT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector SOX5 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT017632-MT01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen).</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>1027284</td>
			<td>MiRNA transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luc-Pair miR Luciferase Assay</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>LPFR-M010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lightcycler 480&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GloMax 96 microplate luminometer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes

Nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) Yerel mikroçevrelerde altında nöronlar, astrositler ve oligodendrositler kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahiptirler. Burada, şu anda inme sakatlık (NCT01151124 ve NCT02117635, Clinicaltrials.gov) için klinik çalışmalarda, üç boyutlu (3D) farklılaşma ve klonal insan nöral kök hücre (hNSC) hattının miRNA analizi için kullanılan yöntemlerin bir dizi sunuyoruz. HNSCs etik onaylanmış ilk trimester insan fetal korteks türetilen ve koşullu inşa c-mycER TAM tek bir kopyasının retroviral entegrasyonu kullanılarak ölümsüzleştirdi edildi. Biz 3D iskeleler ve nasıl PCR dizi kullanarak miRNA ifade ilişkilendirilmiş değişiklikleri ölçmek için farklılaştırılmış hNSCs akson süreci akıbet ölçmek için nasıl açıklar. Ayrıca biz miRNA varsayılan hedefleri seçme amacıyla hesaplama analiz örnek. SOX5 ve NR4A3 önemli ölçüde seçilen uygun miRNA varsayılan hedef olarak belirlenmiştir aşağı-regülefarklılaşmış hNSC d miRNA&#39;ların. MiRNA hedef doğrulama çift raportör plazmid transfeksiyon ve çift lusiferaz deneyi ile SOX5 ve NR4A3 3&#39;UTRs gerçekleştirilmiştir.

Şekil 1 geleneksel düz bir yüzey kültürleri (2D) ile karşılaştırıldığında 3D iskelelerde hNSC farklılaşma soruşturma ve miktarının görsel ve akson süreci akıbet ölçümleri expressedas edilir. Şekil 2&#39;de representedthe iş akışı ve kök hücrelerini kullanarak miRNA ölçümü sonuçları ve gelişimsel yollar farklılaşmamış kontrol ile karşılaştırıldığında 2D ve 3D farklılaşmış hNSCs içinde miRNA&#39;lar diferansiyel ifadesini araştırmak için miRNA PCR dizi duruldu. Farklılaşmış ve farklılaşmamış hNSCs ve hedef tahmini, SOX5 ve NR4A3 (NOR1) için hesaplama analiz arasındaki aşağıdaki miRNA karşılaştırmalı analizi, farazi hedef mRNA&#39;lara olarak tespit edilmiştir. MiRNA&#39;lar ve SOX5 veya NR4A3 3&#39;UTR dizisini birini içeren 2 piyasadan temin plazmidler ateş böceği lusiferaz raportör geninin aşağısında eklenen kullanılan 3&#39;UTR mRNA, kendi varsayılan site arasında doğrudan etkileşim incelemek için bir<html> nd normalleştirilmesi için aynı plazmid Renilla lusiferaz geni ihtiva eden. 3 &#39;UTR, lusiferaz aktivitesinin aşağı doğru düzenlenmesi için temsili sonuçlar Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> Şekil 1:. 3D iskelelerde hNSCs farklılaşması ve akson sürecin es akıbet ölçümü (A) β3-tubulin (yeşil) ve Hoechst (mavi) temsil mikrofotoğraflarından ile zıt çekirdekleri için standart ICC boyama sonrasında elde edildi ve akson süreçlerinin ölçümü vardı Bir görüntü analizi yazılımı yardımı ile gerçekleştirilir. (B) 1 (1W) veya 3 hafta (3W) için 2D ve 3D farklılaşmış hNSCs yapılan akson süreci akıbet ölçümü raporlama Diyagramları.com / files / ftp_upload / 52.410 / 52410fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> Şekil 2:. Farklılaşmış hNSCs içinde MiRNA profil şematik akışı Toplam RNA, miRNA&#39;ların de dahil olmak üzere, 3 boyutlu iskeleler ve standart 2B kültürleri veya farklılaşmamış kontrolü farklı hNSCs birinden ekstre edilmiştir. Toplam RNA 250 ng retro transkripsiyonu insan hücre farklılaşması ve geliştirme miScript miRNA PCR dizisi ile miRNA ölçümü için uygun cDNA içine olgun miRNA&#39;lar seçici dönüşüm kolaylaştıran bir yöntem vardı. SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A ve RNU6-2 jeo-ortalama 2 -ΔΔct yöntemine dayalı veri analizi için kullanılmıştır. Önemli değişiklikler sta kadar katlayın +/- 1.5 ve aşağı düzenleme olarak tanımlandıistatistiksel olarak anlamlı ölçüde. Veriler clustergram olarak ifade edilmiştir Sonuçlar mevcut web tabanlı yazılım kullanılarak analiz edildi. Şekil 3 19 den Modifiye. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> Şekil 3: miRNA hedef Doğrulama çift lusiferaz rapor deneyi kullanılarak mRNA öngördü. (A) miRNA doğrudan hedef olarak 3&#39;UTR sekansı doğrulamak için bir araç olarak kullanılabilir çift lusiferaz raportör plasmidinin Örnek diyagramıdır. (B) transfeksiyon verimini gösteren Temsilcisi mikroskobu. (C) &#160; Sinyaller, insan 3 ve # ile ilgili, olan nisbi lusiferaz aktivesi olarak ifade39 UTR muhabirleri ofSOX5 ve NR4A3 genleri önemli ölçüde hsa-miR-96 varlığında yıkıldı ve hsa-miR-7 ve 17 miRNA taklit sırasıyla. Şekil 5 19 den Modifiye. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> Hedef gen </td><td> Hedef siteleri / genler bulundu </td><td> Hassas </td><td> Gol </td><td> Agrega P CT </td></tr><tr><td> hsa-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;td&gt; 0.94 </td></tr><tr><td> hsa-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> hsa-miR-302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> hsa-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> hsa-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; hsa-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> hsa-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0.63 + 0.37 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> Tablo 1: miRNA hedef tahmin mRNA&#39;sından listesi. MiRNA&#39;ların Temsilcisi tablo, öngörü genleri hedef ve algoritmalar analizi (tahminiyon / Skor / agrega sırasıyla Diana Lab, PicTar ve TargetScan kullanılarak sağlanır). Tablo 3 19 den Modifiye.

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes at JoVE.com

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.8K Görüntüleme.  ReNeuron. With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Video: Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Gelişim Biyolojisi

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

Kültürlü insan Fetal beyin sinir kök hücreleri Zika virüs enfeksiyonu Immunocytochemical analiz için

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...