İnsan embriyonik kök hücreleri nöral progenitor hücreleri ve daha sonra nöron astrosit ve oligodendrocyte içine ayırt etmek için indüklenebilir. Ancak, insan embriyonik kök hücreleri için tip kültür yöntemi ve nöral progenitor hücrelere farklılaşma çok verimsiz ve açık in vivo co-kültür sistemi Burada kolayca insan embriyonik kök hücreleri ile yüksek yoğunluklu tek hücre tipi kültür kullanılarak ölçeklenebilir gelişmiş ve sağlam bir kültür sistemi saiyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinin tek hücre tipi kültürü, nöral progenitor hücreleri ve ek nöral soyların daha sonraki farklılaşması da dahil olmak üzere çeşitli ve farklı farklılaşmış soylar boyunca çok adımlı farklılaşmayı düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için hızlı ve verimli bir sistem sağlar.
İnsan embriyonik kök hücre nitelikli bodrum membran matris kaplı plakalar hazırlayarak başlayın. En az 2-3 saat veya bir gecede dört santigrat derecede bodrum membran matris çözeltisini yavaşça eritin. Çözüldüğünde, matrisi soğuk DMEM/F-12 ile %2 oranında seyreltin ve altı kuyulu bir plakanın her kuyusunu seyreltilmiş çözeltinin bir mililitresi ile kaplayın.
Kaplamalı tabakları oda sıcaklığında en az üç saat veya bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. İnatzar matriksüzerinde yetişen koloni tipi H9 insan embriyonik kök hücrelerinbesleyicisiz kültürlerini geçişiçin, kuyulardan ortayı aspire edin ve bir mililitre DPBS ile bir kez yıkayın. Her kuyuya bir mililitre Dispase çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Dispase çıkarın ve yavaşça dMEM/ F-12 iki mililitre ile bir kez hücreleri yıkayın. Yıkadıktan sonra ortayı çıkarın ve her kuyuya iki mililitre DMEM/F-12 ekleyin. Kolonileri yukarı ve aşağı borularla yavaşça ayırın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Tüpü 370 kez g'de iki dakika santrifüj edin. Orta aspiratör. Daha sonra hücre peletlerini iki mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyerek ve 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırarak tek bir hücreye ayırın.
Santrifüj'u tekrarlayın ve ayırma çözümlerini çıkarın. mTeSR-1 insan ESC ortamındaki hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak yeniden askıya alın. Koloni tipi insan embriyonik kök hücrelerini tek bir hücre tipi kültüre uyarlamak için, 10 mikromolar ROCK inhibitörü içeren iki mililitre mTeSR-1'deki bodrum membran matris kaplamalı plakanın her bir kuyusuna yaklaşık 1,5 ila iki milyon hücre yerleştirin.
24 saat sonra, rock inhibitörü olmadan taze mTeSR-1 ile orta değiştirin. Hücrelerin günlük ortamı değiştirerek üç gün boyunca tek bir hücre tipi olarak büyümesine izin verin. Dördüncü gün, ayırma çözeltisi hücreleri ayırmak ve daha önce açıklandığı gibi onları yeniden plaka.
Hücreleri el yazması talimatlara göre yeniden suladıktan ve kuluçkaya yattıktan sonra, küçük embriyonik bedenleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın, dibe yerleşin ve bir pipetle ortamı nazikçe çıkarın. EB ortamına aktarın ve yedi gün boyunca düşük ek tabaklarda genişletmelerine izin verin. Nöral progenitor hücre veya NPC farklılaşmasını sağlamak için, tek hücre tipi insan embriyonik kök hücrelerini bir mililitre ayırma solüsyonu ile ayırın ve 10 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Hücreleri 370 kez g iki dakika santrifüj edin. Ayırma çözeltisini süpernatant'ı çıkarın. Daha sonra DMEM/F-12'deki hücreleri yeniden askıya alın.
Bir bodrum membran matris üzerinde plaka 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile mTeSR-1 iki mililitre de beşhücre başına iki kez 10 bir yoğunlukta altı iyi plaka kaplı. 24 saat sonra, bir mikromolar Dorsomorphin ve beş mikromolar SB431542 ile takviye nöral indüksiyon ortamı ile kültür ortamı değiştirin. Nöral indüksiyonun ilk dört günü boyunca her gün orta yı değiştirin, sonra yedinci günde biraraya gelene kadar her gün.
Nöral indüksiyon yedi gün sonra, ayırma çözeltisi bir mililitre ekleyerek hücreleri ayırmak ve 37 santigrat derece 10 dakika kuluçka. Hücreleri 370 kez g'de santrifüj edin ve ayırma solüsyonunu süpernatant olarak çıkarın. Bir mililitre NPC genişletme ortamı ekleyin ve hücreleri yavaşça tekrar askıya almak için yukarı ve aşağı pipetler ekleyin.
Sonra taban membran matris altı iyi plakalar kaplı NPC genişleme aracı iki mililitre de başına beşhücre başına bir kez 10 plaka. Kültürler ilk üç ila dört pasajda 10 mikromolar ROCK inhibitörü ekleyerek %90 biraraya geldiğinde hücreleri gerektiği gibi iletin. Genişletme sırasında ortamı her gün değiştirin.
PLO laminin kaplı plakalar hazırlamak için, PBS veya su plo stok çözeltisi mililitre başına 10 mikrogram nihai konsantrasyonseyreltmek, iyi karıştırın, sonra çözeltinin bir mililitre ile altı kuyuplaka her iyi kat. Plakaları en az iki saat boyunca 37 derecede veya bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, her kuyuyu PBS ile yıkayın ve paltodan hemen sonra her kuyuda el yazması talimatlara göre hazırlanan bir mililitre laminin çözeltisi ile yıkayın.
Plakaları bir haftaya kadar dört derecede tutun. NPC'leri dopaminerjik nöronlara ayırmak için, NPC genişleme ortamındaki FKÖ laminin kaplı kaplanmış tabaklarda 24 saat sonra yaklaşık %50 yoğunlukta hücreleri plakalayın, ortayı DA1 olarak değiştirin ve bundan sonraki her gün ortayı değiştirin. Kültürleri biraraya geldiklerinde geçiş için, hücreleri bir mililitre ayırma çözeltisi ile ayırın ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Sonra 370 kez g onları santrifüj ve ayırma çözeltisi supernatant kaldırın. PLO laminin kaplı altı kuyulu plakalar üzerinde orta iki mililitre de DA1 orta ve plaka bir mililitre hücreleri bir mililitre ve plaka bir kez 10. NPC'leri astrositlere ayırmak için, FKÖ laminin plakaları üzerindeki hücreleri ve NPC genişleme ortamını %50 yoğunlukta plakalayın ve 24 saat sonra ortayı astrosit ortamına dönüştürün ve hücreleri daha önce açıklandığı gibi iletin.
Koloni tipi insan embriyonik kök hücreleri tek hücre tipi kültüre uyarlandığında, hücreler yüksek yoğunlukta muhafaza edilebildiği, daha sonra biraraya geldiğinde kolayca ve verimli bir şekilde alt kültürlühale getirildi. Bu hücreler kısa bir G1 fazı ve S fazı hücrelerinin yüksek oranda gibi koloni tipi insan embriyonik kök hücrelerintipik hücre döngüsü özelliklerini korudu. Kantitatif PCR analizi de koloni tipi hücrelerinkilerle karşılaştırılabilir seviyelerde ESC belirteçleri ifade doğruladı.
Ayrıca, tek hücreli insan embriyonik kök hücrelerinin her üç mikrop katmanından hücreler içeren embriyoid cisimler oluşturabildiği gösterilmiştir: endoderm, mezoderm ve ektoderm. Daha sonra, tipik insan embriyonik kök hücre morfolojisi ve NPC morfolojisinin görünümü nde belirtildiği gibi, tek hücre tipi insan embriyonik kök hücrelerinin npc'lere etkin bir şekilde farklılaştırdığı gösterilmiştir. Farklılaşma, imza NPC belirteçlerinin artan ekspresyonu ile desteklenmiş ve immünostaining ve FACS analizi ile doğrulanmış.
Aynı analiz aynı zamanda hücrelerin %90'ından fazlasının SOX1, PAX6 ve NCAM proteinleri için pozitif olduğunu göstermiştir. Ayrıca, türetilmiş NCD'ler karakteristik morfolojileri ve soya özgü belirteçlerin ekspresyonu ile belirtildiği gibi dopaminerjik nöronlar ve astrositler ayırt başardık. Bu prosedürü denerken, sağlıklı, farklılaşmamış insan embriyonik kök hücre kültürünü korumak için insan embriyonik kök hücrelerini yüksek yoğunlukta kaplamak esastır.
Bu protokol, temel çalışma, ilaç taraması ve nörodejeneratif tıpta uygulama için ölçeklenebilir olacak ata ve farklılaştırılmış hücrenin basit, sağlam ve ölçeklenebilir üretimi için bir platform sağlar.
