Bu çalışma, Avrupa Projesi BRIANBOW (FP7- Genç kaşifler tarafından desteklenen, yazarlar yazının yararlı yorumlar için Dr. Jacopo Tessadori teşekkür etmek istiyorum, ve video kullanılan grafik üretiminde ona yardım için Silvia Chiappalone olur.

Prosedür laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH standartlarına uygun olarak yapıldığını ve Tel-Aviv Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (izin numarası - L-14-019) tarafından onaylandı. Araçların ve PDMS 1. Hazırlık <ol><li> Gofret hazırlayın (Malzeme Tablo, ya da bir mikroimalat laboratuarından gofret sipariş), bir neşter ve bir cımbız - sterilizasyon gerekli değildir. </li><li> Aşağıdaki koşullara göre poli-D-lisin (PDL) çözeltisi oluşturunuz: 4 mg / 0.1 M borat tamponu içinde mi, pH 8, ve mağaza -20 ° C&#39;de ilave edildi. </li><li> Aşağıdaki prosedüre göre PDMS kalıpları Hazırlama: <ol><li> Taban ve 10 bir oranı ile sertleştirme ajanı karıştırılarak bir polidimetilsiloksan (PDMS, silikon elastomer) hazırlanması: 1, daha sonra yaklaşık 5 dakika boyunca 2 maddeler karıştırılmıştır. </li><li> 15 dakika boyunca iki kez vakum odasında her zaman yerleştirin ve doğrulamak kabarcıklar gitti. </li><li> Ne ZamanGaz kullanımını sağlamak için açık azot düğmeleri döndürücü silikon gofret (Şekil 1A) yerleştirin ve hareket etmesini engellemek için vakum kullanın: PDMS Spin kaplayıcı hazırlamak, hazır. </li><li> Gofret üzerinde PDMS dökün ve 1.000 rpm&#39;de 1 dakika eğiren aktive (yaklaşık 100 mikron yükseklik oluşturur). </li><li> 30 dakika boyunca 100 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin. </li><li> PDMS sertleştikten sonra, Pasteur pipeti kullanarak, PDMS ile şablon sınırları özetlemektedir. 30 dakika boyunca 100 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin. </li><li> PDMS sınırları sertleşmiş zaman, sınırları göre şablonlar kesmek ve gofret silikon şablon kalkmasına bir neşter kullanabilirsiniz (tek desen içeren bir kare PDMS). </li></ol></li></ol> 2. Petri Dish ve Kapak Kayma Hazırlık <ol><li> Aşağıdaki sıraya göre 23 mm kare cam kapak fişleri hazırlayın ve bunları temizleyin: <ol><li> Damıtılmış su,% 70 etanol ve aseton ile yıkanır. </li><html><li> Azot ile izopropanol ve hızlı kuru ile yıkayın. </li></ol></li><li> Lamel desenli PDMS şablonlar yerleştirin ve yavaşça onlar sıkıca cam yüzeye bağlı olduğunu doğrulamak için düğmesine basın. 15 dakika boyunca vakum odasına koyun. </li><li> Şablonun üzerine PDL 1 ml bırakın. Iki kez 20 dakika her zaman için vakum odasına lamel yerleştirin ve kurumaya PDL O / N bırakın. </li><li> Bir destekleyici hücre ağı oluşturmak için Petri kabı hazırlayın: <ol><li> RT, 2 saat boyunca PDL 1 ml çanak (3.5 cm) yüzeyini kaplar. Bir pipet kullanarak PDL damla çıkarın. </li><li> Damıtılmış suyla yıkayın ve kurumaya bırakın. Lamel her köşesinde silikon gres çok küçük bir damla yerleştirin. </li></ol></li><li> Eki doğrulamak için yavaşça Petri kabındaki (yani, PDMS yukarı dönük olmalıdır) ve basın merkezine lamel yerleştirin. </li><li> Yavaşça cımbız kullanarak lamel PDMS çıkarın. Sterilizasyon için, 7 dakika UV aydınlatma maruz. </li></ol>le &quot;&gt; 3. Çok Elektrod Dizisi (MEA) Hazırlık <ol><li> Bu düzenin (Malzeme Tablo) Temiz MEA: <ol><li> Konsantre, enzimatik deterjan içinde musluk ve sonikasyon altında su ile 3 kez yıkanır. </li><li> Distile su 3 kez sonikasyon. </li><li> 30 dakika UV altında distile 3 kez (kaput, 1.000 ul ucu), su ve yer ile yıkayın. </li></ol></li><li> Ağ hazırlanmasını desteklemek: <ol><li> Tasarlanmış destek ağı kalıp hazırlayın. <ol><li> 12 gözlü bir levha (22 mm çapında) içine PDMS dökün. </li><li> PDMS kalıp çıkarmak ve bir neşter kullanılarak sertleştirilmiş zaman, bir halka şekli oluşturmak için ortasında bir delik kesti. </li><li> MEA (Şekil 2A) ortasına tasarlanmış bir destek ağı kalıp yerleştirilir ve oda sıcaklığında 2 saat süre ile PDL yüzeyde geri kalan kapak. </li></ol></li><li> Pipet kullanılarak PDL çıkarın ve damıtılmış su ile yıkayın. </li><li> Kalıp çıkarmak ve (Şekil 2A) kurumaya bırakın. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Şu şekilde MEA için şablonu hizalayın: <ol><li> Belirlenen mikro manipülatör üzerine şablonu yerleştirin. Doğru elektrotlara desenli yapısı hizalamak, ve MEA yüzeyine (Şekil 2B) üzerine yerleştirilir kadar şablonu düşürmek için bir ters mikroskop kullanın. Not: Bir de temizlenmiş MEA ile irtibat PDMS ve MEA kendisi arasında rekabet yapışma sağlar. </li><li> Mikromanipülatör kaldırın ve gerekirse, bu MEA ayrılmakta önlemek için PDMS üzerindeki basıncın az miktarda uygulamak için cımbız kullanın. </li><li> Yavaşça MEA yüzeyine şablonu basın ve sıkıca bağlanmış ve iyi hizalanmış doğrulamak için mikroskop kullanın. (Şekil 2C-D). </li></ol></li><li> 15 dakika boyunca vakum odasında MEA yerleştirin; şablonun üzerine PDL 1 ml damla koydu. </li><li> 20 dakika her vakum odasına 2 kez yerleştirin. Inkübatör O / N kurumaya bırakın PDL. </li><li> Kaplama öncesi, ÇÇA PDMS şablonlar kaldırmak ve w steril kullanarak yıkayınater. 7 dakika boyunca UV ışıması altında yerleştirin. </li></ol> 4. Diseksiyon ve Kültür <ol><li> Herzog ve ark. 2011 21 de tarif edildiği gibi kültür hazırlayın. </li></ol> 5. Kaplama <ol><li> Hemasitometre (sonuç olarak tartışıldığı gibi devrenin büyüklüğüne göre uygun yoğunluğu) kullanılarak, kaplama için gerekli olan hücre sayısını hesaplayın. <ol><li> Emin sayma odası (hemasitometre) Marka temiz ve bunun üzerine bir kapak kayma (temizlemek için kullanılması alkol) yerleştirin. </li><li> Orta (seyreltme 1:20) kaplama 190 ul hücre süspansiyonu, 10 ul seyreltin. </li><li> Yük 10 sayma odasının kenarına seyreltilmiş hücre ul ve yavaş yavaş kendini doldurmak için odasına izin hücreleri pipetle. </li><li> Bir ters mikroskop kullanarak, hemositometre ızgara görselleştirmek. Direkt sayım ile bölme içindeki hücrelerin sayısı (sağlıklı hücreleri yuvarlak olmalı) belirler. Büyük kare witho içinde hücreleri saymakkenarları kapısı olan ut. </li><li> Hücre konsantrasyonu hesaplanır: Hücre sayısı / 1000 ul = seyreltme faktörü × 10 4 (hemasitometre alanı) sayılır Toplam hücreler. Not: Örneğin, eğer seyreltme faktörü 20 ve sayılan toplam hücre 100 idi: 100 × 20 × 10 4 = 0.1 x 10 7 hücre / 1.000 ul veya 1 x 10 6/100 ul. 0.75 x 10 6 hücre plaka için, hücrelerin üzerinden 75 ul alır. </li></ol></li><li> Tek MEA ya da Petri kabı başına kaplama için gerekli hücrelerin sayısını alın toplanmasını önlemek için hücrelerin tekrar süspansiyon ve patternate alanının üstünde, merkezde bunları plaka (gerekirse, bu ortamda hücreleri sulandırmak için mümkün) . MEA için, ortasında bir 100 ul damla yerleştirin. Kapak kayma için, ortada bir 1.000 ul damla yerleştirin. </li><li> 40 dakika boyunca 37 ° C&#39;de kaplama hücreleri inkübe edin. 1 kadar, kaplama hücrelere kaplama orta ekleMEA başına ml kapak kayma başına 2 ml. </li><li> 0.5 Pen-Strep,% 2 B-27 ve% 0.75 glutamax zenginleştirilmiş taze büyüme ortamı ile inceltilmiş, her 4 günde bir, 37 ° C&#39;de tutun. </li><li> Veya glial önlemek için herhangi bir diğer anti-mitotik ajan 6/7 DIV itibaren, adalar arasındaki bağlantıları gördükten sonra, 10 ul orta sulandırmak / ml FUDR (12.5 ml MEM (Minimum Essential Medium Kartal) 25 mg dezoksiuridin + 62.5 mg üridin) büyümesi. </li></ol>

<ol>
	<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+syntax:+cell+assemblies,+synapsembles,+and+readers.">Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers.</a> Neuron. 68, 362-385 (2010).</li><li>Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+and+hierarchically+modular+organization+of+brain+networks.">Modular and hierarchically modular organization of brain networks.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).</li><li>Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neural+representation+capacity+by+modular+architecture+in+networks+of+cortical+neurons.">Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons.</a> European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).</li><li>Berdondini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microelectrode+array+(MEA)+integrated+with+clustering+structures+for+investigating+in+vitro+neurodynamics+in+confined+interconnected+sub-populations+of+neurons.">A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).</li><li>Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+bursting+activity+in+connected+neuronal+sub-populations.">Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations.</a> PloS One. 9, e107400 (2014).</li><li>Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+synchronous+oscillations+in+freely-organized+small+neuronal+circuits.">Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits.</a> PloS One. 5, e14443 (2010).</li><li>Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+neuronal+circuits:+a+new+platform+for+studying+the+role+of+modular+topology.">Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology.</a> Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).</li><li>Bonifazi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+large-scale+experimental+and+theoretical+studies+for+the+realization+of+bi-directional+brain-prostheses.">In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses.</a> Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).</li><li>Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triangular+neuronal+networks+on+microelectrode+arrays:+an+approach+to+improve+the+properties+of+low-density+networks+for+extracellular+recording.">Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).</li><li>Marconi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+functional+properties+of+neuronal+networks+with+controlled+topology.">Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology.</a> PloS One. 7, e34648 (2012).</li><li>Taylor, A. M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+compartmentalized+platforms+for+neurobiological+research.">Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).</li><li>Sorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact+self-wiring+in+cultured+neural+networks.">Compact self-wiring in cultured neural networks.</a> J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+properties+for+biomedical+micro/nanosystems.">Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems.</a> Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).</li><li>Campo, A. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8:+a+photoresist+for+high-aspect-ratio+and+3D+submicron+lithography.">SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography.</a> Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).</li><li>Liu, G. T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kan+Y+Fabrication+of+high-aspect-ratio+microstructures+using+SU8+photoresist.">Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist.</a> Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).</li><li>Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+elastomeric+membranes+as+dry+resists+and+for+dry+lift-off.">Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off.</a> Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).</li><li>Pine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+action+potentials+from+cultured+neurons+with+extracellular+microcircuit+electrodes.">Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).</li><li>Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Fixed-Array+Multi-Microelectrode+System+Designed+for+Long-Term+Monitoring+of+Extracellular+Single+Unit+Neuronal-Activity+In+vitro.">New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro.</a> Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).</li><li>Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+of+spontaneous+activity+with+photoetched+microelectrode+surfaces+from+mouse+spinal+neurons+in+culture.">Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).</li><li>Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniature+microelectrode+array+to+monitor+the+bioelectric+activity+of+cultured+cells.">A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells.</a> Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).</li><li>Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+validation+of+in+vitro+extra-cellular+neuronal+recordings.">Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings.</a> J Neural Eng. 8, 056008 (2011).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).</li><li>Dworak, B. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+MEA+platform+with+PDMS+microtunnels+enables+the+detection+of+action+potential+propagation+from+isolated+axons+in+culture.">Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture.</a> Lab Chip. 9, 404-410 (2009).</li><li>Georger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coplanar+Patterns+of+Self-Assembled+Monolayers+for+Selective+Cell-Adhesion+and+Outgrowth.">Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth.</a> Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).</li><li>Torimitsu, K., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Growth+of+Sensory+Nerve-Fibers+on+Metal-Oxide+Pattern+in+Culture.">Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture.</a> Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).</li><li>Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstamp+patterns+of+biomolecules+for+high-resolution+neuronal+networks.">Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 36, 135-141 (1998).</li><li>Petrelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+drop+patterning+for+rapid+on-chip+neuronal+connect-ability+assays.">Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays.</a> Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).</li><li>Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+networks+on+reliable+patterned+substrates.">Hippocampal networks on reliable patterned substrates.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Fonksiyonel inter-connected devrelerden oluşan in vitro 2D modüler nöron ağları büyümeye bir protokol tarif edilmektedir. işlem, bir hücresel yapışkan tabaka desenlendirme dayanmaktadır. Desenlendirme PDMS şablonlar istenen ağ mimarisinin olumsuz özelliği üreyen ile elde edilir. PDMS şablonlar hücresel yapışkan tabaka yatırılır alanları tanımlar. Hücreler kaplama sonra, kendiliğinden kaplanmış adalar montaj ve aktif inter-connected devreler halinde kendini organize. Anlaşmalardan ...

Deneysel ve teorik kanıtlar beyin geçici birbirlerine, şekillendirme ve altta yatan farklı beyin devletlerin etkileşim, dinamik, fonksiyonel birimler olarak kabul edilebilir hücre meclisleri 1-5 koordine aktivasyonu aracılığıyla faaliyet ihtimalini desteklemektedir. Fonksiyonel modülerlik de bağlıdır ve beyin devrelerinin 6,7 yapısal modüler organizasyonu ile ilişkilidir. Nasıl fonksiyonu ve beyin devrelerinin yapısı birbirini şekil hala nörobilim ana açık sorulardan biridir. Bu sorunun daha derin bir anlayış sağlamak için, o ele mümkün olduğu, en azından kısmen, bu sorunları en iyi deneysel çerçeveler belirlenmesi önemlidir. In vivo deneylerde nöronal ağların uzay-zamansal dinamikleri manipülasyon kontrollü yana in vitro nöronal ağlar modellerinin geliştirilmesi nedeniyle kolay acc önemli ilgi olduğunu, zorluessibility, izleme, manipülasyon ve 8,9 modelleme. Son yıllarda, gelişmiş alt tabaka desenlendirme yöntemleri ile desteklenen in vitro teknolojileri önceden tanımlanmış modüler yapılar 3 bir dizi geliştirmek ve dayatılan topolojilere 10 ile ağların fonksiyonel özelliklerini incelemek için nöron ağları teşvik sağladı. Özellikle, son zamanlarda yöntemler fiziksel kısıtlamaları 4,11 empoze ederek ağları düzenlemek için kullanıldı. Nitekim, nöronal ağlarda yapı ve fonksiyon arasındaki bağlantıyı incelemek ve nöronal meclisleri etkileşim basitleştirilmiş ama inandırıcı temsilini sağlamak üzere, in vitro sistemler birbirine bağlı nöronal alt-popülasyonların sağlamalıdır. Yaygın okudu 2D homojen nöronal kültürlerin devrelerin kendi kendine organize acil kablo üzerinde herhangi bir mekansal kısıtlamalar getirmez. Bu nedenle olası bir yaklaşım tükürdü farklı nöronal popülasyonlarının konumlandırmak için yapay birbirine hücre derlemeleri bir şekleially farklı alanlar. Bu alanlar arasında mesafe arası meclisleri bağlantıları engellemez. Ağ karmaşıklığını önemli bir kontrol sağlarken bu yaklaşım, senkronizasyon model 6,7,12 daha zengin bir repertuar temin etmek üzere gösterilmiştir. Modüler nöronal düzeneklerinin tekrarlanabilir bir kültürlenmesini kolaylaştırmak için bir protokol verilmektedir ve açıklanan akson ve dendritlerin ile bağlantılı nöronal kümeler halinde ağların kendi kendine organizasyonu monte etmek. nöronal kültürler fiziksel hapsi için bir polimerik yapı polydimtheylsiloxane (PDMS) için oluşturuldu. PDMS yaygın gazların 13 olan biyouyumluluk, şeffaflık ve geçirgenlik nedeniyle biyomedikal uygulamalarda kullanılan bir elastomer. PDMS spin kaplama Jackman ve arkadaşları, daha önce tarif edildiği gibi, bir &quot;ana&quot; üzerine bir sıvı PDMS. 16 T 2075 14,15 yapı hazırlanmış ve Mikroişlenmiş SU8 hariç tutulmuşturO farklı boyuttaki birbirine bağlı modüllerden oluşmaktadır nöron ağları desenli başararak ve başarılı hem lamelleri ve Mikro Elektrot Diziler (ÇÇA&#39;lar) 17-20 elde edilmiştir. modüller arasındaki bağlantıların yoğunluğu modülleri arasında senkronizasyon geçici devletlere, üniforma kültürlerin tipik bir tam senkronize ağdan, ağ senkronizasyon özelliklerini değiştirebilirsiniz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PDMS, Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Vacuum Chamber</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>5305-0609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine PDL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell - Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well culture plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8217;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA1060-Inv-BC</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC02</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>03-033-1c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Minimum Essential Medium-Eagle</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>01-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Electrode Arrays 4Q</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td>60-4QMEA1000iR-Ti-pr</td>
			<td>cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon wafer</td>
			<td>microchem</td>
			<td>SU8-2075</td>
			<td>Preparation protocol: www.microchem.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design, surface treatment, cellular plating, and culturing of modular neuronal networks composed of functionally inter-connected circuits

Beyin koordineli aktivasyonu ve nöronal meclisleri dinamik iletişim yoluyla çalışır. Büyük bir açık bir soru en farklı beyin fonksiyonları altında yatan dinamik motifler geniş bir repertuar, beyin devrelerinin sabit topolojik ve modüler organizasyon dışında ortaya nasıl olduğunu. Içsel deneysel zorluklar sunuyoruz nöronal devrelerin in vivo çalışmalar ile karşılaştırıldığında, in vitro hazırlıkları işlemek ve deneysel nöronal sistem, yapısal dinamik ve kimyasal özelliklerini araştırmak için çok daha büyük bir imkanı sunuyoruz. Bu eser uzamsal farklı, işlevsel birbirine nöronal meclisleri tarafından oluşan modüler ağların büyüyen sağlar bir in vitro deneysel yöntem anlatılmaktadır. protokol topolojik farklı karmaşıklık düzeylerinde nöronal ağ iki boyutlu (2D) mimarisini kontrol sağlar. İstenilen ağ desenlendirme olabilirDüzenli kapak fişleri ve yüzey gömülü mikro elektrod dizileri hem elde etti. Mikroişlenmiş yapılar silikon gofret üzerinde kabartmalı ve istenen ağ mimarisinin özelliklerini olumsuz dahil biyouyumlu polimerik şablonlar oluşturmak için kullanılır. şablonlar hücresel yapışma teşvik etmek için bir molekül tabakası ile yüzey kaplama işlemi sırasında kültür substratlar üzerine yerleştirilir. Kalıpların çıkarılmasından sonra nöronlar plakalanır ve kendiliğinden kaplanmış bölgelere yönlendirilir. Ara bölmesi mesafeye bağlı olarak, bu izole edilmiş ya da birbirine bağlı ya da nöronal devreler elde etmek mümkündür. Hücre yaşamını destekleyen için, hücreler kültür kaplarına çevresine yerleştirilmiş olan bir destek nöronal ağ ile birlikte kültürlenmiştir. Yüzey gömülü mikro elektrot dizileri ve kalsiyum görüntüleme kullanarak sırasıyla elde edilen modüler ağların faaliyet Elektrofizyolojik ve optik kayıtlar sunulmaktadır. Her bir modül bir SPONT gösterirkenaneous küresel eşitleme arası modülü senkronizasyon oluşumu devreleri arasındaki bağlantı yoğunluğu ile düzenlenir.

Yaklaşık 100 um bir özelliği kalınlığı olan bir silikon gofret üzerinde bir SU8-2075 kalıp PDMS şekillendirmek için kullanılmıştır. desen yan uzunluk ve mesafe 200 ila 700 um (Şekil 1B) değişen, birkaç boyutta karelerinin oluşmaktadır. meydanın büyüklüğü ve 20X objektif (yan uzunluğu &lt;400 mikron olan adalar için) (bir kenar uzunluğu &lt;800 mikron olan adalar için) 10X görüş alanını uyacak şekilde seçildi. Üç parametre, devre arasında yani hücre kaplama yoğ...

Watch this Scientific Journal Video about Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits at JoVE.com

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

Bu yazıda mekansal sınırlandırılmış işlevsel birbirine bağlı nöronal devrelerin oluşturduğu nitro modüler ağlarda büyümek için bir protokol açıklamaktadır. Bir polimerik maske kültürleme alt-tabaka üzerine hücresel yapışmayı teşvik etmek için model bir protein tabakası kullanılır. Kaplama nöronlar kaplı alanlarda kendiliğinden bağlantılarının kurulması ve elektrofizyolojik aktivite sergileyen üzerinde büyür.

Tasarım, Tedavi, Hücresel Kaplama ve Fonksiyonel Inter-bağlantılı Devreler oluşan Modüler Nöronal Ağları Kültüre Yüzey

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

design-surface-treatment-cellular-plating-culturing-modular-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K Görüntüleme.  Tel-Aviv University.  Bu yazıda mekansal sınırlandırılmış işlevsel birbirine bağlı nöronal devrelerin oluşturduğu nitro modüler ağlarda büyümek için bir protokol açıklamaktadır. Bir polimerik maske kültürleme alt-tabaka üzerine hücresel yapışmayı teşvik etmek için model bir protein tabakası kullanılır. Kaplama nöronlar kaplı alanlarda kendiliğinden bağlantılarının kurulması ve elektrofizyolojik aktivite sergileyen üzerinde b?...

Video: Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

Lazer Tarama Photostimulation tarafından inhibitör nöronal devreler Haritalama

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Nörobilim

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Hayvanlar davranmak, Awake Tek-birim Recordings Microwires Organize Dizileri implantasyon için Usulü

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

Kapalı döngü Nöro-robotik Deneyler Nöronal Ağları Hesaplamalı Properties Test

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Kronik Transkraniyal elektriksel stimülasyon ve Sıçanlarda Intracortical kayıt

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...